사후 인간의 두뇌 기증자로부터 Leptomeninges 이식편 문화의 유도

요약

인간의 사후 뇌에서 leptomeninges 이식편 문화 프로토콜 6-8 주 이내에 피브로넥틴 양성 수막 섬유 아세포를 유도 약 20-30000000 세포를 cryopreserve하기 위해 기술적으로 강력하고 간단한 방법입니다.

초록

큰 진전 파킨슨 병의 임상 적 특성에 만들어졌다하더라도, 몇몇 연구는 파킨슨 병의 병리학 적 진단이 임상 진단 파킨슨 병의 최대 25 %에서 확인되지 않은 것을보고한다. 따라서, 티슈는 오진의 높은 속도를 가질 수 특발성 파킨슨 병 환자의 임상 진단에서 수집; 전임상 모델이 쓸데 될 수 따라서 같은 조직에서 시험관 연구에서 파킨슨 병을 연구한다.

파킨슨 병의 확인 신경 병리학 적 진단 사후 인간의 leptomeninges를 수집하고 흑질 선조체 세포 손실과 루이 기관이라는 세포 내 단백질 흠을 특징으로 한 임상 관찰 파킨슨 다른 기저 질환 과정 (예를 들어 종양, 동맥 경화)에 의해 발생한 것이 아닌지 확신 할 수 있습니다.

이 프로토콜 presen해부 및 수막 섬유 아세포 문화의 유도에 대한 사후 인간의 leptomeninges의 준비 TS. 이 절차는 견고하고 높은 성공률을 갖는다. 뇌 조달은 일반적으로 무균 조건 하에서 수행되지 않는 문화의 문제는 불임이다. 따라서, 페니실린, 스트렙토 마이신 및 암포 테리 신 B의 칵테일 배양 배지를 보충하는 것이 중요

파킨슨 병 부검 확인 된 경우에서 수막 섬유 아 세포의 유도는 파킨슨 병의 체외 모델링을위한 기반을 제공합니다. 수막 섬유 아세포는 3~9일 샘플 준비 후 나타나는 약 20-30000000 세포 6-8 주 만에 동결 보존 할 수 있습니다. 수막 섬유 아세포 배양 균질하고 세포 피브로넥틴, 수막을 식별하기 위해 일반적으로 사용되는 마커를 표현한다.

서문

뇌경막, 지주막과 피아 이잖아요 : 수막은 뇌를 보호하는 세 개의 막으로 구성되어 있습니다. 최근에, 또한 수막 뇌 발달 ^한 뇌 항상성에 중요한 역할을한다는 것을 인식하고있다. 수막은 중간 엽 및 신경 능선 유래 세포로부터 유래하고 흥미로운 시험 관내 및 생체 내 ^{2, 3, 4에서의} 이식 후 뉴런을 야기 할 수있는 수막에 존재하는 전구 세포를 보였다. 들은 도파민 뉴런 ^(5)에 배아 줄기 세포의 분화를 위해 간질 세포 유래 유도부 활성을 갖는 수막으로 배양 성공적, 급전 층으로서 사용되어왔다. 또한 leptomeninges 직접 허혈성 조건 하에서 ⁶ 뉴런, 아스트로 사이트, 올리고 덴드로 사이트와로 분화 할 수있는 잠재력을 가지고있다.

이 프로토콜의 경우, 인간의 사후 수막 샘플을 총칭하여 지주막과 피아 이잖아요에서 수집 leptomeninges라고, 연구 목적으로 인간의 두뇌 기부의 일환으로 조달된다. 뇌의 해부 죽음의 24 시간 내에서 수행되며,이 프로토콜 여기에 도시 된 바와 같이 leptomeninges 샘플은 다음 6-8 시간 내에서 추가 처리를 위해 저온 성장 배지에 배치된다.

이 프로토콜은 환자의 기본 leptomeninges 세포 배양의 개발에 대한 해부와 인간의 수막 샘플의 준비에 대해 설명합니다. 조직은 약 3mm X 3mm 사각형의 25 ~ 30 조각으로 절단됩니다. 세 가지 각 6 웰에 배치됩니다 젤라틴 코팅 잘 라운드 커버 글라스로 누르고. 뇌막 해부은 약 25 ~ 35 분 소요됩니다. 이 문화의 주요 과제는 뇌 조달, 운송 및 박리 등의 불임은 일반적으로 무균 조건 하에서 수행하지 않는 것입니다. 티herefore, 페니실린, 스트렙토 마이신 및 암포 테리 신 B의 칵테일 배양 배지를 보충하고 별도로 배양 조직 조각을 멀티 웰 접시를 사용하는 것이 중요하다.

수막 섬유 아세포의 부산물은 일반적으로 첫 주 내에서 발생합니다. 세포가 합류 할 때까지 미디어 매 2 ~ 3 일 변화 및 세포 효소 적으로 계대된다. 수막 섬유 아 세포는 냉동 보존 매체에 ㎖ / 바이알 당 100 만 세포의 냉동 보관한다. 이 프로토콜로, 20-30000000 수막 섬유 아 세포는 냉동 보존에 대한 6-8주에서 유도 될 수있다. 이러한 수막 섬유 아세포의 다운 스트림 응용 프로그램은 질병 연구, 직접 신경 세포 분화 또는 질병 메커니즘의 이해 및 약물 개발을위한 leptomeninges에서 유도 만능 줄기 세포의 유도를위한 차 문화입니다.

프로토콜

뇌 기증 등록을 기부하는 그들의 의도 등록자에 의한 설명서가 포함되어 있습니다. 법이 허용 조직 검색에 대한 부검 권한은 친척의 다음에 의해 제공됩니다. 수집 부검 표본을 사용하여 연구 연구는 건강 보험 양도 및 책임에 관한 법률 (HIPAA) 규정을 준수하기 위해 제도적 검토위원회 (IRB)에 의해 검토된다.

참고 : Leptomeninges 샘플은 뇌 해부 동안 뇌 해부학자 또는 신경 병리학에 의해 수집되고, 25 ~ 30 ML의 수막 성장 미디어를 포함하는 50 ML 원뿔 튜브에 저장됩니다. 샘플은 샘플 준비 될 때까지 4 ℃에서 저장된다. 세포의 생존 시간의 사후 감소로 처리가 가능한 한 빨리 수행되어야한다.

1 세트 업 Leptomeninges 해부를 시작하기 전에

참고 : - 1.3 바이오 안전성 캐비닛 내부에서 수행 할 수 있습니다 1.1 단계를 반복합니다.

1. 375 mL의 둘 베코 변형 이글 매체를 조합하여 수막 성장 배지를 준비 태아 소 혈청 100 ㎖, 5 ㎖의 10 mM 비 필수 아미노산, 5 ㎖의 200 mM의 L- 알라 닐 -L- 글루타민, 5 ㎖의 100 mM의 피루브산 나트륨 5 ㎖ 10,000 U / ㎖ 페니실린 / 스트렙토 마이신 및 250 μg의 5 ㎖ / ㎖의 암포 테리 신 B, 500㎖ 필터 유닛이다. 필터와 혼합한다. 최대 4 주 동안 용지를 사용하십시오.
2. 해부를 시작하기 전에 바이오 안전성 캐비닛에있는 모든 재료를 넣 배 배양 접시, 배 6 웰 플레이트, 배 메스, 15 ~ 20 멸균 15 mm 커버 전표, 피펫을 흡입 인산염 완충 생리 식염수 (PBS), 혈청 학적 피펫.
3. 6 웰 플레이트의 각 웰에 멸균 멸균 0.1 % 젤라틴 용액 1 ㎖를 추가한다. 30 ~ 60 분 동안 따로 접시를 설정합니다. 배 6 웰 플레이트를 준비합니다.

Leptomeninges 샘플 2. 준비

참고 : - 2.3 바이오 안전성 캐비닛 내부에서 수행 할 수 있습니다 2.1 단계를 반복합니다.

1. 에 PBS의 약 10 mL를 넣고멸균 10 cm 조직 배양 접시는 접시에 수막 샘플을 배치합니다. 포셉 사용하여 부드럽게 혈액을 제거하기 위해 PBS와 leptomeninges을 씻는다.
2. 신선한 PBS의 10 ㎖를 포함하는 새로운 10 cm 조직 배양 접시에 수막을 전송하고 세척을 계속합니다. 가능한 한 많은 혈액을 제거 할 필요 반복합니다.
3. 약 6cm X 6cm 큰 조각으로 조직 leptomeninges 절단이 메스를 사용.
4. 수평 층류 후드의 해부 현미경으로 배양 접시 및 전송에 놓고 덮개.

Leptomeninges 조직 3. 해부

주 - 3.3 해부 현미경을 사용하여 수평 층류 후드 내부에서 수행되어야 3.1 단계.

1. 적어도 20 ~ 25 3mm X 3mm 조각을 생성 할 수있을만큼 leptomeninges 조각 (단계 2.3)에 영역에서 혈관을 제거합니다. 한 메스과 장소에 leptomeninges을 잡고 다른과, 부드러운 얕은 긁어 모 사용기는 혈관을 분리합니다.
2. 준비된 지역에서 조직의 작은 사각형을 잘라. 첫 번째 큰 조각을 한 다음 작은 섹션으로 사람들을 슬라이스하여 단계적 과정에서 잘라.
3. 요동과 조직을 절단하는 대신에 조직과 다른 메스를 개최 한 메스를 사용합니다. 조직의 일관성으로 인해, 서로에 대해 메스 슬라이드하는 것이 곤란하다. 이것은 따로 조직을 찢어 및 비정형 가장자리에 발생합니다.
4. 20 ~ 25 3mm X 3mm 조각이 될 때까지 반 조각을 절단 계속합니다.

조직 배양 플레이트 상에 해부 수막 조각 4. 전송

주의 : 단계 4는 바이오 캐비닛 내부에 수행되어야한다.

1. 6 웰 플레이트에서 (단계 1.3에서) 대기음 젤라틴. 각 웰에 수막 성장 미디어의 1 ML을 추가합니다. 멸균 집게를 사용하여 각 웰에 3-4 생검 조각을 배치합니다.

M을 통해 커버 전표 5. 배치eninges 조각

주 - 5.2 해부 현미경을 사용하여 수평 층류 후드 내부에서 수행되어야 5.1 단계.

1. 물론 당 1-2 멸균 15 mm 원형 된 커버와 조각을 커버.
2. 조각이 판의 하단을 터치되도록 집게로 단단히 누르십시오. 이 웰의 바닥에 조직 조각을 부착 할 수있다.
3. 37 ° C, 5 % CO ₂ 배양기로 6 웰 플레이트를 놓습니다.

6. 세포 배양 유지 보수

참고 : - 6.3 바이오 안전성 캐비닛 내부에서 수행 할 수 있습니다 6.1 단계를 반복합니다. 커버 슬립이 이동하고 수막 조각을 제거하지 말아야으로 치료와 배양 접시를 처리합니다.

1. 문화 2 일 후, 각 웰에 신선한 수막 성장 미디어의 추가 1 mL를 넣어.
2. 7 일에, 신중하게 미디어를 대기음하고 각 웰에 신선한 미디어의 2 mL를 넣고.
3. 9 일 후, 성장 배지를 매일 계속 변화문화까지 다른 일 합류하게된다.

(7)과 Passaging

참고 : 모든 단계는 바이오 안전성 캐비닛 내부에서 수행 할 수 있습니다. 수막 아세포는 수막 조직편에서 마이그레이션 큰 배양 접시에 수막 섬유 아세포를 배양 용기의 가장자리를 향해 성장 확장 시작되면.

1. 15 ~ 30 분 동안 1 % 젤라틴과 계대 코트 배양 접시를 시작하기 전에.
2. 대기음 6 잘 접시에서 미디어 및 2 mL의 PBS로 세척 세포.
3. 각 웰에 트립신 / EDTA의 1 mL를 넣고 5 ~ 10 분 동안 37 ° C에서 품어. 또한, 커버 슬립 또는이 단계의 수막 조직을 제거 할 필요가 없다.
4. 셀은 원형이며, 분리 배지 2 mL를 첨가하기 시작하면.
5. 피펫 세포까지 완전히 모든 대단히 짧은 시간을 방해 큰 배양 접시에 세포 솔루션을 전송하려면 아래로.
6. 1 내지 3 : 1의 비율을 사용하여 4 세 6 웰 접시에서 세포를 결합 할한 T75의 배양 접시에.
7. 수막 섬유 아세포 세포를 T75 배양 플라스크에서 컨 플루 언트되면, 세포를 Trypsinize, 1 × ¹⁰⁶ 세포 / mL의 바이알에서 동결 배지에서 cryopreserve. 합류 수막 섬유 아세포와 함께 한 T75 문화 플라스크에 대한 5-7000000 세포가 포함되어 있습니다.

면역 염색에 의한 수막 섬유 아세포의 8 특성

주 : 절차를 시작하기 전에, PBS (블로킹 완충액)에서 4 % 파라 포름 알데히드 용액을, 5 % 정상 염소 혈청을 제조 0.3 % 트리톤 X-100의 PBS (permeabilization 버퍼), 일차 및 이차 항체 용액, 및 1 μg의 중 / ㎖의 훽스트 33342 10 ㎎ / ㎖의 재고에서 PBS에 희석.

1. 8 잘 챔버 슬라이드 씨 15,000 30,000 수막 섬유 아세포는 0.1 % 젤라틴으로 코팅.
2. 세포가 부착 된 경우 24 시간 후, 실온에서 10 분 동안 웰 당 100 μL 4 % 파라 포름 알데히드로 세포를 고정한다. 1X PBS로 우물 3 회 반복한다.
3. 실온에서 5 분 동안 0.3 % 트리톤 X-100 150 μL와 세포 Permeabilize 하시려면. 1X PBS로 우물 3 회 반복한다.
4. 실온에서 1 시간 동안 차단 용액 200 μL (PBS + 5 % 정상 염소 혈청)을 추가한다.
5. 차단 솔루션을 기음과 솔루션을 차단에 희석 원하는 차 항체의 150 μL를 추가합니다. 이중 염색의 경우, 다음과 같이 얼음에 별도의 원심 분리기 튜브의 일차 항체의 작업 희석을 준비 :
   1. 안티 피브로넥틴 + 1 (300) 희석 : 솔루션을 차단하는 안티 네 스틴의 200 희석 (1)을 준비합니다. 안티 SERPINH1 + 1 (250) 희석 : 솔루션을 차단하는 안티 TUJ1 1000 희석 1을 준비합니다. (1) 준비 : 안티 - SERPINH1 250 희석 + 1 : 솔루션을 차단하는 안티 SOX2 100 희석
6. 밤새 4 ° C에서 품어.
7. 1X PBS로 우물 3 회 반복한다.
8. 작업 한 준비 : 이차 항체는 항 - 토끼를 염소 라벨 형광 400 희석 (녹색, 예 / 엠 ² 519분의 495 ㎚)과 염소 항 - 마우스 (빨강, 예 / 엠 ² 617분의 590 ㎚) 차단 솔루션과 각 웰에 100 μL를 추가합니다. 실온에서 어두운 곳에서 1 시간 동안 배양. 그런 다음 1X PBS로 한번 우물을 씻는다.
9. 각 솔루션은 물론 3 분 동안 어둠 속에서 부화 / mL의 훽스트 1 μg의 100 μL를 33342 (예 / 엠 ² 461분의 358 nm의 청색)를 추가합니다. 웰의 최종 1X PBS 세척에두고 1X PBS로 웰을 3 회 세척하고, 알루미늄 호일로 슬라이드 커버.
10. 형광 현미경으로 세포를 분석 할 수 있습니다.

결과

leptomeninges 처리 프로토콜이 성공하면이 뇌에 대한 사후 간격의 길이에 따라 달라질 수 있지만, 수막 섬유 아 세포의 생장는 3 구 일 절제술 후 관찰 처음이다. 그림 1은 네 개의 다른 기증자의 수막 섬유 아세포 문화를 보여줍니다. 도 1a는 10 시간 20 분 사후 간격으로 88 세 기증자에서 처리 후 조직 사일 주위에 유리 커버 슬립 (어두운 대각선)와 섬?...

토론

이 프로토콜은 뇌 기증과 관련하여 수집 된 인간 사후의 leptomeninges에서 수막 섬유 아세포 문화를 유도하는 간단하고 강력한 프로토콜을 설명합니다. 사후 인간의 물질로 세포 배양을 유도하는 프로토콜의 거의 설명이 있습니다. 두 연구는 피부 유래 섬유 아세포를 배양 ^{7, 8, 9,} 한 연구는 경질 샘플 ^(10)을 설?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Corning Petri dishes	Fisher Scientific	351029
Nunc 6-well plate	Fisher Scientific	14-832-11
15-mm cover slips	Fisher Scientific	12-545-83 15CIR-1D
Scalpels, sterile blade, No. 15	Miltex	4-415
Curved precision tip forceps	Fisher Scientific	16-100-122
Serological pipettes	Fisher Scientific	13-678-11E
Pasteur pipettes	Fisher Scientific	22-230490
Gelatin	Sigma	G1890-100G
Phosphate Buffer Saline	Fisher Scientific	SH30264.02
Corning 500 mL filter unit	Fisher Scientific	430770	Combine media components and filter.
Nunc Cell Culture Treated Flasks with Filter Caps, T175 cm2	Thermo Scientific	178883
Name	Company	Catalog Number	Comments
Growth Media
Hyclone DMEM	Fisher Scientific	SH30081.02
Hyclone FBS	Fisher Scientific	SH30910.03
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)	Thermo Fisher	11140-050
GlutaMAX Supplement (100x)	Thermo Fisher	35050-061
Sodium Pyruvate (100 mM)	Thermo Fisher	11360-070
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher	15140-122
Amphotericin B (Yellow Solution/250 µg/mL)	Fisher Scientific	BP264520
Bambanker Freeze 120 mL	Fisher Scientific	NC9582225
Name	Company	Catalog Number	Comments
Fibronectin Staining
8 well chamber slides	Fisher Scientific	1256518
20% paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15713
Triton X-100	Sigma	T8787
100% Glycerol	BioRad	9455
100% normal goat serum	Fisher Scientific	101098-382
Anti-Fibronectin antibody [F1]	Abcam	ab32419	1:300 dilution in blocking solution
Anti-SERPINH1	Sigma	S5950-200ul	1:250 dilution in blocking solution
Anti-SOX2	Millipore	MAB4343	1:100 dilution in blocking solution
Anti-Nestin	Millipore	MAB5326	1:200 dilution in blocking solution
Anti-TUJ1	Covance	MMS-435P	1:1,000 dilution in blocking solution
Alexa Fluor 488 anti-rabbit	Thermo Fisher	A11029	1:400 dilution in blocking solution; (green channel; Ex/Em2 495/519 nm)
Alexa Fluor 555 anti-mouse	Thermo Fisher	A21424	1:400 dilution in blocking solution; (red channel; Ex/Em2 590/617 nm)
Hoechst 33342 stain	Thermo Fisher	H3570	dilute to a final concentration of 1.0 μg/mL; (blue channel; Ex/Em2 358/461 nm)
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