Derivación de las leptomeninges de explantes de culturas postmortem Humanos Los donantes de cerebro

Resumen

El protocolo de cultivo de explante de leptomeninges cerebral postmortem humana es una forma técnicamente robusto y sencillo para derivar los fibroblastos meníngeos fibronectina positiva dentro de 6-8 semanas y criopreservar aproximadamente 20-30 millones de células.

Resumen

A pesar de que se han hecho grandes avances en la caracterización clínica de la enfermedad de Parkinson, varios estudios indican que el diagnóstico de la enfermedad de Parkinson no está confirmado patológicamente en hasta el 25% de las enfermedades clínicamente diagnosticados de Parkinson. Por lo tanto, el tejido recogido de pacientes con diagnóstico clínico de enfermedad de Parkinson idiopática pueden tener una alta tasa de diagnóstico erróneo; por lo tanto, en estudios in vitro a partir de tales tejidos para estudiar la enfermedad de Parkinson como un modelo preclínico puede llegar a ser inútil.

Mediante la recopilación de las leptomeninges humanos postmortem con un diagnóstico neuropatológico confirmado de la enfermedad de Parkinson y que se caracteriza por la pérdida de células nigroestriatal y las inclusiones de proteínas intracelulares llamadas cuerpos de Lewy, uno puede estar seguro de que el parkinsonismo clínicamente observada no es causada por otra enfermedad subyacente (por ejemplo, tumores, arteriosclerosis).

Este protocolo presents la disección y preparación de las leptomeninges de cadáver utilizadas para derivación de un cultivo de fibroblastos meníngea. Este procedimiento es robusto y tiene una alta tasa de éxito. El reto de la cultura es la esterilidad como la adquisición cerebro generalmente no se lleva a cabo en condiciones estériles. Por lo tanto, es importante para complementar los medios de cultivo con un cóctel de penicilina, estreptomicina y anfotericina B.

La derivación de los fibroblastos meníngeos de casos confirmados de la autopsia con la enfermedad de Parkinson proporciona la base para el modelado in vitro de la enfermedad de Parkinson. fibroblastos meníngeos aparecen 3-9 días después de la preparación de la muestra y cerca de 20-30 millones de células pueden ser criopreservados en 6-8 semanas. El cultivo de fibroblastos meníngea es homogénea y las células expresan la fibronectina, un marcador utilizado comúnmente para identificar meninges.

Introducción

Meninges consisten en tres membranas que protegen el cerebro: la duramadre, la aracnoides y la piamadre. Más recientemente, se ha reconocido que meninges también juegan un papel importante en el desarrollo del cerebro y el cerebro homeostasis ^1. Meninges se derivan de mesenquimales y células derivadas de la cresta neural y de manera interesante, se ha demostrado que las células progenitoras que residen en meninges puede dar lugar a neuronas in vitro y después del trasplante in vivo ^{2, 3, 4.} Culturas Meninges han sido también utilizado con éxito como capas de alimentación, ya que poseen actividad inductora de derivado de células del estroma para la diferenciación de células madre embrionarias en neuronas dopaminérgicas ^5. Por otra parte, leptomeninges tienen el potencial de diferenciarse directamente en neuronas, astrocitos y oligodendrocitos en condiciones isquémicas ^6.

Para este protocolo, humanos muestras postmortem meninges se recogen de la aracnoides y la piamadre, llamados colectivamente las leptomeninges, y se adquieren como parte de una donación de cerebro humano con fines de investigación. La disección del cerebro se lleva a cabo dentro de las 24 h de la muerte y la muestra leptomeninges se coloca en medio de cultivo frío para su posterior procesamiento en el próximo 6-8 h como se ilustra aquí en este protocolo.

Este protocolo describe la disección y preparación de muestras meninges humanos para el desarrollo de cultivo de células primarias leptomeninges paciente. El tejido se corta en piezas de aproximadamente 25-30 3 mm x 3 mm cuadrados. Tres piezas se colocan en cada uno de 6 pocillos recubiertos de gelatina bien y se mantiene presionada con cubreobjetos de vidrio redondos. La disección de las meninges toma alrededor de 25-35 minutos. El principal reto con esta cultura es la esterilidad como la adquisición del cerebro, el transporte, y la disección generalmente no se llevan a cabo en condiciones estériles. Tor lo tanto, es importante para complementar los medios de cultivo con un cóctel de penicilina, estreptomicina y anfotericina B y el uso de platos de múltiples pocillos de cultivo de tejidos por separado piezas.

Consecuencia de fibroblastos meníngeos ocurre generalmente dentro de la primera semana. Medios se cambia cada dos o tres días hasta que las células son confluentes y las células se pasan enzimáticamente. Los fibroblastos meníngeos son criopreservados en 1 millón de células por ml / vial en los medios de crioconservación. Con este protocolo, 20-30 millones de fibroblastos meníngeos se pueden derivar en 6-8 semanas para la criopreservación. aplicaciones posteriores de estos fibroblastos meníngeos son cultivos primarios para la investigación de enfermedades, la diferenciación neuronal directa o derivación de células madre pluripotentes inducidas a partir de las leptomeninges para la comprensión de los mecanismos de la enfermedad y para el desarrollo de fármacos.

Protocolo

El registro de la donación de cerebro incluye documentación por el solicitante de registro de su intención de donar. El permiso de la autopsia para la recuperación de los tejidos es proporcionada por los familiares de lo permitido por la ley. Los estudios de investigación utilizando muestras de autopsia recogidos son revisados ​​por la Junta de Revisión Institucional (IRB) para garantizar el cumplimiento de portabilidad del seguro médico y reglamentos de la Ley de Responsabilidades (HIPAA).

Nota: Las muestras leptomeninges son recogidos por el disector de cerebro o neuropathologist durante una disección cerebro y se almacenan en tubos cónicos de 50 ml que contenían 25-30 ml meninges medio de crecimiento. La muestra se almacena a 4 ° C hasta que la preparación de muestras. El tratamiento debe realizarse lo más pronto posible ya que la viabilidad de las células disminuye con el tiempo de post mortem.

1. Puesta en marcha antes de iniciar la disección leptomeninges

NOTA: Los pasos 1.1 a 1.3 se va a realizar dentro de una cabina de bioseguridad.

1. Preparar medio de crecimiento meninges combinando 375 ml de Dulbecco modificado de Eagle Media, 100 ml de suero bovino fetal, 5 ml 10 mM de aminoácidos no esenciales, 5 ml 200 mM L-alanil-L-glutamina, 5 ml de piruvato sódico 100 mM, 5 ml 10000 U / ml de penicilina / estreptomicina y 5 ml 250 mg / ml de anfotericina B en 500 ml unidad de filtro. Filtrar y mezclar. Utilizar los medios de comunicación para un máximo de cuatro semanas.
2. Coloque todos los materiales en la cabina de bioseguridad antes de comenzar la disección: platos de Petri 4x, 2x placas de 6 pocillos, 2x escalpelos, 15-20 esterilizados cubreobjetos de 15 mm, tampón fosfato salino (PBS), pipetas serológicas, aspirando pipetas.
3. Añadir 1 ml de solución estéril en autoclave gelatina 0,1% a cada pocillo de una placa de 6 pocillos. Ajuste el plato a un lado durante 30-60 minutos. Preparar 2x placas de 6 pocillos.

2. Preparación de la muestra leptomeninges

NOTA: Los pasos 2.1 a 2.3 se va a realizar dentro de una cabina de bioseguridad.

1. Añadir aproximadamente 10 ml de PBS paraa 10 cm placa de cultivo tisular estéril y coloque la muestra meninges en el plato. Con unas pinzas, lavar suavemente leptomeninges con PBS para eliminar la sangre.
2. La transferencia de las meninges en un nuevo 10-cm placa de cultivo de tejido que contenía 10 ml de PBS fresco y seguir lavando. Repetir si es necesario para eliminar la mayor cantidad de sangre posible.
3. El uso de dos escalpelos, cortados leptomeninges tejido en un aproximado de 6 cm x 6 cm pedazo grande.
4. Coloque la tapa sobre una placa de cultivo y la transferencia a un microscopio de disección en una campana de flujo laminar horizontal.

3. La disección de tejidos de leptomeninges

NOTA: Los pasos 03.01 a 03.03 se va a realizar dentro de una campana de flujo laminar horizontal usando un microscopio de disección.

1. Eliminar los vasos sanguíneos de una región en la pieza leptomeninges (paso 2.3) lo suficientemente grande como para crear al menos 20-25 3 piezas mm x 3 mm. Mantenga las leptomeninges en su lugar con una bisturí y con la otra, utilizar un mo raspado suave y poco profundación para separar los vasos.
2. Cortar pequeños cuadrados de tejido de la región preparados. Cortar en un proceso por etapas primero haciendo pedazos más grandes y luego cortar los en secciones más pequeñas.
3. Utilice uno bisturí para mantener el tejido en su lugar y otro bisturí para cortar el tejido con un movimiento de balanceo. Debido a la consistencia del tejido, es difícil deslizar los escalpelos uno contra el otro. Esto sólo se rasgará el tejido aparte y los resultados en los bordes desiguales.
4. Continuar el corte de las piezas por la mitad hasta que hay alrededor de 20-25 piezas de 3 mm x 3 mm.

4. Transferencia de disecado meninges piezas en tejido Placas de Cultivo

NOTA: El paso 4 se va a realizar dentro de una cabina de bioseguridad.

1. Aspirar la gelatina de la placa de 6 pocillos (del paso 1.3). Añadir 1 ml de medio de crecimiento de las meninges a cada pocillo. El uso de pinzas estériles, coloque 3-4 piezas de biopsia en cada pocillo.

5. Colocación de la cubierta se desliza sobre MPiezas eninges

NOTA: Los pasos 5.1 a 5.2 se va a realizar dentro de una campana de flujo laminar horizontal usando un microscopio de disección.

1. Cubrir las piezas con 1-2 de 15 mm cubreobjetos circulares estériles por pocillo.
2. Presione hacia abajo firmemente con unas pinzas para asegurar las piezas estén en contacto con la parte inferior de la placa. Esto permite la unión de piezas de tejido a la parte inferior del pozo.
3. Coloque la placa de 6 pocillos en un 37 ° C, 5% de _CO2.

6. Mantenimiento de Cultivos Celulares

NOTA: Los pasos 6.1 a 6.3 se va a realizar dentro de una cabina de bioseguridad. Manejar con cuidado las placas de cultivo como cubreobjetos no deben mover y desplazar las piezas meninges.

1. Después de 2 días de cultivo, añadir 1 ml adicionales de medio de cultivo fresco meninges a cada pocillo.
2. En el día 7, aspirar con cuidado los medios de comunicación y añadir 2 ml de medio fresco a cada pocillo.
3. Después Día 9, seguirá cambiando cada medio de crecimientodos días hasta que se convierte en la cultura confluente.

7. pases

NOTA: Todos los pasos deben ser realizados dentro de una cabina de bioseguridad. Una vez que los fibroblastos meníngeos han emigrado fuera de las piezas de tejido meníngeas y empezar a crecer hacia los bordes del recipiente de cultivo, ampliar fibroblastos meníngeos en placa de cultivo más grande.

1. Antes de iniciar el passaging, capa la placa de cultivo con 1% de gelatina durante 15-30 min.
2. Aspirar los medios de placa de 6 pocillos y lavar las células con 2 ml de PBS.
3. Añadir 1 ml de tripsina / EDTA a cada pocillo y se incuba a 37 ° C durante 5 a 10 min. No es necesario retirar los cubreobjetos o el tejido meníngeo para este paso.
4. Cuando las células se redondean y se empiezan a separar, añadir 2 ml de medio de cultivo.
5. Las células de la pipeta hacia arriba y abajo para interrumpir por completo todos los grumos y transferir la solución de células de placa de cultivo más grande.
6. Utilice una relación de 1: 3 a 1: 4 para combinar las células de los tres platos de 6 pocillos ena una placa de cultivo T75.
7. Una vez que las células fibroblastos meníngeos son confluentes en matraces de cultivo T75, trypsinize las células, y criopreservar en los medios de crioconservación en 1x10 ⁶ células / ml por vial. Un matraz de cultivo T75 con meníngea fibroblastos confluentes contiene alrededor de 5-7 millones de células.

8. Caracterización de los fibroblastos meníngeos por inmunotinción

NOTA: Antes de comenzar el procedimiento, preparar la solución de paraformaldehído al 4%, suero de cabra normal al 5% en PBS (tampón de bloqueo), 0,3% de Triton X-100 en PBS (tampón de permeabilización), soluciones de anticuerpos primarios y secundarios, y 1 mg / ml de Hoechst 33342 diluido en PBS a partir de 10 mg / mL de stock.

1. Semilla de 15.000 a 30.000 fibroblastos meníngeos en 8 pocillos recubiertos con cámara de diapositivas 0,1% de gelatina.
2. Después de 24 h cuando se unen las células, fijar las células en 100 l 4% de paraformaldehído por pocillo durante 10 min a temperatura ambiente. Lavar los pocillos 3 veces con PBS 1x.
3. Permeabilizar las células con 150 l de 0,3% de Triton X-100 para 5 min a temperatura ambiente. Lavar los pocillos 3 veces con PBS 1x.
4. Añadir 200 l de solución de bloqueo (PBS + 5% de suero normal de cabra) durante 1 h a temperatura ambiente.
5. Aspirar la solución de bloqueo, y añadir 150 l de anticuerpos primarios deseados diluido en solución de bloqueo. Por doble tinción, preparar diluciones de trabajo de los anticuerpos primarios en tubos de centrífuga separados en el hielo de la siguiente manera:
   1. Preparar una dilución 1: 300 de anti-fibronectina + dilución 1: 200 de anti-nestina en solución de bloqueo. Preparar una dilución 1: 250 de anti-SERPINH1 + 1: 1000 dilución de anti-Tuj1 en solución de bloqueo. Preparar 1: 250 dilución de anti-SERPINH1 + 1: 100 dilución de anti-SOX2 en solución de bloqueo
6. Se incuba a 4 ° C durante la noche.
7. Lavar los pocillos 3 veces con PBS 1x.
8. Preparar un trabajo dilución 1: 400 de la etiqueta fluorescente secundaria de anticuerpos de cabra anti-conejo (verde; Ex / Em ² 495/519 nm) y de cabra anti-ratón (rojo; Ex / Em ² 590/617 nm) en solución de bloqueo y añadir 100 l a cada pocillo. Incubar durante 1 h, en la oscuridad, a temperatura ambiente. Luego se lavan los pocillos una vez con PBS 1x.
9. Añadir 100 l de 1 mg / ml de Hoechst 33342 (azul; Ex / Em ² 358/461 nm) solución a cada pocillo y se incuba en la oscuridad durante 3 min. Lavar los pocillos 3 veces con PBS 1x, dejando en la final de lavado 1x PBS en el pozo, y cubrir el portaobjetos con papel de aluminio.
10. Analizar las células bajo el microscopio de fluorescencia.

Resultados

Cuando el protocolo de procesamiento leptomeninges ha tenido éxito, primero se observa consecuencia de fibroblastos meníngeos tres a nueve días después de la disección, aunque esto puede depender de la duración del intervalo post-mortem para el cerebro. La Figura 1 muestra los cultivos de fibroblastos meníngeas de cuatro donantes diferentes. La figura 1A muestra una pieza leptomeninges sujetado por un cubreobjetos de vidrio (línea diagonal oscura...

Discusión

Este protocolo describe un protocolo simple y robusto para derivar un cultivo de fibroblastos de meníngea leptomeninges postmortem humanos recogidos en conjunción con una donación cerebro. Hay muy pocas descripciones de los protocolos para derivar los cultivos celulares a partir de material humano postmortem. Dos estudios describen cultivos de fibroblastos ^{7, 8,} de la piel derivado de ^9, un estudio describe muestras Dura

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Corning Petri dishes	Fisher Scientific	351029
Nunc 6-well plate	Fisher Scientific	14-832-11
15-mm cover slips	Fisher Scientific	12-545-83 15CIR-1D
Scalpels, sterile blade, No. 15	Miltex	4-415
Curved precision tip forceps	Fisher Scientific	16-100-122
Serological pipettes	Fisher Scientific	13-678-11E
Pasteur pipettes	Fisher Scientific	22-230490
Gelatin	Sigma	G1890-100G
Phosphate Buffer Saline	Fisher Scientific	SH30264.02
Corning 500 mL filter unit	Fisher Scientific	430770	Combine media components and filter.
Nunc Cell Culture Treated Flasks with Filter Caps, T175 cm2	Thermo Scientific	178883
Name	Company	Catalog Number	Comments
Growth Media
Hyclone DMEM	Fisher Scientific	SH30081.02
Hyclone FBS	Fisher Scientific	SH30910.03
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)	Thermo Fisher	11140-050
GlutaMAX Supplement (100x)	Thermo Fisher	35050-061
Sodium Pyruvate (100 mM)	Thermo Fisher	11360-070
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher	15140-122
Amphotericin B (Yellow Solution/250 µg/mL)	Fisher Scientific	BP264520
Bambanker Freeze 120 mL	Fisher Scientific	NC9582225
Name	Company	Catalog Number	Comments
Fibronectin Staining
8 well chamber slides	Fisher Scientific	1256518
20% paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15713
Triton X-100	Sigma	T8787
100% Glycerol	BioRad	9455
100% normal goat serum	Fisher Scientific	101098-382
Anti-Fibronectin antibody [F1]	Abcam	ab32419	1:300 dilution in blocking solution
Anti-SERPINH1	Sigma	S5950-200ul	1:250 dilution in blocking solution
Anti-SOX2	Millipore	MAB4343	1:100 dilution in blocking solution
Anti-Nestin	Millipore	MAB5326	1:200 dilution in blocking solution
Anti-TUJ1	Covance	MMS-435P	1:1,000 dilution in blocking solution
Alexa Fluor 488 anti-rabbit	Thermo Fisher	A11029	1:400 dilution in blocking solution; (green channel; Ex/Em2 495/519 nm)
Alexa Fluor 555 anti-mouse	Thermo Fisher	A21424	1:400 dilution in blocking solution; (red channel; Ex/Em2 590/617 nm)
Hoechst 33342 stain	Thermo Fisher	H3570	dilute to a final concentration of 1.0 μg/mL; (blue channel; Ex/Em2 358/461 nm)
Suppliers are suggestions, similar products from alternative vendors can be used as well.