Ableitung von Leptomeningen Explantation Kulturen von Postmortem Human Brain Donors

Zusammenfassung

Die Leptomeningen Explantatkultur Protokoll aus menschlichem post mortem Gehirn ist eine technisch robuste und einfache Art und Weise Fibronektin-positive meningeal Fibroblasten innerhalb von 6-8 Wochen und kryokonserviert werden etwa 20-30 Millionen Zellen abzuleiten.

Zusammenfassung

Obwohl große Fortschritte in der klinischen Charakterisierung der Parkinson-Krankheit, einige Studien durchgeführt worden, berichten, dass die Diagnose der Parkinson-Krankheit ist nicht pathologisch bis zu 25% der klinisch diagnostizierten Parkinson-Krankheit bestätigt. Daher ist aus klinisch diagnostizierten Patienten gesammelt Gewebe mit idiopathischen Parkinson-Krankheit eine hohe Rate von Fehldiagnose haben kann; daher in vitro Studien aus solchen Geweben Parkinson-Krankheit zu studieren , wie einem präklinischen Modell zwecklos werden kann.

Durch das Sammeln von postmortalen humanen Leptomeningen mit einer bestätigten neuropathologischen Diagnose der Parkinson-Krankheit und gekennzeichnet durch nigrostriatalen Zellverlust und die intrazelluläre Proteineinschlüsse genannt Lewy - Körperchen, kann man sicher sein , dass klinisch beobachtet Parkinsonismus nicht von einem anderen zugrundeliegenden Krankheitsprozess verursacht wird (zB Tumor, Arteriosklerose).

Dieses Protokoll presents die Präparation und Herstellung von postmortalen menschlichen Leptomeningen zur Ableitung eines meningeal Fibroblasten-Kultur. Dieses Verfahren ist robust und besitzt eine hohe Erfolgsquote. Die Herausforderung der Kultur liegt Sterilität als das Gehirn Beschaffungs allgemeinen nicht unter sterilen Bedingungen durchgeführt wird. Daher ist es wichtig, die Kulturmedien mit einem Cocktail aus Penicillin, Streptomycin und Amphotericin B. zu ergänzen

Die Ableitung der meningealen Fibroblasten von Autopsie bestätigten Fälle mit Parkinson-Krankheit ist die Grundlage für in vitro - Modellierung von Parkinson-Krankheit. Meningeale Fibroblasten erscheinen 3-9 Tage nach der Probenvorbereitung und etwa 20-30 Millionen Zellen können in 6-8 Wochen kryokonserviert werden. Die meningeal Fibroblasten-Kultur ist homogen und die Zellen exprimieren Fibronektin, eine häufig verwendete Marker Hirnhaut zu identifizieren.

Einleitung

Meninges bestehen aus drei Membranen, die das Gehirn zu schützen: Dura mater, Arachnoidea und Pia mater. In jüngerer Zeit wurde erkannt , dass Meningen eine wichtige Rolle auch in der Entwicklung des Gehirns und des Gehirns Homöostase ^1. Meningen aus mesenchymalen und Neuralleiste abgeleiteten Zellen abgeleitet und interessanterweise , es , dass Vorläuferzellen in Meningen wurden , können in verursachen Neuronen in vitro und vivo nach der Transplantation ^{2, 3, 4} wohnhaft gezeigt. Meningen Kulturen wurden auch erfolgreich als Feeder - Schichten verwendet werden, wie sie für stromal cell-derived induzierende Aktivität besitzen , die Differenzierung von embryonalen Stammzellen in dopaminerge Neuronen ^5. Außerdem haben Leptomeningen das Potential direkt differenzieren sich in Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten unter ischämischen Bedingungen ^6.

Aus diesem Protokoll werden menschliche Obduktion Hirnhaut Proben aus der Arachnoidea und Pia mater gesammelt, kollektiv die Leptomeningen und werden als Teil eines menschlichen Gehirns Spende für wissenschaftliche Zwecke beschafft. Sezieren des Gehirns wird in 24 h des Todes durchgeführt und die Probe wird in Leptomeningen Kaltwachstumsmedien für die Weiterverarbeitung in der nächsten 6-8 h angeordnet, wie hier in diesem Protokoll veranschaulicht.

Dieses Protokoll beschreibt die Präparation und Herstellung von Human Meningen Proben für die Entwicklung der Patienten primären Leptomeningen Zellkultur. Das Gewebe wird zugeschnitten 25-30 Stücke von ca. 3 mm x 3 mm Quadraten. Drei Stücke sind in jedem 6-Well-Gelatine beschichtete gut und gehalten mit runden Glasplättchen gelegt. Die Meningen Präparation dauert etwa 25-35 min. Die größte Herausforderung bei dieser Kultur ist Sterilität wie das Gehirn Beschaffung, Transport und Präparation werden in der Regel nicht unter sterilen Bedingungen durchgeführt. Therefore, ist es wichtig, die Kulturmedien mit einem Cocktail aus Penicillin, Streptomycin und Amphotericin B und verwenden Multiwellschalen separat Kulturgewebestücke zu ergänzen.

Outgrowth meningealer Fibroblasten erfolgt in der Regel innerhalb der ersten Woche. Medium wird alle zwei bis drei Tage gewechselt, bis die Zellen konfluent sind und die Zellen enzymatisch agiert. Die meningeal Fibroblasten sind kryokonservierten bei 1 Million Zellen pro ml / Fläschchen in Kryokonservierung Medien. Mit diesem Protokoll 20-30 Millionen meningealen Fibroblasten können in 6-8 Wochen für die Kryokonservierung ableiten. Downstream Anwendungen dieser meningeal Fibroblasten sind Primärkulturen für die Erforschung von Krankheiten, direkte neuronale Differenzierung oder Ableitung von induzierten pluripotenten Stammzellen, die aus den Leptomeningen für das Verständnis von Krankheitsmechanismen und für die Arzneimittelentwicklung.

Protokoll

Das Gehirn Spende Anmeldung umfasst die Dokumentation vom Registranten ihrer Absicht zu spenden. Die Autopsie Erlaubnis für Gewebeentnahme wird durch die nächsten Angehörigen zur Verfügung gestellt, wie dies gesetzlich zulässig ist. Wissenschaftliche Studien gesammelt Autopsieproben verwendet werden von der Institutional Review Board (IRB) überprüft, um die Einhaltung Health Insurance Portability and Accountability Act (HIPAA) Vorschriften.

HINWEIS: Leptomeningen Proben werden durch das Gehirn Dissektor oder neuropathologist während einer Gehirnsezierung gesammelt und in 50 ml konischen Röhrchen, die 25-30 ml Meningen Wachstumsmedium gespeichert. Die Probe wird bei 4ºC bis zur Probenvorbereitung aufbewahrt. Die Verarbeitung sollte so schnell wie möglich durchgeführt werden, da die Lebensfähigkeit von Zellen mit der Zeit post mortem abnimmt.

1. Set-up, bevor die Leptomeningen Dissection starten

Hinweis: Die Schritte 1,1-1,3 sind in einem Biosicherheitsschrank durchgeführt werden.

1. Bereiten Meningen Wachstumsmedien durch die Kombination 375 ml Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium, 100 ml fötalem Rinderserum, 5 ml 10 mM nicht-essentielle Aminosäuren, 5 ml 200 mM L-Alanyl-L-Glutamin, 5 ml 100 mM Natriumpyruvat, 5 ml 10.000 U / ml Penicillin / Streptomycin und 5 ml 250 ug / ml Amphotericin B in 500 ml-Filtereinheit. Filter und mischen. Verwenden Sie Medien für bis zu vier Wochen.
2. Legen Sie alle Materialien, die in der Biosicherheitsschrank vor der Präparation beginnen: 4x Petrischalen, 2x 6-Well-Platten, 2x Skalpelle, 15-20 sterilisierten 15-mm-Deckgläser, Phosphatpuffer-Salzlösung (PBS), serologischen Pipetten, Absaugen Pipetten.
3. 1 ml steriles autoklavierte 0,1% ige Gelatinelösung zu jeder Vertiefung einer Platte mit 6 Vertiefungen. Stellen Sie den Teller zur Seite 30-60 min. Bereiten Sie 2x 6-Well-Platten.

2. Herstellung von Leptomeningen Proben

Hinweis: Die Schritte 2,1-2,3 sind in einem Biosicherheitswerkbank durchgeführt werden.

1. In etwa 10 ml PBSeine sterile 10-cm-Gewebekulturschale und die Meningen Probe in die Schüssel legen. Mit einer Pinzette vorsichtig waschen Leptomeningen mit PBS Blut zu entfernen.
2. Übertragen Sie die Meningen in eine neue 10-cm-Gewebekulturschale mit 10 ml frischem PBS und Waschen fortzusetzen. Bei Bedarf wiederholen, so viel Blut wie möglich zu entfernen.
3. Mit Hilfe von zwei Skalpelle schneiden Leptomeningen Gewebe in einem ca. 6 cm x 6 cm großes Stück.
4. Deckel auf einer Kulturschale und in ein Präpariermikroskop in einer horizontalen laminaren Strömungshaube.

3. Dissection von Leptomeningen Tissue

Hinweis: Die Schritte 3,1-3,3 sind in einer horizontalen Laminar-Flow-Haube durchgeführt werden, um ein Binokular mit.

1. Entfernen Blutgefäße aus einem Bereich auf der Leptomeningen Stück (Schritt 2.3) groß genug, um mindestens 20 bis 25 März mm x 3 mm Stücke zu schaffen. Halten Sie die Leptomeningen an Ort und Stelle mit einem Skalpell und mit dem anderen, verwenden Sie eine sanfte und flache Schaben motion die Gefäße zu trennen.
2. Schneiden Sie kleine Quadrate von Gewebe aus dem vorbereiteten Region. Schneiden Sie in einem schrittweisen Prozess durch erste größere Stücke zu machen und dann diejenigen in kleinere Abschnitte schneiden.
3. Verwenden Sie ein Skalpell, das Gewebe in Position zu halten und ein weiteres Skalpell das Gewebe mit einer Schaukelbewegung zu schneiden. Aufgrund der Konsistenz des Gewebes, ist es schwierig, die Skalpelle, gegeneinander zu gleiten. Dies wird nur das Gewebe zerreißen und führt in unregelmäßigen Kanten.
4. Weiter, um die Stücke zu halbieren, bis es ca. 20-25 3 mm x 3 mm große Stücke.

4. Übertragung von Dissected Meninges Stück auf Gewebekulturplatten

HINWEIS: Schritt 4 ist im Inneren eines biologischen Sicherheit Schrank durchgeführt werden.

1. Absaugen Gelatine aus 6-Well-Platte (aus Schritt 1.3). 1 mL Hirnhaut Wachstumsmedien in jede Kammer. Mit einer sterilen Pinzette, legen 3-4 Biopsie Stücke in jede Vertiefung.

5. Platzierung der Deckgläser über Meninges Pieces

Hinweis: Die Schritte 5,1-5,2 sind in einer horizontalen Laminar-Flow-Haube durchgeführt werden, um ein Binokular mit.

1. Decken Sie die Stücke mit 1-2 sterilen 15-mm-Kreisdeck pro Vertiefung.
2. Drücken Sie fest mit einer Pinzette die Stücke berühren den Boden der Platte zu gewährleisten. Dies ermöglicht Befestigung von Gewebestücken an den Boden des Bohrlochs.
3. Legen Sie die 6-Well - Platte in eine 37 ° C, 5% CO ₂ Inkubator.

6. Zellkultur Wartung

Hinweis: Die Schritte 6,1-6,3 sind in einem Biosicherheitswerkbank durchgeführt werden. Behandeln Sie Kulturschalen mit Sorgfalt als Deck sollten nicht die Meningen Stücke bewegen und entfernen.

1. Nach 2 Tagen in Kultur zusätzlich 1 ml frisches Meningen Wachstumsmedien in jede Vertiefung hinzu.
2. Am 7. Tag absaugen sorgfältig die Medien und fügen Sie 2 ml frisches Medium zu jeder Vertiefung.
3. Nach dem Tag 9, weiterhin Wachstumsmedien wechseln alleanderen Tag bis Kultur wird konfluent.

7. Passagierung

HINWEIS: Alle Schritte in einem Biosicherheitsschrank durchgeführt werden sollen. Sobald meningealen Fibroblasten wurden aus den meningealen Gewebestücke migriert und beginnen zu den Rändern des Kulturgefäßes zu wachsen, meningealen Fibroblasten in größere Kulturschale erweitern.

1. Vor dem Start der Passagierung Beschichtung der Kulturschale mit 1% Gelatine für 15-30 min.
2. Absaugen Medien von 6-Well-Platte und waschen Sie die Zellen mit 2 ml PBS.
3. 1 ml Trypsin / EDTA zu jeder Vertiefung und Inkubation bei 37 ° C für 5-10 min. Es ist nicht erforderlich, die Deckgläser oder die meningealen Gewebe für diesen Schritt zu entfernen.
4. Wenn die Zellen sind gerundet und beginnen zu lösen, fügen Sie 2 ml Kulturmedien.
5. Pipette Zellen nach oben und unten, um vollständig alle Klumpen stören und die Zelllösung zu größeren Kulturschale übertragen.
6. Verwenden, um ein Verhältnis von 1: 3 bis 1: 4 zu Zellen von drei 6-Well-Schalen in kombinierenzu einer T75 Kulturschale.
7. Sobald Zellen meningealen Fibroblasten in T75 Kulturflaschen konfluent sind, trypsinize die Zellen, und in Kryokonservierung Medien bei 1x10 ⁶ Zellen / ml pro Fläschchen Kryokonservierung. Ein T75 Kulturflasche mit konfluenten meningeal Fibroblasten enthält etwa 5-7 Millionen Zellen.

8. Charakterisierung der Meningeale Fibroblasten durch Immunostaining

HINWEIS: Vor Beginn des Verfahrens, Herstellung von 4% Paraformaldehydlösung, 5% normalem Ziegenserum in PBS (Blocking-Puffer), 0,3% Triton X-100 in PBS (Permeabilisierung Puffer), primäre und sekundäre Antikörperlösungen und 1 & mgr; g / ml Hoechst 33342 in PBS von 10 mg / ml Stamm verdünnt.

1. Seed 15.000 bis 30.000 meningealen Fibroblasten in 8-Well-Kammerobjektträger mit 0,1% Gelatine beschichtet.
2. Nach 24 Stunden, wenn die Zellen gebunden sind, fixieren Zellen in 100 & mgr; l 4% Paraformaldehyd pro Vertiefung für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Vertiefungen 3 mal mit 1x PBS.
3. Permeabilisierung der Zellen mit 150 & mgr; l 0,3% Triton X-100 für 5 min bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Vertiefungen 3 mal mit 1x PBS.
4. Mit 200 & mgr; l Blockierungslösung (PBS + 5% normales Ziegenserum) für 1 h bei Raumtemperatur.
5. Saugen Sie das Blockierungslösung, und fügen Sie 150 ul der gewünschten Primär in Blockierungslösung verdünnt Antikörper. Für Doppel-Färbung, bereiten Verdünnungen von primären Antikörpern in separaten Zentrifugenröhrchen auf Eis arbeitet wie folgt:
   1. Vorbereitung 1: 300 Verdünnung von anti-Fibronectin + 1: 200-Verdünnung von Anti-Nestin in Blockierlösung. Bereiten Sie 1: 250 Verdünnung von Anti-SERPINH1 + 1: 1000 Verdünnung von Anti-TuJ1 in Blocking-Lösung. Vorbereitung 1: 250 Verdünnung von anti-SERPINH1 + 1: 100-Verdünnung von anti-SOX2 in Blockierungslösung
6. über Nacht bei 4 ° C inkubieren.
7. Waschen Sie die Vertiefungen 3 mal mit 1x PBS.
8. Bereiten Sie eine Arbeits 1: 400 Verdünnung von fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörper Ziege anti-Kaninchen (grün; Ex / Em ² 495/519 nm) und Ziege anti-Maus (rot; Ex / Em ² 590/617 nm) in Blocking - Lösung und mit 100 & mgr; l zu jeder Vertiefung. Inkubieren für 1 h im Dunkeln bei Raumtemperatur. Dann waschen Brunnen einmal mit 1x PBS.
9. Je 100 & mgr; l von 1 ug / ml Hoechst 33342 (blau; Ex / Em ² 358/461 nm) Lösung in jede Vertiefung und Inkubation für 3 min im Dunkeln. Waschen Sie Wells 3 mal mit 1x PBS, in der auch in der letzten 1x PBS waschen lassen, und decken Sie die Folie mit einer Aluminiumfolie.
10. Analysieren Sie die Zellen unter dem Fluoreszenzmikroskop.

Ergebnisse

Wenn das Leptomeningen Verarbeitungsprotokoll erfolgreich war, Auswuchs meningealer Fibroblasten beobachtet ersten drei bis neun Tage nach der Sektion, obwohl dies von der Länge der Post-mortem-Intervall für das Gehirn verlassen können. Abbildung 1 zeigt meningeal Fibroblasten - Kulturen von vier verschiedenen Spendern. 1A zeigt eine Leptomeningen Stück von einem Deckglas (dunkel diagonale Linie) und Fibroblasten - Auswuchs um das Gewebe vier Tage na...

Diskussion

Dieses Protokoll beschreibt einen einfachen und robusten Protokoll eine meningealen Fibroblastenkultur von humanen post mortem Leptomeningen in Verbindung mit einer Gehirn Spende gesammelt abzuleiten. Es gibt sehr wenige Beschreibungen von Protokollen Zellkulturen aus postmortalen menschlichen Material abzuleiten. Zwei Studien beschreiben Haut abgeleiteten Fibroblastkulturen ^{7, 8, 9,} eine Studie beschreibt dura Proben

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Corning Petri dishes	Fisher Scientific	351029
Nunc 6-well plate	Fisher Scientific	14-832-11
15-mm cover slips	Fisher Scientific	12-545-83 15CIR-1D
Scalpels, sterile blade, No. 15	Miltex	4-415
Curved precision tip forceps	Fisher Scientific	16-100-122
Serological pipettes	Fisher Scientific	13-678-11E
Pasteur pipettes	Fisher Scientific	22-230490
Gelatin	Sigma	G1890-100G
Phosphate Buffer Saline	Fisher Scientific	SH30264.02
Corning 500 mL filter unit	Fisher Scientific	430770	Combine media components and filter.
Nunc Cell Culture Treated Flasks with Filter Caps, T175 cm2	Thermo Scientific	178883
Name	Company	Catalog Number	Comments
Growth Media
Hyclone DMEM	Fisher Scientific	SH30081.02
Hyclone FBS	Fisher Scientific	SH30910.03
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)	Thermo Fisher	11140-050
GlutaMAX Supplement (100x)	Thermo Fisher	35050-061
Sodium Pyruvate (100 mM)	Thermo Fisher	11360-070
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher	15140-122
Amphotericin B (Yellow Solution/250 µg/mL)	Fisher Scientific	BP264520
Bambanker Freeze 120 mL	Fisher Scientific	NC9582225
Name	Company	Catalog Number	Comments
Fibronectin Staining
8 well chamber slides	Fisher Scientific	1256518
20% paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15713
Triton X-100	Sigma	T8787
100% Glycerol	BioRad	9455
100% normal goat serum	Fisher Scientific	101098-382
Anti-Fibronectin antibody [F1]	Abcam	ab32419	1:300 dilution in blocking solution
Anti-SERPINH1	Sigma	S5950-200ul	1:250 dilution in blocking solution
Anti-SOX2	Millipore	MAB4343	1:100 dilution in blocking solution
Anti-Nestin	Millipore	MAB5326	1:200 dilution in blocking solution
Anti-TUJ1	Covance	MMS-435P	1:1,000 dilution in blocking solution
Alexa Fluor 488 anti-rabbit	Thermo Fisher	A11029	1:400 dilution in blocking solution; (green channel; Ex/Em2 495/519 nm)
Alexa Fluor 555 anti-mouse	Thermo Fisher	A21424	1:400 dilution in blocking solution; (red channel; Ex/Em2 590/617 nm)
Hoechst 33342 stain	Thermo Fisher	H3570	dilute to a final concentration of 1.0 μg/mL; (blue channel; Ex/Em2 358/461 nm)
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