Выведение лептоменинкс эксплантата культур от посмертных доноров человеческого мозга

Резюме

Протокол культуры от эксплантов мягкая и паутинная оболочки мозга человеческого мозга посмертных является технически надежный и простой способ получения фибронектин-позитивных менингеальных фибробласты в течение 6-8 недель и криоконсервируют около 20-30 миллионов клеток.

Аннотация

Несмотря на то, значительный прогресс был достигнут в клинической характеристике болезни Паркинсона, некоторые исследования показывают, что диагноз болезни Паркинсона не патологически подтверждено в до 25% от болезни клинически диагностированных Паркинсона. Таким образом, ткань собрана из клинически диагностированных пациентов с идиопатической болезнью Паркинсона может иметь высокий уровень ошибочному диагнозу; следовательно , в пробирке исследования из таких тканей для изучения болезни Паркинсона как доклинические модель может стать бесполезной.

Собрав посмертных человека лептоменинкс с подтвержденным нейропатологического диагнозом болезни Паркинсона и характеризуется нигростриатной потерей клеток и внутриклеточных белковых включений называемые тельца Леви, можно быть уверенным , что клинически наблюдается паркинсонизм не вызывается другим основным процессом заболевания (например , опухоли, атеросклероз).

Этот протокол PresenТ.С. Вскрытие и подготовка посмертных человеческих лептоменинкс для дифференцирования менингеальной культуры фибробластов. Эта процедура является надежной и имеет высокий уровень успеха. Проблема культуры является стерильность, как заготовка головного мозга, как правило, не выполняется в стерильных условиях. Поэтому, важно, чтобы дополнить культуральные среды с коктейлем пенициллин, стрептомицин и амфотерицин В.

Вывод менингеальных фибробластов из случаев аутопсии подтвержденных с болезнью Паркинсона, обеспечивает основу для моделирования в пробирке болезни Паркинсона. Менингеальные фибробласты появляются 3-9 дней после подготовки образца и около 20-30 миллионов клеток могут быть криоконсервации через 6-8 недель. Менингеальная культура фибробластов является однородным и клетки экспрессируют фибронектин, обычно используемый маркер для идентификации мозговых оболочек.

Введение

Мозговые оболочки состоят из трех оболочек, которые защищают мозг: твердой мозговой оболочки, паутинной и мягкой мозговой оболочки. Совсем недавно было признано , что Оболочек также играют важную роль в развитии мозга и мозговой гомеостаз ^1. Оболочках получены из мезенхимальных и нервного гребня полученных клеток и , что интересно, было показано , что клетки - предшественники , проживающих в оболочках могут привести к нейронов в пробирке и после трансплантации в естественных условиях ^{2, 3, 4.} Оболочках культур были также с успехом использованы в качестве фидерных слоев, так как они обладают полученной из культур клеток , индуцирующих активность стромы для дифференцировки эмбриональных стволовых клеток в дофаминергические нейроны ^5. Кроме того, есть мягкая и паутинная оболочки мозга потенциал непосредственно дифференцироваться в нейроны, астроциты и олигодендроциты при ишемии ^6.

Для этого протокола, образцы посмертных Оболочек человека собирают из паутинной и мягкой мозговой оболочки, совместно именуемые лептоменинкс и закупаются в рамках донорства головного мозга человека в исследовательских целях. Препарирование мозга осуществляется в течение 24 ч после смерти и образец помещается мягкая и паутинная оболочки мозга в холодной питательной среды для дальнейшей обработки в течение ближайших 6-8 часов, как показано здесь, в этом протоколе.

Этот протокол описывает Вскрытие и подготовка человеческих образцов мозговые оболочки для развития пациента первичных лептоменинкс культуре клеток. Ткань разрезали на 25-30 кусков приблизительно 3 мм х 3 мм квадратов. Три фигуры помещены в каждом 6-луночные покрытый желатином хорошо и удерживается с круглыми покровные стекла. Оболочек рассечение занимает около 25-35 мин. Основной задачей этой культуры является стерильность как мозг закупок, транспорта и рассечения, как правило, не производится в стерильных условиях. Therefore, важно, чтобы дополнить культуральные среды с коктейлем пенициллина, стрептомицина, и амфотерицином В и использовать мульти-луночных планшетах для культуры отдельно Куски ткани.

Вырост менингеальных фибробластов происходит обычно в течение первой недели. Медиа меняется каждые два-три дня, пока клетки не сливающийся и клетки ферментативно пассировать. Менингеальной фибробласты замораживают в 1 миллион клеток на мл / флакон в криоконсервации средах. С помощью этого протокола, 20-30 миллионов менингеальные фибробласты могут быть получены в течение 6-8 недель для криоконсервации. Downstream применения этих менингеальных фибробластов являются первичные культуры для исследования болезней, прямой дифференцировки нейронов или выводе индуцированных плюрипотентных стволовых клеток из лептоменинкс для понимания механизмов развития заболеваний, а также для разработки лекарственных средств.

протокол

Регистрации пожертвование мозга включает в себя документацию по регистранта о своем намерении пожертвовать. Разрешение аутопсии для извлечения тканей обеспечивается ближайших родственников, как это разрешено законом. Научные исследования с использованием собранных образцов аутопсии рассматриваются этическими комитетами (IRB), чтобы обеспечить соответствие данных медицинского страхования и Закон об ответственности (HIPAA) правил.

Примечание: лептоменинкс образцы собирают диссекторе мозга или невропатолога во время рассечения мозга и хранятся в 50 мл конические пробирки, содержащие 25-30 мл Оболочек питательной среды. Образец хранят при температуре 4 ° С до подготовки образца. Обработка должна быть выполнена как можно быстрее, как жизнеспособность клеток уменьшается с течением времени вскрытии.

1. Set-перед Запуск лептоменинкс Разбор

Примечание: Шаги 1.1 - 1.3 должны быть выполнены в шкафу биологической безопасности.

1. Подготовка оболочках в культуральную среду путем объединения 375 мл Дульбекко Modified Eagle Media, 100 мл эмбриональной телячьей сыворотки, 5 мл 10 мМ заменимых аминокислот, 5 мл 200 мМ L-аланил-L-глутамина, 5 мл 100 мМ пирувата натрия, 5 мл 10000 ед / мл пенициллина / стрептомицина и 5 мл 250 мкг / мл амфотерицина в в 500 мл блока фильтров. Фильтр и перемешать. Использование средств массовой информации на срок до четырех недель.
2. Поместите все материалы в шкафу биологической безопасности перед началом рассечение: 4x чашки Петри, 2x 6-луночные планшеты, 2x скальпели, 15-20 стерилизованные 15-мм покровные стекла, фосфатный буфер солевой раствор (PBS), серологические пипетки, аспирационных пипеток.
3. Добавить 1 мл стерилизованного в автоклаве 0,1% раствора желатина в каждую лунку 6-луночного планшета. Установите пластину в сторону в течение 30-60 мин. Подготовьте 2x 6-луночные планшеты.

2. Подготовка образца лептоменинкс

Примечание: Шаги 2.1 - 2.3 должны быть выполнены в шкафу биологической безопасности.

1. Добавьте примерно 10 мл PBS сстерильный 10 см блюдо культуры ткани и поместите Оболочек образец в блюдо. С помощью щипцов, аккуратно мыть лептоменинкс с PBS, чтобы удалить кровь.
2. Перенесите мозговые оболочки в новый 10-см блюдо культуры ткани, содержащей 10 мл свежей PBS и продолжайте промывку. Повторите по мере необходимости, чтобы удалить как можно больше крови, насколько это возможно.
3. С помощью двух скальпели, разрезать ткани в мягкая и паутинная оболочки мозга приблизительно 6 см х 6 см большой кусок.
4. Поместите крышку на блюдо культуры и передачи рассекает микроскопа в горизонтальной ламинарный.

3. Вскрытие лептоменинкс ткани

Примечание: Шаги 3.1 - 3.3 должны быть выполнены в горизонтальном колпаке с ламинарным потоком с использованием рассекает микроскопом.

1. Удалить кровеносные сосуды из области на кусок лептоменинкс (шаг 2.3), достаточно большой, чтобы создать по меньшей мере, 20-25 3 мм х 3 мм штук. Держите лептоменинкс на месте с одним скальпелем и с другой стороны, использовать мягкий и неглубокую выскабливание моции, чтобы отделить сосуды.
2. Вырежьте небольшие квадраты ткани из подготовленной области. Вырезать в ступенчатом процессе, сначала делая большие куски, а затем нарезая те на более мелкие части.
3. Используйте один скальпель для удержания ткани на месте, а другой скальпель, чтобы разрезать ткань с качке. Благодаря консистенции ткани, трудно сдвинуть скальпели друг против друга. Это будет только разорвать ткань на части и приводит к рваных краев.
4. Продолжить резки куски пополам, пока не около 20-25 3 мм х 3 мм шт.

4. Передача расчлененный на мозговые оболочки Кусочки планшетах культуры

Примечание: Шаг 4 должна быть выполнена внутри шкафа биологической безопасности.

1. Отберите желатин из 6-луночного планшета (с шага 1.3). Добавить 1 мл Оболочек питательной среды в каждую лунку. Использование стерильного пинцета, поместить 3-4 биопсии штук в каждую лунку.

5. Размещение покровных стеклах над Мeninges Pieces

Примечание: Шаги 5.1 - 5.2 должны быть выполнены в горизонтальном колпаке с ламинарным потоком с использованием рассекает микроскопом.

1. Накройте куски с 1-2 стерильные 15-мм круглыми покровные на лунку.
2. Сильно надавите с щипцами, чтобы обеспечить куски прикасаясь к нижней части пластины. Это дает возможность присоединить кусочков ткани на дно колодца.
3. Поместите 6-луночного планшета в 37 ° C, 5% СО ₂ инкубатора.

Техническое обслуживание Культура 6. Cell

Примечание: Шаги 6.1 - 6.3 должны быть выполнены в шкафу биологической безопасности. Ручка культуры блюда с осторожностью, так как покровные не должны двигаться и смещать мозговые оболочки штук.

1. После 2-х дней в культуре, добавьте еще 1 мл свежей среды для выращивания оболочках в каждую лунку.
2. На 7-й день, тщательно аспирата СМИ и добавляют 2 мл свежей среды в каждую лунку.
3. После того, как 9-й день, продолжают изменяться роста среды каждыедругой день до культуры становится вырожденная.

7. Пассирование

ПРИМЕЧАНИЕ: Все шаги должны быть выполнены в шкафу биологической безопасности. После того, как менингеальные фибробласты мигрируют из кусочков ткани менингеальных и начинают расти к краям сосуда для культивирования, расширение менингеальных фибробласты в более крупные чашки для культивирования.

1. Перед началом пассажей, пальто культуры блюдо с 1% желатина в течение 15-30 мин.
2. Аспирируйте средств массовой информации из 6-луночного блюдо и мыть клетки с 2 мл PBS.
3. Добавить 1 мл трипсина / EDTA в каждую лунку и инкубировали при 37 ° С в течение 5-10 мин. Не нужно, чтобы снять крышку слипы или менингеальной ткани для этого шага.
4. Когда клетки округлены и начинают отделяться, добавляют 2 мл культуральной среды.
5. Пипетировать клетки вверх и вниз, чтобы полностью разрушить все комки и передать решение клеток в большей культуре блюдо.
6. Используйте отношение 1: 3 до 1: 4, чтобы объединить клетки из трех 6-луночных планшетах вк одному T75 блюдо культуры.
7. После того, как менингеальные фибробласты клетки сливающийся в культуральных флаконах Т75, Trypsinize клетки, и криоконсервируют в криоконсервации средах при 1x10 ⁶ клеток / мл в пузырек. Одна T75 культуры колбу с сливающихся менингеальных фибробластов содержит около 5-7 миллионов клеток.

8. Характеристика менингеальной фибробластами иммунным окрашиванием

Примечание: Перед началом процедуры, подготовить 4% раствора параформальдегида 5% нормальной козьей сыворотки в PBS (блокирующем буфере), 0,3% Тритон Х-100 в PBS (пермеабилизации буфер), растворы первичных и вторичных антител, и 1 мкг / мл Hoechst 33342 разводили в PBS с 10 мг / мл стоковый.

1. Семя 15000 до 30000 менингеальные фибробласты в 8-луночного камеры слайде покрыты 0,1% желатина.
2. Через 24 ч, когда прикрепляются клетки, фиксируют клетки в 100 мкл 4% параформальдегида на лунку в течение 10 мин при комнатной температуре. Промыть лунки 3 раза 1x PBS.
3. Клетки проницаемыми с 150 мкл 0,3% Тритона Х-100 в течение 5 мин при комнатной температуре. Промыть лунки 3 раза 1x PBS.
4. Добавить 200 мкл блокирующего раствора (PBS + 5% нормальной козьей сывороткой) в течение 1 ч при комнатной температуре.
5. Аспирируйте блокирующий раствор и добавляют 150 мкл желательных первичных антител разводят в блокирующем растворе. Для получения двойного окрашивания, подготовка рабочих разведений первичных антител в отдельных центрифужные пробирки на лед следующим образом:
   1. Приготовьте 1: 300 разбавление анти-фибронектин + 1: 200 разбавление анти-нестину в блокирующем растворе. Приготовьте 1: 250 разведение анти-SERPINH1 + 1: 1000 разведение анти-TUJ1 в блокирующем растворе. Приготовьте 1: 250 разбавлением анти-SERPINH1 + 1: 100 разведение анти-SOX2 в блокирующем растворе
6. Инкубируйте при 4 ° С в течение ночи.
7. Промыть лунки 3 раза 1x PBS.
8. Подготовка рабочего 1: 400 разбавление флуоресцентно меченных вторичных антител козы к антителам кролика (зеленый; Ex / Em ² 495/519 нм) и козьего антитела против мышиных (красный; Ex / Эм ² 590/617 нм) в блокирующем растворе и 100 мкл в каждую лунку. Инкубировать в течение 1 ч, в темноте, при комнатной температуре. Затем промыть лунки один раз с 1x PBS.
9. Добавить 100 мкл 1 мкг / мл Hoechst 33342 (синий, Ex / Em ² 358/461 нм) раствора в каждую лунку и инкубировать в темноте в течение 3 мин. Промыть лунки 3 раза 1x PBS, в результате чего в последней промывки 1x PBS в скважине, и покрывают слайд с алюминиевой фольгой.
10. Анализ клетки под флуоресцентным микроскопом.

Результаты

Когда протокол обработки мягкая и паутинная оболочки мозга был успешным, нарост менингеальных фибробласты сначала наблюдается от трех до девяти дней после того, как рассечение, хотя это может зависеть от длины интервала посмертном для мозга. Рисунок 1 демонс...

Обсуждение

Этот протокол описывает простой и надежный протокол для получения оценки менингеальное культуры фибробластов из лептоменинкс посмертных человека, собранных в сочетании с пожертвованием мозга. Есть очень мало описания протоколов для получения клеточных культур из посмертного челов?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Corning Petri dishes	Fisher Scientific	351029
Nunc 6-well plate	Fisher Scientific	14-832-11
15-mm cover slips	Fisher Scientific	12-545-83 15CIR-1D
Scalpels, sterile blade, No. 15	Miltex	4-415
Curved precision tip forceps	Fisher Scientific	16-100-122
Serological pipettes	Fisher Scientific	13-678-11E
Pasteur pipettes	Fisher Scientific	22-230490
Gelatin	Sigma	G1890-100G
Phosphate Buffer Saline	Fisher Scientific	SH30264.02
Corning 500 mL filter unit	Fisher Scientific	430770	Combine media components and filter.
Nunc Cell Culture Treated Flasks with Filter Caps, T175 cm2	Thermo Scientific	178883
Name	Company	Catalog Number	Comments
Growth Media
Hyclone DMEM	Fisher Scientific	SH30081.02
Hyclone FBS	Fisher Scientific	SH30910.03
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)	Thermo Fisher	11140-050
GlutaMAX Supplement (100x)	Thermo Fisher	35050-061
Sodium Pyruvate (100 mM)	Thermo Fisher	11360-070
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher	15140-122
Amphotericin B (Yellow Solution/250 µg/mL)	Fisher Scientific	BP264520
Bambanker Freeze 120 mL	Fisher Scientific	NC9582225
Name	Company	Catalog Number	Comments
Fibronectin Staining
8 well chamber slides	Fisher Scientific	1256518
20% paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15713
Triton X-100	Sigma	T8787
100% Glycerol	BioRad	9455
100% normal goat serum	Fisher Scientific	101098-382
Anti-Fibronectin antibody [F1]	Abcam	ab32419	1:300 dilution in blocking solution
Anti-SERPINH1	Sigma	S5950-200ul	1:250 dilution in blocking solution
Anti-SOX2	Millipore	MAB4343	1:100 dilution in blocking solution
Anti-Nestin	Millipore	MAB5326	1:200 dilution in blocking solution
Anti-TUJ1	Covance	MMS-435P	1:1,000 dilution in blocking solution
Alexa Fluor 488 anti-rabbit	Thermo Fisher	A11029	1:400 dilution in blocking solution; (green channel; Ex/Em2 495/519 nm)
Alexa Fluor 555 anti-mouse	Thermo Fisher	A21424	1:400 dilution in blocking solution; (red channel; Ex/Em2 590/617 nm)
Hoechst 33342 stain	Thermo Fisher	H3570	dilute to a final concentration of 1.0 μg/mL; (blue channel; Ex/Em2 358/461 nm)
Suppliers are suggestions, similar products from alternative vendors can be used as well.