في المختبر تمايز الناضجة Myofibers للتصوير لايف

Summary

Muscle cells are among the most complex eukaryotic cells. We present a protocol for the in vitro differentiation of highly mature myofibers that allows for genetic manipulation and clear imaging during all developmental stages.

Abstract

وتتكون العضلات والهيكل العظمي من myofibers، أكبر الخلايا في جسم الثدييات واحدة من عدد قليل من syncytia. كيف يتم تجميع الهياكل المعقدة والحفظ تطويريا التي يتكون منها لا يزال قيد التحقيق. حجمها والفسيولوجية ملامح غالبا ما تقيد التلاعب والتصوير التطبيقات. ويستخدم على نطاق واسع الثقافة من خطوط الخلايا خلده، ولكن يمكن تكرار سوى الخطوات الأولى من التمايز.

هنا، نحن تصف البروتوكول الذي يتيح التلاعب الجيني سهولة myofibers القادمة من myoblasts الماوس الأولية. بعد أسبوع واحد من التمايز، وmyofibers عرض انقباض، محاذاة ساركومير والثلاثيات، وكذلك نوى الطرفية. يمكن أن يتبع عملية التمايز بأكملها من خلال التصوير الحي أو المناعي. هذا النظام يجمع بين مزايا الموجودة خارج الحي وفي بروتوكولات المختبر. إمكانية ترنسفكأيشن سهلة وفعالة وكذلكسهولة الوصول إلى جميع مراحل التمايز يوسع التطبيقات المحتملة. Myofibers بالتالي، يمكن استخدامها ليس فقط لمعالجة مسائل البيولوجيا التطورية والخلية ذات الصلة، ولكن أيضا لإعادة إنتاج الظواهر مرض في العضلات لالتطبيقات السريرية.

Introduction

الهيكل العظمي والعضلات يؤلف ما يصل إلى 40٪ من وزن جسم الإنسان ^1. وتمثل الاضطرابات المرتبطة عضلة الصحية الهائلة والعبء الاقتصادي ^2. كيف يتكون هذا النسيج المعقد للغاية والمنظمة، حافظ، ومجدد يشكل حقل بحث واسعة وراسخة. تبعا لأهمية علمية محددة، يمكن أن النهج الأكثر ملاءمة تتراوح بين الثقافات myotube مركزيا بسيطة لمجمع في النماذج الحية ^3-6.

والهدف من هذا البروتوكول هو توفير نظام في المختبر التي تسمح لرصد تكون العضل من خلال التصوير الحي والمناعي. بالمقارنة مع الأساليب التقليدية، وهذا النظام يوفر نظرة كاملة جدا وحيوية في عملية عضلي الماوس. يمكن اتباعها الخلايا من مرحلة بالخلايا العضلية الجذعية إلى ناضجة، ليف عضلي متعددة النوى عرض الثلاثيات متقاطع ونوى الطرفية ^7. هذا المستوى النضج يمكنيمكن تحقيقه باستخدام معدات زراعة الخلايا العادية، دون الحاجة إلى أجهزة تنشيطية أو الميكانيكية المعقدة. وعلى الرغم من بعض النجاح في أنظمة المختبر تم الإبلاغ ^8،9، على حد علمنا، هذا هو البروتوكول الوحيد توليد myofibers الماوس ناضجة مع تي الأنابيب يقترن عرضيا مع العضلية شبكية (SR). وبالتالي، فإن هذا النظام في المختبر يمكن أن تستخدم لدراسة الآليات الجزيئية لتشكيل الثالوث، التي لا تزال غير مفهومة ^10.

وثمة ميزة أخرى لاستخدام هذا النظام هو توافر الموارد المستهدفة الماوس التحقق من صحتها، مثل الأجسام المضادة، والأدوية، والأدوات رني. لا يتطلب بروتوكول بسيط نسبيا خطوات شاقة، والتلاعب من ذوي المهارات العالية، أو معدات باهظة الثمن ومخصصة. تبدأ myofibers نضجت تظهر بعد 5 د للثقافة التمايز ^7، وعرض انقباض جانب الشرر الكالسيوم (بيانات غير منشورة). في أسبوع واحد، وتطوير مختلفآل مراحل إحدى الخلايا الأكثر تعقيدا في جسم الثدييات يمكن دراستها بالاشتراك مع مجموعة متنوعة من فحوصات في المختبر.

Protocol

ملاحظة: واحد عوائد الماوس myoblasts كافية لما يقرب من 35 أطباق مم أو طبقين الحية التصوير، لذلك mattings الخطة، تشريح، وطلاء (الخطوة 2.6) وفقا لذلك. منذ يتم عزل myoblasts من خلال centrifugations متسلسل وpreplating، وينبغي أن يتم ذلك البروتوكول ودفعات من 5-10 الحيوانات.

وقد وافق جميع الإجراءات التي تجرى على الحيوانات من قبل لجنة الأخلاقيات الحيوانية في معهد لطب الجزيئي وجامعة بيير وماري كوري

1. تشريح الفئران حديثي الولادة عضلات هند الأطراف الاصطناعية

1. إعداد جميع الحلول مقدما (مواد الجدول) وتعقيم عن طريق الترشيح (0.22 ميكرون فلتر). تأكد من أن جميع وسائل الإعلام هي عند 37 درجة مئوية قبل إضافة إلى الخلايا، فيما عدا المستحضرات التي تحتوي على قبو غشاء المصفوفة (على سبيل المثال، Matrigel).
2. تعقيم المواد تشريح (واحد لكل من: مقص منحني، مقص مستقيم، ملقط العادية،وملقط غرامة طرف) ومقاعد البدلاء العمل بمسحها مع 70٪ من الإيثانول.
3. إعداد طبق بتري 100 ملم مع 5 مل من Dulbecco والفوسفات مخزنة المالحة (DPBS) لجمع العضلات والحفاظ على الجليد حتى الخطوة تنميق.
4. قطع رأس P6 - P8 الفئران مع المقص مباشرة وتعقيم الجلد مع الايثانول 70٪.
5. إجراء شق في الجلد مرة أخرى وسحب بلطف نحو أطرافه الخلفية حتى تتم إزالته، وفضح تماما العضلات الخلفية الأطراف الاصطناعية.
6. استخدام الملقط لإزالة الأنسجة الدهنية دون الإضرار العضلات.
7. لإزالة العضلات الظهرية هند الأطراف الاصطناعية، والحفاظ على أطرافهم امتدت وثني مخلب لفضح الأوتار كعب. استخدام مقص منحني إلى العضلات منفصلة من العظام، بدءا من الأوتار، عن طريق تحريك بلطف وقطع صعودا. استئصال العضلات ووضعها في DPBS مثلج.
8. عزل عضلات الفخذ عن طريق معسر العضلات مع ملقط غرامة طرف وقطع حوله دون الإضرار عظم الفخذ أو مفصل الركبة.
9. بعد تشريح جميع الحيوانات، والمضي قدما إلى معقم غطاء تدفق الصفحي ثقافة الخلية، حيث يجب أن يتم تنفيذ كافة الخطوات التالية.

2. بالخلايا العضلية الجذعية عزل

1. إزالة الفائض من DPBS. اللحم المفروم مع النسيج المقص منحنية تعقيمها من أجل الحصول على كتلة موحدة.
2. جمع الأنسجة المفروم في أنبوب الطرد المركزي 50 مل المخروطية باستخدام 5 مل من مزيج الهضم واحتضان مع الانفعالات عند 37 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة.
3. وقف عملية الهضم عن طريق إضافة 6 مل من تشريح المتوسطة وأجهزة الطرد المركزي تعليق لمدة 5 دقائق في 75 x ج لتكوير الأنسجة المتبقية.
4. بعناية جمع طاف. تأكد من عدم جمع الحطام الأنسجة. أجهزة الطرد المركزي لذلك في 350 x ج لمدة 5 دقائق. و resuspend في 5 مل من المتوسط ​​تشريح.
5. تصفية تعليق الخلية من خلال مصفاة الخلية 40 ميكرون. إضافة 25 مل من المتوسط تشريح وpreplate في صحن 150 ملم لمدة 4 ساعات في حاضنة الثقافة الخلية (37 درجة مئوية و 5٪ CO _{2 <}/ دون>) للسماح للالليفية على الانضمام.
6. في حين preplating، أطباق معطف مع 500 ميكرولتر من بدروم غشاء مصفوفة المخفف 1: 100 في IMDM البارد لمدة 1 ساعة على RT. يغسل مرة واحدة مع DPBS ولوحة الخلايا على الفور (خطوة 2.8) أو ترك مع متوسط ​​النمو حتى الطلاء.
7. بعد preplating، وجمع طاف وأجهزة الطرد المركزي لذلك في 350 x ج لمدة 10 دقيقة.
8. و resuspend في وسط النمو والاعتماد على الخلايا على عدادة الكريات. ضبط مستوى الصوت بحيث يتم مطلي بين 150،000 و 250،000 الخلايا في الغشاء القاعدي طبق المغلفة المصفوفة. إبقاء الخلايا في حاضنة الثقافة الخلية.

3. ليف عضلي التمايز

ملاحظة: بعد 3 د، يجب أن الخلايا تبدأ في الصمامات وشكل myotubes في حوالي 70٪ confluency (الشكل 1B).

1. عند هذه النقطة، transfect الخلايا، إذا رغبت في ذلك، مع سيرنا أو الحمض النووي من الفائدة. إذا لا ينبغي transfected الخلايا، وتغيير مباشرة إلى التمايز المتوسطة والتزلج على الجليدp لخطوة 3.4.
2. Transfect مع الكواشف ترنسفكأيشن باتباع إرشادات الشركة المصنعة. احتضان الخلايا لمدة 5 ساعات مع المجمعات سيرنا الدهون (20 نانومتر + 1 ميكرولتر من كاشف) أو المجمعات الحمض النووي الدهون (1 ميكروغرام + 1 ميكرولتر من كاشف). تحسين تركيز سيرنا والحمض النووي إذا لزم الأمر.
3. غسلها مرة واحدة مع متوسط ​​التمايز ومن ثم التبديل إلى متوسطة التمايز الجديد.
4. في اليوم التالي، وتمييع الطابق السفلي غشاء المصفوفة 1: 2 في الجليد الباردة التمايز المتوسطة. إزالة المتوسطة القائمة وإضافة 200 ميكرولتر من المصفوفة الجليد الباردة إلى كل طبق.
5. احتضان لمدة 30 دقيقة في حاضنة الثقافة الخلية.
6. تكملة متوسطة التمايز مع أجرين AGRIN (100 نانوغرام / مل) وإضافة بعناية 2 مل إلى الخلايا.
7. بعناية تغيير نصف المتوسط ​​كل د 2، المكمل دائما مع أجرين AGRIN إلى تركيز النهائي من 100 نانوغرام / ميكرولتر.
8. مراقبة تمايز الخلايا وقدرتها على البقاء. اعتمادا على مجموعة متنوعة من العوامل (مثل FBS وجhicken أصول استخراج الجنين)، والخلايا قد يستغرق ما بين 5-10 التمايز د للوصول إلى النضج الكامل (الشكل 2).

4. المناعية في أطباق الزجاج السفلي

1. لالمناعية، في أي وقت نقطة من الفائدة، وغسل خلايا مرة واحدة مع DPBS واصلاحها مع PFA 4٪ في RT لمدة 10 دقيقة.
2. غسلها مرتين مع DPBS. في هذه المرحلة، والخلايا ويمكن تخزينها في 4 درجة مئوية.
3. Permeabilize لهم مع 0.5٪ تريتون X-100 لمدة 5 دقائق على RT.
4. غسلها مرتين مع برنامج تلفزيوني ومنع مع عرقلة الحل لمدة 30 دقيقة في RT.
5. احتضان لهم مع الأجسام المضادة الأولية مخففة في عرقلة الحل O / N عند 4 درجات مئوية.
6. غسل 3X مع DPBS لمدة 5 دقائق على RT.
7. احتضان لهم مع الأجسام المضادة الثانوية و 0.2 ميكروغرام / مل من دابي لمدة 1 ساعة على RT.
8. غسل 3X مع DPBS لمدة 5 دقائق على RT.
9. إضافة 200 ميكرولتر من المتوسطة المتزايدة، والشروع في التصوير.

النتائج

يتم تحديد مدى التطور ليف عضلي في الغالب من قبل نقاء وبقاء myoblasts معزولة. يمكن استخدام التصاق، والانتشار، والقدرة على الاندماج للوصول تجريبيا تلك المعلمات (الشكل 1 أ، ب). في انتشار D2، يجب myoblasts انضمت ويجب عرض شكل مغزلي نموذجي. ومن المتوقع أن يحدث على نطاق واسع في هذه المرحلة، مما يؤدي إلى تشكيل myotube مركزيا عفوية في اليوم التالي (الشكل 1B) انتشار الأسلحة النووية.

confluency خلية قد تحتاج تعديلات طفيفة. ينبغي زيادة إذا myoblasts تأخذ أكثر من 3 d لتتكاثر والصمامات. يجب أن انخفض ذلك إذا لم يتم السماح myofibers على النمو واستطال مباشرة نسبيا نظرا لكثافتها. Confluency يقلل عادة من المركز إلى المحيط الخارجي للصحن، لذلك يجب أن يتم العثور على أفضل myofibers نحو المناطق الخارجية.

سوف Myotubes استطال بسرعة وعرض متعددة النوى الانحياز مركزيا (الشكل 1C). بواسطة D5، بعض الخلايا تبدأ الحصول على التصدعات ونقل النواة إلى المحيط. فإن عدد myofibers مع خصائص ناضجة زيادة مع مرور الوقت وكذلك مع سمك الخلية (1D الشكل).

درجة التمايز يمكن زيادة احظ المناعي. Myofibers الثابتة في التمايز D8 الثلاثيات الحالي مستعرضة. ويمكن التأكد من ذلك عن طريق تصوير مكونات T-الأنابيب (DPHR) وريال (triadin)، التي من المتوقع أن colocalize في الثلاثيات (الشكل 2).

وظائف myofibers يمكن معالجتها عن طريق التصوير الحي. من التمايز D3 فصاعدا، وتعرض الخلايا الوخز عفوية. قبل transfecting جهاز استشعار الكالسيوم (على سبيل المثال.، GCaMP6f ^11)، فمن الممكن أن نلاحظ أن الانقباضات تقترن مع قمم الكالسيوم (الشكل 3).

باستخدام هذا النظام، تمكنا من تحديد المسار الجزيئي الرواية التي تتعطل في اعتلال العضلات centronuclear وضمور العضلي، والتي يمكن بالتالي أن يكون الهدف رواية عن العلاجات الجزيئية مبتكرة ^7. تكيفنا أيضا هذا الأسلوب لدراسة تطوير الوصل العصبي العضلي (NMJ) ^12. من خلال coculture مع الفئران Explants النخاع الشوكي، التي وصفناها دور للداينين في تشكيل NMJ ^13.

الشكل 1: مراحل تطور ثقافة بالخلايا العضلية الجذعية. أ) في انتشار D2، انضمت myoblasts وبدأت تنتشر. ب) في prolifووصل إلى 80٪، وmyoblasts بدء دمج عفويا - eration D3، وconfluency 60. C) في D3 التمايز، myotubes تحتوي على نوى موقعا مركزيا والسائد. D) من التمايز D5 فصاعدا (على سبيل المثال، يوم 8)، myofibers تبدأ العارضة التصدعات ونوى المحيطية وتبدأ في رشاقته. شريط الحجم: 50 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: الممثل متحد البؤر صورة من D8 ليف عضلي Immunostain. أ) المناعية للديهيدروبيريدين مستقبلات (DHPR، أعلى لوحة) وtriadin (TRDN، وسط لوحة). تراكب القنوات DHPR، TRDN، ودابي يظهر colocalization من مكونات الثالوث. B) ملف تعريف كثافة من الخط الأصفر تعادل في A. C) صورة 3D من حجم جعل من myofibers الملون لα-actinin (الخضراء) ودابي (الأزرق). نطاق شريط وشبكة العرض: 5 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 3: تصوير لايف مستويات الكالسيوم في Myofibers مع عفوية الوخز. أ) عالية السرعة الوقت الفاصل بين (20 مللي إطارات) المجهري شرارة الكالسيوم في ليف عضلي الوخز. تم الكشف عن الكالسيوم من خلال التعبير عن GCaMP6f (Addgene البلازميد # 40755). B) الكمي لكثافة مضان مع مرور الوقت لاستشعار الكالسيوم في لوحة A._blank "> اضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

استخدام هذا البروتوكول لزراعة myoblasts الأولية يثير مكانة خاصة التي تغذي بشكل كبير في تطوير myofibers. ومن المقرر جزئيا إلى أنواع أخرى من الخلايا التي هي أيضا موجودة بأعداد قليلة جدا هذا. يجب تحقيق التوازن بين تركيز بالخلايا العضلية الجذعية ونقاء الثقافة. يعتمد ثقافة خلية جيدة أيضا على نوعية المنتجات المستخدمة لصياغة المتوسطة. جميع المنتجات المشتقة من مصادر حيوانية يجب اختبارها بدقة. في تجربتنا، وينبغي أيضا أن تراقب الأوضاع الهضم.

كالعادة للثقافات الأولية، يمكن أن تقلب التجريبية تكون أعلى مما كانت عليه في الدراسات مع الألياف معزولة أو myoblasts خلد. هذا التغير يمكن أن تقلص من توحيد مكونات المتوسطة والهضم، والفئران العمر والحجم، والنقاط الزمنية للتلاعب الثقافة وجمع النتائج. ومع ذلك، والاستفادة من التدقيق في الوقت الحقيقي آليات معقدةاللازمة لنمو ليف عضلي يفوق كثيرا من العيب التباين.

هذا البروتوكول يمنح مزايا في المختبر النهج دون المساس تمايز الخلايا. تنضج Myofibers حتى تتشكل الثلاثيات وتقترن تقلصات إلى الشرر الكالسيوم. هذه المخرجات الوظيفية يمكن الوصول إليها في ظروف تجريبية مختلفة. وعلاوة على ذلك، يمكن أن يكون هناك العديد من الاختلافات التقنية التي أدخلت على البروتوكول. Myoblasts يمكن أن تحصد من الفئران حديثي الولادة مع الطفرات المصالح المتعلقة تنمية العضلات. الخلايا يمكن هي lysed لتحليل الكيمياء الحيوية في مختلف نقاط وقت التمايز. يمكن إضافة المؤشرات الكالسيوم للثقافة لمتابعة دينامياتها. بنيات علم البصريات الوراثي يمكن استخدامها لتنفيذ بعض مسارات الإشارات أو للحث على الاستجابات المحلية المحددة. وأخيرا، فإن myofibers يمكن cocultured مع أنواع الخلايا الأخرى لدراسة تفاعلاتها.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dispase II	Gibco	17105041
Collagenase type V	Sigma-Aldrich-Aldrich	C9263
IMDM, Glutamax supplemented	Gibco	31980022
Matrigel Growth reduced factor	Corning	354230	protein concentration of the lot should be around 10 mg/mL and endotoxin result should be <1.5
Chicken Embryo Extract	MP biomedical	2850145	it is also possible to prepare in the lab (Danoviz ME, Yablonka-Reuveni Z. Methods Mol Biol (2012))
Recombinant rat agrin	R&D systems	550-AG-100
Penicillin/Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122
Horse Serum	GE Healthcare	11581831
Lipofectamine RNAiMAX	Invitrogen	13778-150	used to transfect siRNA
Lipofectamine LTX	Invitrogen	15338-100	used to transfect DNA
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668030	used to transfect siRNA plus DNA
DPBS	Gibco	14190094
Fetal Bovine Serum (FBS)	Eurobio	CVFSVF0001
Cell strainer	Corning	21008-949
Fluorodishes	World precision instruments	FD35-100	dishes used to cultivate cells for live imaging
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284
16% PFA (Paraformaldehyde)	Science Services GmbH	E15710
Goat Serum	Sigma-Aldrich	G9023
BSA (Bovine Serum Albumine)	Sigma-Aldrich	A7906
Saponine	Sigma-Aldrich	47036
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542	use at 200 ng/µL
Fluoromount-G	SouthernBiotech	0100-01
Name	Company	Catalog Number	Comments
Solutions and Media
Digestion Mix			in DPBS 5 mg/mL collagenase 3.5 mg/mL dispase sterile filtered, can be stored in working aliquotes for 2 weeks at -20 °C
Dissection Medium			in IMDM Glutamax supplemented 10% FBS 1% Penicillin/Streptomycin sterile filtered
Growth Medium			in IMDM Glutamax supplemented 20% FBS 1% Chicken Embryo Extract 1% Penicillin-Streptomycin sterile filtered
Differentiation Medium			in IMDM Glutamax supplemented 2% Horse Serum 1% Penicillin-Streptomycin sterile filtered
Blocking Solution			in DPBS 10% Goat Serum 5% BSA add 0.1% saponine when incubating with primary and secondary antibodies