Dérivation des cultures leptoméninge explants de Postmortem humaines donateurs cerveau

Résumé

Le protocole de culture leptoméninge explant de post-mortem du cerveau humain est un moyen techniquement robuste et simple pour obtenir des fibroblastes méningées fibronectine positifs dans les 6-8 semaines et cryoconservation environ 20-30000000 cellules.

Résumé

Même si des progrès considérables ont été accomplis dans la caractérisation clinique de la maladie de Parkinson, de nombreuses études indiquent que le diagnostic de la maladie de Parkinson n'a pas pathologiquement confirmé dans jusqu'à 25% de la maladie de Parkinson diagnostiquée cliniquement. Par conséquent, les tissus prélevés chez des patients cliniquement diagnostiqués avec la maladie de Parkinson idiopathique peut avoir un taux élevé d'erreur de diagnostic; par conséquent , des études in vitro à partir de ces tissus pour étudier la maladie de Parkinson comme un modèle pré - clinique peut devenir inutile.

En recueillant leptoméninge humains post - mortem avec un diagnostic neuropathologique confirmé de la maladie de Parkinson et caractérisé par la perte de cellules nigro et inclusions protéiques intracellulaires appelées corps de Lewy, on peut être certain que le parkinsonisme cliniquement observé est pas causée par un autre processus pathologique sous - jacent (par exemple , la tumeur, l' artériosclérose).

Ce protocole présents la dissection et la préparation des leptoméninge humains post-mortem pour la dérivation d'une culture de fibroblastes méningée. Cette procédure est robuste et a un taux de réussite élevé. Le défi de la culture est la stérilité que l'acquisition du cerveau est généralement pas réalisée dans des conditions stériles. Par conséquent, il est important de compléter le milieu de culture avec un cocktail de pénicilline, streptomycine et amphotéricine B.

La dérivation des fibroblastes méningées des cas d' autopsie confirmés de la maladie de Parkinson est la base pour la modélisation in vitro de la maladie de Parkinson. fibroblastes méningées apparaissent 3-9 jours après la préparation des échantillons et environ 20-30 millions de cellules peuvent être cryoconservés dans 6-8 semaines. La culture de fibroblastes méningée est homogène et les cellules expriment la fibronectine, un marqueur couramment utilisé pour identifier les méninges.

Introduction

Méninges se composent de trois membranes qui protègent le cerveau: la dure-mère-mère, arachnoïde et la pie. Plus récemment, il a été reconnu que les méninges jouent également un rôle important dans le développement du cerveau et du cerveau homéostasie ^1. Méninges sont dérivées de cellules mésenchymateuses et dérivées de la crête neurale et de façon intéressante, il a été démontré que les cellules souches résidant dans les méninges peuvent donner naissance à des neurones in vitro et in vivo après transplantation ^{2, 3, 4.} Les cultures méninges ont également été utilisées avec succès en tant que couches d'alimentation, car ils possèdent une activité inductrice dérivé des cellules stromales de la différenciation des cellules souches embryonnaires dans des neurones dopaminergiques ^5. En outre, les leptoméninges ont le potentiel de se différencier en neurones directement, les astrocytes, les oligodendrocytes et dans des conditions ischémiques ^6.

Pour ce protocole, les échantillons de meninges post-mortem humaines sont collectées à partir de l'arachnoïde et la pie, collectivement appelées les méninges, et sont achetés dans le cadre d'un don de cerveau humain à des fins de recherche. Dissection du cerveau est effectué dans les 24 h de la mort et l'échantillon de leptoméninge est placé dans un milieu de croissance à froid pour un traitement ultérieur dans le 6-8 suivant h comme illustré ici dans ce protocole.

Ce protocole décrit la dissection et la préparation d'échantillons de méninges humaines pour le développement de la culture de cellules de leptoméninge primaires patient. Le tissu est découpé en morceaux d'environ 25-30 3 mm x 3 mm carrés. Trois pièces sont placées dans chaque 6 puits revêtues de gélatine bien et maintient avec des lamelles de verre rondes. La dissection meninges prend environ 25-35 min. Le principal défi de cette culture est la stérilité comme le cerveau l'approvisionnement, le transport, et la dissection ne sont généralement pas réalisée dans des conditions stériles. Tonc, il est important de compléter le milieu de culture avec un cocktail de pénicilline, streptomycine et amphotéricine B et en utilisant des plats multi-puits pour la culture séparément des morceaux de tissu.

Excroissance des fibroblastes méningés se produit généralement dans la première semaine. Le support est changé tous les deux à trois jours jusqu'à ce que les cellules soient confluentes et les cellules sont repiquées par voie enzymatique. Les fibroblastes méningées sont cryoconservés à 1 million de cellules par mL / flacon dans les milieux de cryoconservation. Avec ce protocole, 20-30 millions de fibroblastes méningées peuvent être dérivées en 6-8 semaines pour la cryoconservation. Les applications en aval de ces fibroblastes méningées sont des cultures primaires pour la recherche sur la maladie, la différenciation neuronale directe ou dérivation de cellules souches pluripotentes induites à partir de la leptoméninge pour la compréhension des mécanismes de la maladie et pour le développement de médicaments.

Protocole

L'enregistrement cerveau don comprend la documentation par le déclarant de leur intention de faire un don. L'autorisation d'autopsie pour la récupération des tissus est fournie par le plus proche parent dans la mesure permise par la loi. Les études de recherche à l'aide de spécimens d'autopsie recueillies sont examinées par le comité d'examen institutionnel (IRB) pour assurer la conformité avec Health Insurance Portability and Accountability Act (HIPAA) règlements.

REMARQUE: Les échantillons sont collectés par leptoméninge le dissecteur cerveau ou neuropathologue au cours d'une dissection du cerveau et sont stockés dans des tubes de 50 ml contenant coniques 25-30 mL méningée milieu de croissance. L'échantillon est conservé à 4 ° C jusqu'à ce que la préparation des échantillons. Le traitement doit être effectué le plus tôt possible que la viabilité des cellules diminue avec le temps post-mortem.

1. Mise en place avant de lancer la leptoméninge Dissection

REMARQUE: Les étapes 01/01 à 01/03 sont à effectuer dans une enceinte de sécurité biologique.

1. Préparer un milieu de croissance des méninges en combinant 375 ml de milieu Eagle modifié par Dulbecco, 100 ml de sérum bovin fœtal, 5 ml de 10 mM d'acides aminés non essentiels, 5 ml de 200 mM de L-alanyl-L-glutamine ml de pyruvate de sodium 5 à 100 mM, 5 ml 10 000 U / ml de pénicilline / streptomycine et 5 ml 250 pg / ml d'amphotéricine B dans 500 ml d'unité de filtration. Filtrer et mélanger. Utiliser les médias pour un maximum de quatre semaines.
2. Placez tous les matériaux dans l'enceinte de sécurité biologique avant de commencer la dissection: plats 4x Petri, 2x plaques 6 puits, 2x scalpels, 15-20 stérilisés couverture feuillets 15 mm, tampon phosphate salin (PBS), pipettes sérologiques, aspiration pipettes.
3. Ajouter 1 ml de solution stérile-autoclavé gélatine 0,1% à chaque puits d'une plaque à 6 puits. Placer la plaque de côté pour 30-60 min. 2x préparer des plaques à 6 puits.

2. Préparation de l'échantillon leptoméninge

REMARQUE: Les étapes 02.01 à 02.03 doivent être effectuées dans une enceinte de sécurité biologique.

1. Ajouter environ 10 ml de PBS10 cm plat et de culture de tissu stérile placer l'échantillon meninges dans le plat. En utilisant des pinces, lavez doucement leptoméninge avec du PBS pour éliminer le sang.
2. Transférer les méninges dans un nouveau 10 cm boîte de culture de tissu contenant 10 ml de PBS frais et continuer à laver. Répéter au besoin pour enlever autant de sang que possible.
3. L'utilisation de deux scalpels, coupés leptoméninge tissu dans un environ 6 cm x 6 cm grande pièce.
4. Placer le couvercle sur une boîte de culture et transfert à un microscope à dissection dans une hotte à flux laminaire horizontal.

3. Dissection de leptoméninge Tissue

REMARQUE: Les étapes 03.01 à 03.03 doivent être effectuées dans une hotte à flux laminaire horizontal à l'aide d'un microscope à dissection.

1. Retirer les vaisseaux sanguins d'une région sur la pièce de leptoméninge (étape 2.3) assez grand pour créer au moins 20-25 3 mm x 3 mm pièces. Tenir la leptoméninge en place avec un scalpel et de l'autre, utiliser un mo raclage doux et peu profondetion pour séparer les vaisseaux.
2. Couper des petits carrés de tissu de la zone préparée. Couper dans un processus par étapes en faisant d'abord les gros morceaux, puis couper les en sections plus petites.
3. Utilisez un scalpel pour maintenir le tissu en place et un autre scalpel pour couper le tissu avec un mouvement de bascule. En raison de la consistance du tissu, il est difficile de faire coulisser les uns contre les autres scalpels. Cela ne fera que déchirer le tissu à part et se traduit par des bords irréguliers.
4. Continuer à couper les morceaux de moitié jusqu'à ce qu'il y à environ 20-25 3 mm x 3 mm pièces.

4. Transfert de Dissected Méninges Pièces sur Tissue Culture Plaques

REMARQUE: L'étape 4 doit être effectuée dans une enceinte de sécurité biologique.

1. Aspirer la gélatine de la plaque de 6 puits (de l'étape 1.3). Ajouter 1 ml de milieu de croissance meninges à chaque puits. En utilisant des pinces stériles, placer 3-4 pièces de biopsie dans chaque puits.

5. Mise en place de couverture glisse sur Meninges Pieces

REMARQUE: Les étapes 05.01 à 05.02 doivent être effectuées dans une hotte à flux laminaire horizontal à l'aide d'un microscope à dissection.

1. Couvrir les morceaux avec 1-2 15 mm lamelles stériles circulaires par puits.
2. Appuyez fermement avec une pince pour assurer les morceaux touchent le fond de la plaque. Ceci permet la fixation de pièces de tissu au fond du puits.
3. Placer la plaque de 6 puits dans un 37 ° C, 5% de CO ₂ incubateur.

Culture 6. Cellule Maintenance

REMARQUE: Les étapes 06.01 à 06.03 doivent être effectuées dans une enceinte de sécurité biologique. Manipuler des boîtes de culture avec soin que les lamelles ne doivent pas bouger et déloger les méninges pièces.

1. Après 2 jours de culture, ajouter un 1 ml supplémentaires de milieu frais de croissance meninges à chaque puits.
2. Au jour 7, aspirez soigneusement les médias et ajouter 2 mL de milieu frais dans chaque puits.
3. Après 9 jours, continuer à changer de support de croissance tous lesautre jour jusqu'à ce que la culture devient confluentes.

7. repiquage

NOTE: Toutes les étapes doivent être effectuées dans une enceinte de sécurité biologique. Une fois que les fibroblastes méningées ont migré hors des morceaux de tissu méningées et commencer à se développer vers les bords du récipient de culture, développez des fibroblastes méningées en plus grande boîte de culture.

1. Avant de commencer le repiquage, le manteau de la boîte de culture avec 1% de gélatine pendant 15-30 min.
2. Aspirer le milieu de plat à 6 puits et laver les cellules avec 2 ml de PBS.
3. Ajouter 1 ml de trypsine / EDTA à chaque puits et incuber à 37 ° C pendant 5 à 10 min. Il est nécessaire d'enlever les lamelles ou le tissu méningé pour cette étape.
4. Lorsque les cellules sont arrondies et commencent à se détacher, ajouter 2 ml de milieux de culture.
5. cellules haut et bas pour perturber complètement toutes les touffes et transférer la solution de cellules à une plus grande boîte de culture pipettes.
6. Utiliser un rapport de 1: 3 à 1: 4 pour combiner des cellules de trois boîtes à 6 puits dansune boîte de culture T75.
7. Une fois les cellules fibroblastes méningées sont confluentes dans des flacons de culture T75, trypsiniser les cellules et la cryoconservation dans les médias de cryoconservation à 1x10 ⁶ cellules / mL par flacon. Un T75 flacon de culture avec des fibroblastes confluentes méningées contient environ 5-7 millions de cellules.

8. Caractérisation des fibroblastes méningés par immunocoloration

REMARQUE: Avant de commencer la procédure, préparer une solution de paraformaldehyde à 4%, 5% de sérum de chèvre normal dans du PBS (tampon de blocage), 0,3% de Triton X-100 dans du PBS (tampon de perméabilisation), les solutions d'anticorps primaires et secondaires, et 1 pg / ml de Hoechst 33342 dilué dans du PBS de 10 mg / mL stock.

1. Seed 15.000 à 30.000 fibroblastes méningées dans 8 puits chambre diapo revêtues de gélatine à 0,1%.
2. Après 24 h lorsque les cellules sont fixées, fixer les cellules dans 100 ul de paraformaldehyde à 4% par puits pendant 10 min à température ambiante. Laver les puits 3 fois avec PBS 1x.
3. Perméabiliser les cellules avec 150 ul de 0,3% de Triton X-100 pendant 5 min à température ambiante. Laver les puits 3 fois avec PBS 1x.
4. Ajouter 200 ul de solution de blocage (PBS + 5% de sérum de chèvre normal) pendant 1 h à température ambiante.
5. Aspirer la solution de blocage et ajouter 150 ul d'anticorps primaires souhaités dilués dans une solution de blocage. Pour double coloration, préparer des dilutions de travail des anticorps primaires dans des tubes de centrifugation séparés sur la glace comme suit:
   1. Préparer dilution 1: 300 d'anticorps anti-fibronectine + dilution 1: 200 d'anticorps anti-nestine dans la solution de blocage. Préparer dilution 1: 250 d'anticorps anti-SERPINH1 + 1: 1000 dilution de l'anti-TUJ1 dans la solution de blocage. Préparer dilution 1: 250 d'anticorps anti-SERPINH1 + dilution 1: 100 d'anticorps anti-SOX2 dans une solution de blocage
6. Incuber à 4 ° C jusqu'au lendemain.
7. Laver les puits 3 fois avec PBS 1x.
8. Préparer un travail 1: 400 dilution marqué par fluorescence des anticorps secondaires de chèvre anti-lapin (vert; Ex / Em ² 495/519 nm) et de chèvre anti-souris (rouge; Ex / Em ² 590/617 nm) dans une solution de blocage et ajouter 100 pi à chaque puits. Incuber pendant 1 h, à l'obscurité, à température ambiante. Puis, lavez les puits une fois avec PBS 1x.
9. Ajouter 100 pi de 1 pg / ml Hoechst 33342 (bleu; Ex / Em ² 358/461 nm) solution à chaque puits et incuber dans l'obscurité pendant 3 min. Laver les puits 3 fois avec PBS 1x, laissant dans le lavage final 1x PBS dans le puits, et recouvrir la lame avec une feuille d'aluminium.
10. Analyser les cellules sous microscope à fluorescence.

Résultats

Lorsque le protocole de traitement de leptoméninge a réussi, l'excroissance des fibroblastes méningés est d'abord observé trois à neuf jours après la dissection, bien que cela peut dépendre de la durée de l'intervalle post-mortem du cerveau. La figure 1 montre des cultures de fibroblastes méningées de quatre donneurs différents. La figure 1A montre une pièce tenue par une lamelle de verre (diagonale sombre) et fibroblaste excrois...

Discussion

Ce protocole décrit un protocole simple et robuste pour dériver une culture de fibroblastes méningée de leptoméninge post-mortem humains recueillies conjointement avec un don de cerveau. Il y a très peu de descriptions de protocoles pour dériver des cultures de cellules de matériel humain post-mortem. Deux études décrivent des cultures de fibroblastes ^{7, 8,} peau dérivé ^9, une étude décrit les échantillons

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Corning Petri dishes	Fisher Scientific	351029
Nunc 6-well plate	Fisher Scientific	14-832-11
15-mm cover slips	Fisher Scientific	12-545-83 15CIR-1D
Scalpels, sterile blade, No. 15	Miltex	4-415
Curved precision tip forceps	Fisher Scientific	16-100-122
Serological pipettes	Fisher Scientific	13-678-11E
Pasteur pipettes	Fisher Scientific	22-230490
Gelatin	Sigma	G1890-100G
Phosphate Buffer Saline	Fisher Scientific	SH30264.02
Corning 500 mL filter unit	Fisher Scientific	430770	Combine media components and filter.
Nunc Cell Culture Treated Flasks with Filter Caps, T175 cm2	Thermo Scientific	178883
Name	Company	Catalog Number	Comments
Growth Media
Hyclone DMEM	Fisher Scientific	SH30081.02
Hyclone FBS	Fisher Scientific	SH30910.03
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)	Thermo Fisher	11140-050
GlutaMAX Supplement (100x)	Thermo Fisher	35050-061
Sodium Pyruvate (100 mM)	Thermo Fisher	11360-070
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher	15140-122
Amphotericin B (Yellow Solution/250 µg/mL)	Fisher Scientific	BP264520
Bambanker Freeze 120 mL	Fisher Scientific	NC9582225
Name	Company	Catalog Number	Comments
Fibronectin Staining
8 well chamber slides	Fisher Scientific	1256518
20% paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15713
Triton X-100	Sigma	T8787
100% Glycerol	BioRad	9455
100% normal goat serum	Fisher Scientific	101098-382
Anti-Fibronectin antibody [F1]	Abcam	ab32419	1:300 dilution in blocking solution
Anti-SERPINH1	Sigma	S5950-200ul	1:250 dilution in blocking solution
Anti-SOX2	Millipore	MAB4343	1:100 dilution in blocking solution
Anti-Nestin	Millipore	MAB5326	1:200 dilution in blocking solution
Anti-TUJ1	Covance	MMS-435P	1:1,000 dilution in blocking solution
Alexa Fluor 488 anti-rabbit	Thermo Fisher	A11029	1:400 dilution in blocking solution; (green channel; Ex/Em2 495/519 nm)
Alexa Fluor 555 anti-mouse	Thermo Fisher	A21424	1:400 dilution in blocking solution; (red channel; Ex/Em2 590/617 nm)
Hoechst 33342 stain	Thermo Fisher	H3570	dilute to a final concentration of 1.0 μg/mL; (blue channel; Ex/Em2 358/461 nm)
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