תורם גזירת תרבויות Leptomeninges explant מן לאחר מות המוח האנושי

Summary

פרוטוקול תרבות leptomeninges explant מהמוח שלאחר מוות האנושי הוא דרך חזקה ופשוט טכניים לגזור פיברובלסטים קרום מוח חיובי פיברונקטין בתוך 6-8 שבועות cryopreserve כ 20-30 מיליון תאים.

Abstract

למרות התקדמות גדולה נעשתה באפיון הקליני של מחלת פרקינסון, מספר מחקרים מדווחים כי האבחנה של מחלת פרקינסון לא אשרה פתולוגית של עד 25% של מאובחנים קליני מחלת פרקינסון. לכן, רקמה שנאספו חולים שאובחנו קלינית עם מחלת פרקינסון אידיופטית יכול יש שיעור גבוה של אבחנה מוטעית; ומכאן במבחנה מרקמות כגון ללמוד מחלת פרקינסון כמודל פרה-קליני יכול להיות עקר.

על ידי איסוף leptomeninges אדם לאחר המוות עם אבחנת נוירו אשרה של מחלת פרקינסון מתאפיין אובדן תא nigrostriatal תכלילים חלבון תאי בשם גופיפי לוי, אחד יכול להיות בטוח כי פרקינסון קליני שנצפה אינו נגרם על ידי אחר תהליך מחלה (למשל גידול, טרשת עורקת).

presen פרוטוקול זהts לנתיחה והכנת leptomeninges אדם לאחר מות גזירה של תרבות פיברובלסטים קרום מוח. הליך זה הוא איתן ויש לה שיעור הצלחה גבוה. האתגר של התרבות הוא סטריליות כמו רכש המוח הוא בדרך כלל לא להתבצע בתנאים סטריליים. לכן, חשוב להשלים את תרבות התקשורת עם קוקטייל של פניצילין, סטרפטומיצין, ו amphotericin B.

על הגזרה של פיברובלסטים קרום מוח ממקרי נתיחה-אשר עם מחלת הפרקינסון מספקת את הבסיס לפיתוח מודלים במבחנה של מחלת פרקינסון. פיברובלסטים קרום המוח להופיע 3-9 ימים לאחר הכנת המדגם כ 20-30 מיליון תאים ניתן cryopreserved ב 6-8 שבועות. תרבות פיברובלסטים קרום המוח היא הומוגנית והתאים להביע פיברונקטין, סמן נפוץ לזהות קרומי המוח.

Introduction

קרום המוח מורכב משלוש ממברנות כי להגן על המוח: דורת מאטר, מאטר נואיד והפיאה. לאחרונה, הוא הוכר כי קרומי המוח גם לשחק תפקיד חשוב הומאוסטזיס התפתחות המוח והמוח ^1. קרום המוח נגזר mesenchymal ותאי הנגזרות רכס עצביים ומעניין, הוכיח כי ובתאים המתגוררים קרום מוח יכול להצמיח נוירונים במבחנה ואחרי השתלת in vivo ^{2, 3, 4.} תרבויות קרום המוח כבר גם השתמשו בהצלחה כמו שכבות מזינות, כפי שהוא בעלי פעילות התרמת תאים שמקורם סטרומה לבידול של תאי גזע עובריים לתוך נוירונים דופאמינרגיים ^5. יתר על כן, יש leptomeninges פוטנציאל להבדיל ישירות לתוך הנוירונים, האסטרוציטים, ו oligodendrocytes בתנאים איסכמי ^6.

עבור פרוטוקול זה, דגימות קרום מוח שלאחר מות אדם נאספות מאטר נואיד ופיאה, שנקראות באופן leptomeninges, ו נרכשות במסגרת תרומת מוח אנושית למטרות מחקר. Dissection של המוח מתבצע תוך 24 שעות של מוות המדגם leptomeninges מושם בתקשורת צמיחה הקרה לעיבוד נוסף בתוך 6-8 השעות הבאות כפי שמודגם כאן בפרוטוקול זה.

פרוטוקול זה מתאר את לנתיחה והכנה דגימות קרום מוח האנושי לפיתוח תרבית תאי leptomeninges העיקרי חולה. הרקמה היא חתכה לתוך 25-30 חתיכות של כ 3 מ"מ x 3 ריבועים מ"מ. שלוש יצירות ממוקמות בכל 6-גם ג'לטין מצופה היטב והחזיקה עם coverslips זכוכית עגול. דיסקציה הקרום המוח לוקח בערך 25-35 דקות. האתגר העיקרי עם תרבות זו הוא עקרות כמו רכש המוח, תחבורה לנתיחה לא מבוצעות בדרך כלל בתנאים סטריליים. Therefore, חשוב להשלים את תרבות התקשורת עם קוקטייל של פניצילין, סטרפטומיצין, ו- B amphotericin ולהשתמש מנות רבות גם בנפרד חתיכות רקמת תרבות.

תולדה של פיברובלסטים קרום המוח מתרחשת בדרך כלל בתוך השבוע הראשון. מדיה מוחלפת מדי יומית שלוש עד תאים ומחוברות התאים passaged enzymatically. הפיברובלסטים קרום המוח הם cryopreserved ב 1 מיליון תאים לכל מ"ל / בקבוקון בתקשורת cryopreservation. עם פרוטוקול זה, 20-30 מיליון פיברובלסטים קרום המוח ניתן לגזור 6-8 שבועות עבור cryopreservation. יישומי Downstream של פיברובלסטים קרום המוח אלה תרבויות עיקריות למחקר מחלה, והבחנה עצבית ישירה או גזירה של תאי גזע מושרים מן leptomeninges להבנה של מנגנוני מחלה ו לפיתוח תרופות.

Protocol

הרשמת תרומת המוח כוללת תיעוד על ידי הנרשם על כוון לתרום. ההרשאה הנתיחה לאחזור רקמות מסופק על ידי קרובי משפחה כפי שמתיר החוק. מחקרים באמצעות דגימות נתיחה שנאספו נבדקים על ידי דירקטוריון הסקירה המוסדי (IRB) על מנת להבטיח עמידת טלטלות דין והחשבון Act ביטוח בריאות תקנות (HIPAA).

הערה: דגימות Leptomeninges נאספות על ידי המבתר או נוירופתולוג המוח במהלך דיסקציה מוח מאוחסנות 50 צינורות חרוטי מיליליטר המכילים תקשורת צמיחת 25-30 מיליליטר קרום מוח. המדגם מאוחסן 4 ° C עד הכנת המדגם. העיבוד צריך להתבצע בהקדם האפשרי כמו את הכדאיות של תאים פוחת עם פוסט מורטם זמן.

1. קמה לפני תחילת Leptomeninges Dissection

הערה: שלבים 1.1 - 1.3 הם להתבצע בתוך ארון בטיחות ביולוגית.

1. כן תקשורת צמיחה קרום מוח על ידי שילוב 375 מיליליטר של מדיה הנשר השונה של Dulbecco, 100 מיליליטר של סרום שור עובר, 5 מיליליטר 10 מ"מ חומצות אמינו לא חיוניים, 5 מיליליטר 200 מ"מ L- alanyl-L- גלוטמין, 5 מיליליטר 100 פירובט נתרן מ"מ, 5 מ"ל 10,000 U / mL פניצילין / סטרפטומיצין ו -5 מ"ל 250 מיקרוגרם / מ"ל ​​Amphotericin B ב 500 מ"ל יחידת הסינון. סנן ומערבבים. השתמש בחומרי הדפסה של עד ארבעה שבועות.
2. מניח את כל החומרים בקבינט הבטיחות הביולוגי לפני התחילה לנתיחה: מנות 4x פטרי, 2x 6 צלחות היטב, 2x אזמלים, 15-20 מעוקר תלוש לכסות 15 מ"מ, חיץ מלוח פוספט (PBS), טפטפות סרולוגיות, aspirating טפטפות.
3. הוסף 1 מ"ל של תמיסת הג'לטין סטרילי-autoclaved 0.1% היטב בכל צלחת 6 באר. הגדר את הצלחת בצד במשך 30-60 דקות. כן צלחות 2x 6 באר.

2. הכנת מדגם Leptomeninges

הערה: שלבים 2.1 - 2.3 הם להתבצע בתוך ארון בטיחות ביולוגית.

1. להוסיף כ 10 מ"ל של PBSצלחת תרבות 10 ס"מ רקמה סטרילית ומניחים המדגם קרומי המוח בצלחת. בעזרת מלקחיים, לשטוף leptomeninges בעדינות עם PBS להסיר דם.
2. מעבירים את קרומי המוח לתוך צלחת תרבות חדשה של 10 ס"מ רקמה המכילה 10 מ"ל של PBS טרי ולהמשיך כביסה. חזור על הצורך להסיר דם רב ככל האפשר.
3. השימוש בשתי אזמלים, לחתוך leptomeninges רקמה לתוך חתיכה גדולה כ 6 ס"מ X 6 ס"מ.
4. מקום המכסה על צלחת תרבות והעברת מיקרוסקופ לנתח במנדף זרימה למינרית אופקי.

3. Dissection של רקמות Leptomeninges

הערה: שלבי 3.1 - 3.3 הן להתבצע בתוך מכסה מנוע זרימה למינרית אופקי באמצעות מיקרוסקופ לנתח.

1. סור כלי דם מאזור על פיסת leptomeninges (שלב 2.3) מספיק גדולה כדי ליצור לפחות חתיכות 20-25 3 מ"מ x 3 מ"מ. החזק את leptomeninges במקום עם אזמל אחד ועם אחרים, להשתמש מו גירוד עדין ורדודtion להפריד את הכלי.
2. חותכים ריבועים קטנים של רקמות מאזור מוכן. חותך בתהליך הדרגתי על ידי ביצוע חתיכות גדולות הראשון ולאחר מכן לחתוך אותם לחלקים קטנים יותר.
3. השתמש באזמל אחד להחזיק את הרקמה במקום אזמל אחר לחתוך את הרקמה עם תנועת נדנדה. בשל העקביות של רקמות, קשה להחליק את אזמלים אחד נגד השני. זה יהיה רק ​​לקרוע את הרקמה בנפרד תוצאת קצוות משוננים.
4. להמשיך ולהוריד את הגזירים לשניים עד ישנם כ חתיכות 20-25 3 מ"מ x 3 מ"מ.

העברה 4. גזור קרום המוח חתיכות לצלחות תרבות רקמות

הערה: שלב 4 הוא להתבצע בתוך ארון בטיחות ביולוגית.

1. ג'לטין לשאוב מהצלחת 6-היטב (משלב 1.3). הוסף 1 מיליליטר של תקשורת צמיחה קרום מוח היטב כל אחד. בעזרת מלקחיים סטריליות, למקם 3-4 חתיכות ביופסיה לבאר כל אחד.

5. מיקום של תלושים לכסות על Meninges Pieces

הערה: שלבי 5.1 - 5.2 הן להתבצע בתוך מכסה מנוע זרימה למינרית אופקי באמצעות מיקרוסקופ לנתח.

1. מכסים את חתיכות עם 1-2 coverslips עגול 15 מ"מ סטרילית לכל טוב.
2. מהדק היטב עם מלקחיים כדי להבטיח את החתיכות נוגעות בתחתית הצלחת. זה מאפשר התקשרות של פיסות רקמה לתחתית הבאר.
3. מניחים את צלחת 6-היטב לתוך 37 ° C חממה, 5% CO _2.

6. תחזוקת תרבית תאים

הערה: שלבים 6.1 - 6.3 הם להתבצע בתוך ארון בטיחות ביולוגית. טפל תרבות מנות בזהירות coverslips לא צריכה לזוז והוציאי את החתיכות קרום המוח.

1. אחרי 2 ימים בתרבות, להוסיף 1 מיליליטר נוסף של תקשורת צמיחה קרום מוח הטריה היטב כל אחד.
2. ביום 7, בזהירות לשאוב התקשורת ולהוסיף 2 מיליליטר של תקשורת הטריה היטב כל אחד.
3. אחרי יום 9, להמשיך לשנות תקשורת צמיחה בכללפני כמה ימים עד התרבות הופכים ומחוברים.

7. Passaging

הערה: כל הצעדים הם להתבצע בתוך ארון בטיחות ביולוגית. לאחר פיברובלסטים קרום המוח הגרו אל מחוץ פיסות רקמת קרום המוח ולהתחיל לגדול לכיוון הקצוות של כלי התרבות, להרחיב פיברובלסטים קרום מוח לתוך צלחת תרבות גדולה.

1. לפני שמתחילים את passaging, מעיל צלחת תרבות עם ג'לטין 1% למשך 15-30 דקות.
2. לשאוב התקשורת מצלחת 6-היטב ולשטוף תאים עם 2 מ"ל PBS.
3. הוסף 1 מ"ל של טריפסין / EDTA זה היטב לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 5-10 דקות. אין צורך להסיר את מכסה מחליק או רקמת קרום המוח בשלב זה.
4. כאשר תאים מעוגלים ולהתחיל לנתק, להוסיף 2 מ"ל של התקשורת והתרבות.
5. תאי פיפטה מעלה ומטה כדי לשבש את כל הגושים לחלוטין ולהעביר את פתרון התא כדי בצלחת תרבות גדולה.
6. השתמש יחס של 1: 3 ל -1: 4 לשלב תאים משלוש מנות 6-היטבכדי בצלחת תרבות T75 אחד.
7. לאחר התאים הפיברובלסטים קרום המוח הם ומחוברות צלוחיות תרבות T75, trypsinize את התאים, cryopreserve בתקשורת cryopreservation ב 1x10 ⁶ תאים / מ"ל לכל בקבוקון. בקבוק תרבות T75 אחת עם פיברובלסטים קרום המוח ומחוברות מכיל כ 5-7 מיליון תאים.

.8 אפיון של פיברובלסטים קרום המוח על ידי Immunostaining

הערה: לפני שמתחילים את ההליך, להכין 4% פתרון paraformaldehyde, 5% נורמלי עז בסרום PBS (חסימת חיץ), 0.3% Triton X-100 ב PBS (חיץ permeabilization), יסודי ותיכון פתרונות נוגדנים, ו 1 מיקרוגרם / מ"ל ​​של Hoechst 33,342 מדולל PBS מ 10 מ"ג / מ"ל ​​המניות.

1. זרע 15,000 ל -30,000 פיברובלסטים קרום המוח ב שקופיות קאמריות 8-היטב מצופים 0.1% ג'לטין.
2. לאחר 24 שעות שבהן תאים מחוברים, לתקן תאים 100 paraformaldehyde μL 4% לכל טוב במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. שטפו את בארות 3 פעמים עם 1X PBS.
3. Permeabilize את התאים עם 150 μL של 0.3% Triton X-100 במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. שטפו את בארות 3 פעמים עם 1X PBS.
4. הוספת 200 μL פתרון חסימה (PBS + 5% נסיוב עז נורמלי) עבור 1 שעות בטמפרטורת החדר.
5. לשאוב את הפתרון החוסם, ולהוסיף 150 μL של נוגדנים ראשוניים רצויים מדוללים חסימת פתרון. עבור מכתים כפול, להכין דילולים עובדים של נוגדנים עיקריים צינורות צנטריפוגה נפרדים על קרח כדלקמן:
   1. כן 1: 300 דילול של פיברונקטין נגד + 1: 200 דילול של אנטי-nestin בחסימת פתרון. כן 1: 250 דילול של אנטי-SERPINH1 + 1: 1,000 דילול של אנטי-Tuj1 בחסימת פתרון. כן 1: 250 דילול-SERPINH1 נגד + 1: 100 דילול של Sox2 אנטי בחסימת פתרון
6. דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
7. שטפו את בארות 3 פעמים עם 1X PBS.
8. כן 1 עובד: דילול 400 של fluorescently שכותרתו נוגדנים משני עזים נגד ארנב (ירוק; Ex / Em ² 495/519 ננומטר) אנטי עכבר עז (אדום; Ex / Em ² 590/617 ננומטר) בתמיסת חסימה ולהוסיף 100 μL היטב כל אחד. דגירה של 1 ש ', בחושך, בטמפרטורת החדר. לאחר מכן לשטוף בארות פעם עם 1x PBS.
9. הוספת 100 μL של 1 מיקרוגרם / מ"ל Hoechst 33342 (כחול; Ex / Em ² 358/461 ננומטר) פתרון לכל היטב דגירה בחושך במשך 3 דקות. לשטוף בארות 3 פעמים עם 1X PBS, עוזב בכביסת 1x PBS הסופית באר, ולכסות את השקופית עם רדיד אלומיניום.
10. לנתח התאים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

תוצאות

כאשר פרוטוקול עיבוד leptomeninges הצליח, תולדה של פיברובלסטים קרום המוח היא ראשונה שנצפתה שלושה תשעה ימים אחרי הניתוח, אם כי זה יכול להיות תלוי באורך של מרווח שלאחר מוות של המוח. איור 1 מדגים תרבויות פיברובלסטים קרום המוח של ארבעה תורמים שונים.

Discussion

פרוטוקול זה מתאר פרוטוקול פשוט חזק כדי להפיק תרבות פיברובלסטים קרום מוח מן leptomeninges שלאחר המוות האנושי שנאסף יחד עם תרומת מוח. יש מעט מאוד תיאורים של פרוטוקולים לגזור בתרביות תאים מן החומר האנושי לאחר המוות. שני מחקרים לתאר תרבויות עור נגזרת פיברובלסטים ^7,...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Corning Petri dishes	Fisher Scientific	351029
Nunc 6-well plate	Fisher Scientific	14-832-11
15-mm cover slips	Fisher Scientific	12-545-83 15CIR-1D
Scalpels, sterile blade, No. 15	Miltex	4-415
Curved precision tip forceps	Fisher Scientific	16-100-122
Serological pipettes	Fisher Scientific	13-678-11E
Pasteur pipettes	Fisher Scientific	22-230490
Gelatin	Sigma	G1890-100G
Phosphate Buffer Saline	Fisher Scientific	SH30264.02
Corning 500 mL filter unit	Fisher Scientific	430770	Combine media components and filter.
Nunc Cell Culture Treated Flasks with Filter Caps, T175 cm2	Thermo Scientific	178883
Name	Company	Catalog Number	Comments
Growth Media
Hyclone DMEM	Fisher Scientific	SH30081.02
Hyclone FBS	Fisher Scientific	SH30910.03
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)	Thermo Fisher	11140-050
GlutaMAX Supplement (100x)	Thermo Fisher	35050-061
Sodium Pyruvate (100 mM)	Thermo Fisher	11360-070
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher	15140-122
Amphotericin B (Yellow Solution/250 µg/mL)	Fisher Scientific	BP264520
Bambanker Freeze 120 mL	Fisher Scientific	NC9582225
Name	Company	Catalog Number	Comments
Fibronectin Staining
8 well chamber slides	Fisher Scientific	1256518
20% paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15713
Triton X-100	Sigma	T8787
100% Glycerol	BioRad	9455
100% normal goat serum	Fisher Scientific	101098-382
Anti-Fibronectin antibody [F1]	Abcam	ab32419	1:300 dilution in blocking solution
Anti-SERPINH1	Sigma	S5950-200ul	1:250 dilution in blocking solution
Anti-SOX2	Millipore	MAB4343	1:100 dilution in blocking solution
Anti-Nestin	Millipore	MAB5326	1:200 dilution in blocking solution
Anti-TUJ1	Covance	MMS-435P	1:1,000 dilution in blocking solution
Alexa Fluor 488 anti-rabbit	Thermo Fisher	A11029	1:400 dilution in blocking solution; (green channel; Ex/Em2 495/519 nm)
Alexa Fluor 555 anti-mouse	Thermo Fisher	A21424	1:400 dilution in blocking solution; (red channel; Ex/Em2 590/617 nm)
Hoechst 33342 stain	Thermo Fisher	H3570	dilute to a final concentration of 1.0 μg/mL; (blue channel; Ex/Em2 358/461 nm)
Suppliers are suggestions, similar products from alternative vendors can be used as well.