במבחנת הבידול של בוגרות Myofibers עבור הדמיה חיה

Summary

Muscle cells are among the most complex eukaryotic cells. We present a protocol for the in vitro differentiation of highly mature myofibers that allows for genetic manipulation and clear imaging during all developmental stages.

Abstract

שרירי השלד מורכבים myofibers, התאים הגדולים בגופם של יונקים ואחד הבודדים syncytia. כיצד מבנים מורכבים מבחינה אבולוציונית משומר שמרכיבים אותו הם התאספו נשאר תחת חקירה. התכונות גודל והפיזיולוגיות שלהם לעתים קרובות להגביל יישומי מניפולציה והדמיה. תרבות שורות תאים הנציחו נעשתה שימוש נרחב, אבל זה יכול רק לשכפל את השלבים המוקדמים של בידול.

כאן אנו מתארים פרוטוקול המאפשר מניפולציה גנטית קלה של myofibers שמקורם myoblasts עכבר העיקרי. לאחר שבוע של בידול, את myofibers להציג התכווצות, מיושר סרקומר ואת שלשות, וכן גרעיני פריפריה. תהליך ההתמיינות כולו ניתן ואחריו הדמיה או immunofluorescence חיים. מערכת זו משלבת את היתרונות של vivo לשעבר קיימים פרוטוקולים במבחנה. האפשרות של transfection קל ויעיל כמו גםההקלות של גישה לכל שלבי הבידול מרחיבות את היישומים האפשריים. Myofibers יכול לאחר מכן לשמש לא רק כדי לענות על שאלות בביולוגיה התפתחותית תא רלוונטיות, אלא גם כדי לשחזר פנוטיפים מחלת שריר עבור יישומים קליניים.

Introduction

שרירי שלד מלחינים עד 40% ממשקל הגוף האנושי ^1. הפרעות קשורות שרירים מייצגות בריאות עצומה ניטל כלכלי ^2. איך זה מאוד רקמות מורכבות מאורגנות נוצרה, נשמרו, מחדש מהווה שדה מחקר מקיף ומבוסס. בהתאם העניין המדעי הספציפי, הגישה המתאימה ביותר יכולה לנוע בין תרבויות myotube פשוטות אל מסובך במודלי vivo ^{3 - 6.}

מטרת פרוטוקול זה היא לספק מערכת במבחנה המאפשר ניטור של myogenesis באמצעות הדמיה חיה immunofluorescence. לעומת גישות מסורתיות, מערכת זו מציעה תובנה מלא ודינמי מאוד לתהליך העכבר myogenic. תאים ניתן בעקבות משלב myoblast אל myofiber הבוגר, multinucleated מוצג שלשות משוכלות וגרעינים היקפיים ^7. רמת התבגרות זה יכוללהיות מושגת באמצעות ציוד תרבית תאים רגילים, ללא צורך למיכשור גירוי או מכני מורכב. למרות שחלק מוצלח במערכות חוץ גופייה דווח ^8,9, למיטב ידיעתנו, זהו הפרוטוקול בלבד שהניב myofibers עכבר בוגר עם T-tubules לזווג transversally עם sarcoplasmic הרטיקולום (SR). לפיכך, מערכת במבחנה זה יכול לשמש כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים של היווצרות שלישייה, שעדיין לא ידוע ולא מובנים ^10.

יתרון נוסף של שימוש במערכת זו הוא הזמינות של משאבי עכבר במיקוד תוקף, כגון נוגדנים, סמים וכלי RNAi. הפרוטוקול פשוט יחסית ואינו דורש צעדים מדוקדקים, מניפולציה מיומנת, או ציוד יקר ומסור. Myofibers התבגר להתחיל להופיע לאחר 5 ד של בידול תרבות ^7, מוצג contractility יחד עם ניצוצות סידן (נתונים שלא פורסמו). בשבוע אחד, הפיתוח השונהבשלבים אל אחד התאים המורכבים ביותר בגוף היונק ניתן ללמוד בשילוב עם מגוון רחב של מבחני חוץ גופייה.

Protocol

הערה: myoblasts מספיק תשואות עכבר אחת עבור כשני 35 מנות מ"מ או שתי מנות חי-הדמיה, כך תוכנית Mattings, לנתיחה, וציפוי (שלב 2.6) בהתאם. מאז myoblasts מבודד באמצעות centrifugations רציפי preplating, הפרוטוקול צריך להיעשות בקבוצות של 5 - 10 חיות.

כל הנהלים הקשורים בנושאים בעלי חיים אושרו על ידי ועדת האתיקה החי מולקולרית Instituto de Medicina ו et אוניברסיטת פייר ומארי קירי

1. Dissection של עכברי ילודי שרירים הינד גפה

1. הכן את כל פתרונות מראש (לוח חומרים) לעקר ידי סינון (0.22 מיקרומטר מסנן). ודא שכל התקשורת על 37 מעלות צלזיוס לפני בנוסף התאים, למעט הניסוחים המכילים מטריקס קרום במרתף (למשל, Matrigel).
2. לעקר את החומר דיסקציה (אחד לכל אחד: מספריים מעוקלים, מספריים ישר, מלקחיים קבועים,ו-טיפ נאה מלקחיים) וספסל העבודה על ידי מנגב אותם עם 70% אתנול.
3. הכינו צלחת פטרי 100 מ"מ עם 5 מ"ל של בופר פוספט של Dulbecco (DPBS) לאיסוף שריר ולשמור על הקרח עד צעד זהיר.
4. לערוף P6 - עכברים P8 עם מספריים ישר לעקר את העור עם אתנול 70%.
5. עושים חתך בעור הגב ולמשוך אותו בעדינות לכיוון הגפיים האחוריות עד להסרתו, חושף לגמרי את שרירי הגפיים האחוריות.
6. השתמש במלקחיים כדי להסיר רקמות שומן מבלי לפגוע בשרירים.
7. כדי להסיר את שרירי הגפיים אחוריים הגבה, לשמור על האיבר נמתח לכופף את הכף לחשוף את הגידים בעקב. השתמש במספריים מעוגלים שריר נפרד מן העצם, החל גידים, על ידי הזזה בעדינות חיתוך כלפי מעלה. ובלו השרירים ומניחים אותם DPBS הקר.
8. לבודד את הארבעה על ידי צובט את השריר עם מלקחיים בסדר-קצה החיתוך סביב אותו מבלי לפגוע עצם הירך או מפרק הברך.
9. לאחר לנתח כל בעלי החיים, המשך ברדס תרבית תאי זרימה למינרית סטרילי, שבו כל השלבים הבאים יש לבצע.

בידוד myoblast 2.

1. סר העודף DPBS. לרכך את הרקמה במספריים מעוגלים מעוקרים כדי להשיג מסה אחידה.
2. אסוף את הרקמות הטחונות ב צינור צנטריפוגות חרוטי 50 מיליליטר באמצעות 5 מיליליטר של תערובת עיכול דגירה אותו עם תסיסה על 37 מעלות צלזיוס במשך 90 דקות.
3. עצור את מערכת העיכול על ידי הוספת 6 מ"ל של מדיום לנתיחה צנטריפוגות ההשעיה למשך 5 דקות ב 75 XG כדי גלולה הרקמה הנותרת.
4. בזהירות לאסוף את supernatant. ודא שלא לאסוף פסולת רקמות. צנטריפוגה זה ב 350 XG במשך 5 דקות; resuspend את זה ב 5 מ"ל של מדיום לנתיחה.
5. סנן את ההשעיה התא דרך מסננת תא 40 מיקרומטר. הוסף 25 מ"ל של מדיום לנתיחה preplate אותו בצלחת 150 מ"מ של 4 שעות בתוך חממה תרבית תאים (37 מעלות צלזיוס, 5% CO _{2 <}תת />) כדי לאפשר fibroblasts לדבוק.
6. בעוד preplating, מנות מעיילות עם 500 μL של מטריקס קרום במרתף מדולל 1: 100 ב IMDM הקר למשך 1 שעות ב RT. שטפי פעם עם DPBS ואת צלחת התאים מיד (שלב 2.8) או לעזוב עם מדיום הגידול עד ציפוי.
7. אחרי preplating, לאסוף את supernatant ו צנטריפוגות זה ב XG 350 במשך 10 דקות.
8. Resuspend זה במדיום הגידול לספור את התאים על hemocytometer. התאם את עוצמת הקול כך בין 150,000 ו 250,000 תאים מצופים לכל צלחת מטריקס מצופה קרום במרתף. שמור את התאים בתוך תרבית תאי חממה.

3. בידול Myofiber

הערה: לאחר 3 ד, התאים צריכים להתחיל פתיל והצורה myotubes בסביבות 70% confluency (איור 1B).

1. בשלב זה, transfect התאים, אם תרצה בכך, עם siRNA או DNA של עניין. אם התאים אינם להיות transfected, לשנות ישירות בינוני בידול סקיp לשלב 3.4.
2. Transfect עם ריאגנטים transfection בעקבות הוראות היצרן. דגירה התאים למשך 5 שעות עם מתחמי siRNA שומנים בדם (20 ננומטר + 1 μL של מגיב) או מתחמי השומנים-DNA (1 מיקרוגרם + 1 μL של מגיב). מטב את ריכוזי siRNA ו- DNA במידת הצורך.
3. לשטוף אותם פעם עם בינוני בידול ולאחר מכן לעבור בינוני בידול חדש.
4. למחרת, לדלל את מטריקס קרום במרתף 1: 2 במדיום בידול קר כקרח. הסר את המדיום הקיים ולהוסיף 200 μL של מטריקס קר כקרח על כל מנה.
5. דגירה במשך 30 דקות בתוך תרבית תאי חממה.
6. מוסף המדיום בידול עם Agrin (100 ng / mL) ובזהירות מוסיפים 2 מ"ל לתאים.
7. בזהירות לשנות מחצית בינונית כל 2 ד, תמיד להשלים עם Agrin לריכוז סופי של 100 ng / μL.
8. צג בידול כדאיות התא. בהתאם למגוון גורמים (כמו FBS ו גhicken לחלץ עובר מקורות), התאים עלולים לקחת בין 5 - 10 בידול ד להגיע התבגרות מלאה (איור 2).

4. Immunostaining במנות זכוכית תחתונות

1. עבור immunostaining, בכל עת-נקודת עניין, לשטוף את התאים פעם עם DPBS ולתקן אותן עם 4% PFA ב RT במשך 10 דקות.
2. לשטוף אותם פעמיים עם DPBS. בשלב זה, התאים ניתן לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס.
3. Permeabilize אותם עם 0.5% Triton X-100 במשך 5 דקות ב RT.
4. לשטוף אותם פעמיים עם PBS ולחסום עם חסימת פתרון 30 דקות ב RT.
5. דגירה אותם עם נוגדן ראשוני מדולל חסימת פתרון O / N ב 4 ° C..
6. 3x לשטוף עם DPBS במשך 5 דקות ב RT.
7. דגירה אותם עם נוגדנים משני 0.2 מיקרוגרם / מ"ל ​​של DAPI עבור 1 ש 'ב RT.
8. 3x לשטוף עם DPBS במשך 5 דקות ב RT.
9. הוספת 200 μL של המדיום גובר והמשך הדמיה.

תוצאות

היקף פיתוח myofiber נקבע בעיקר על ידי טוהר הכדאיות של myoblasts המבודד. ההידבקות, ההתפשטות, ויכולת ההיתוך ניתן להשתמש כדי לגשת באופן אמפירי הפרמטרים האלה (איור 1 א ', ב). בשעת ההתפשטות D2, myoblasts צריך דבק והם אמורים להציג את צורת כישורים הטיפוסית. הפצת צפוי לקרות בהרחבה בשלב זה, המוביל להיווצרות myotube ספונטנית למחרת (איור 1B).

תא confluency שיהיה עליך לערוך בהם שינויים קלים. זה צריך להיות מוגבר אם myoblasts לקחת יותר מ -3 D להתרבות פתיל. זה צריך להיות ירידה אם myofibers אינו מורשה לגדול להאריך יחסית ישר עקב הצפיפות שלהם. Confluency בדרך כלל פוחתת מהמרכז אל הפריפריה של המנה, כך myofibers הטוב ביותר צריך להימצא לעבר האזורים החיצוניים.

Myotubes יהיה להאריך במהירות מרובה תצוגת גרעינים מיושרים מרכזי (תרשים 1C). על ידי D5, כמה תאים להתחיל לרכוש פסים ומרגש הגרעינים שלהם לפריפריה. מספר myofibers עם מאפיינים בוגרים יגדל עם זמן, כמו גם עם עובי תא (האיור 1D).

מידת הבידול ניתן להבחין עוד יותר על ידי immunofluorescence. Myofibers קבועה שלשות משוכלות נוכחי בידול D8. זה יכול להיות מאושר על ידי רכיבי הדמיה של T-tubules (DPHR) ואת SR (triadin), אשר צפויים colocalize על השלשות (איור 2).

הפונקציונליות של myofibers ניתן לטפל על ידי הדמיה לחיות. מתוך בידול D3 ואילך, התאים להציג עוויתות ספונטנית. על ידי transfecting חיישן סידן (למשל., GCaMP6f ^11), אפשר לצפות כי הצירים הם מצמידים עם פסגות סידן (איור 3).

באמצעות מערכת זו, הצלחנו לזהות מסלול מולקולרי רומן מופר ב myopathies centronuclear ו dystrophies myotonic, ולפיכך יכולה להיות מטרת רומן עבור טיפולים מולקולריים חדשניים ^7. גם אנחנו צריכים להתאים את השיטה בחקר התפתחות צומת עצב-שריר (NMJ) ^12. דרך coculture עם explants בחוט השדרה של חולדה, שתיארנו תפקיד dynein במבנה NMJ ^13.

איור 1: שלבי ההתפתחות של תרבות myoblast. א) בשעת ההתפשטות D2, myoblasts דבק וחל מתרבה. ב) proliferation D3, confluency של 60 - 80% הגיע לסיומה, myoblasts להתחיל פיוזינג ספונטני. ג) בשעה בידול D3, myotubes המכיל גרעינים במיקום מרכזי הם השולט. D) מתוך בידול D5 ואילך (למשל, יום 8), myofibers להתחיל מפגין תלמים וגרעינים היקפי ולהתחיל להתעבות. סרגל קנה מידה: 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2: תמונה Confocal נציג של D8 Myofiber immunostain. א) Immunostaining עבור קולטן dihydropyridine (DHPR, הפאנל העליון) ואת triadin (TRDN, פאנל באמצע). כיסוי של DHPR, TRDN, וערוצי DAPI תערוכות colocalization של רכיבי השלישייה. B) פרופיל עוצמת הקו הצהוב נמשך בדו א) תמונת 3D של טיוח נפח של myofibers מוכתם עבור α-actinin (ירוק) ו DAPI (כחול). רוחב בר ורשת Scale: 5 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3: הדמיה חיה של רמות הסידן Myofibers עם ספונטנית מתעוות. א) זמן לשגות מהיר (20 מסגרות ms) מיקרוסקופיה של ניצוץ סידן בתוך myofiber מתעוות. סידן אותר דרך הביטוי של GCaMP6f (Addgene פלסמיד # 40,755). כימות B) של עוצמת הקרינה לאורך זמן עבור חיישן סידן א פאנל_blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

השימוש בפרוטוקול זה לגידול של myoblasts העיקרי מוליד נישה מיוחדת שבגדול המטפחת את התפתחות myofibers. זה נובע בחלקו סוגי תאים אחרים נוכחים גם במספרים קטנים מאוד. איזון בין ריכוז myoblast וטוהר התרבות חייב להיות מושגת. תרבית תאים טובה גם תלויה באיכות של המוצרים המשמשים לגיבוש הבינוני. הכל מוצרים שמקורם מן החי צריך להיבדק ביסודיות. מניסיוננו, תנאי העיכול צריכים גם להיות במעקב.

כרגיל עבור תרבויות עיקריות, השתנות ניסיוני יכולה להיות גבוהה יותר מאשר במחקרים עם סיבים מבודדים או myoblasts הונצח. השתנות זו יכולה להצטמצם על ידי סטנדרטיזציה של רכיבים בינוני ועיכול, גיל עכברים וגודל, ואת נקודות זמן מניפולציה התרבות ואיסוף התוצאות. עם זאת, היתרון של בוחן בזמן אמת את המנגנונים המורכביםנחוץ להתפתחות myofiber עולה על חסרון ההשתנות מאוד.

פרוטוקול זה מקנה את היתרונות של גישות במבחנה מבלי להתפשר התמיינות תאים. Myofibers להבשיל עד השלשות נוצרות התכווצויות הם מצמידים את ניצוצות סידן. פלטים פונקציונליים אלה ניתן לגשת בתנאי ניסוי שונים. יתר על כן, ייתכנו שינויים טכניים רבים שנעשו בפרוטוקול. Myoblasts ניתן לקצור מעכברים בילוד עם מוטציות של עניין הנוגע להתפתחות השריר. תאים יכולים להיות lysed לאנליזה ביוכימית בנקודות זמן בידול שונות. האינדיקטורים סידן ניתן להוסיף לתרבות לעקוב הדינמיקה שלה. בונה optogenetic ניתן להשתמש כדי לאכוף מסלולי איתות מסוים או כדי לגרום לתגובות מקומיות ספציפיות. לבסוף, myofibers ניתן cocultured עם סוגי תאים אחרים כדי לחקור אינטראקציות שלהם.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dispase II	Gibco	17105041
Collagenase type V	Sigma-Aldrich-Aldrich	C9263
IMDM, Glutamax supplemented	Gibco	31980022
Matrigel Growth reduced factor	Corning	354230	protein concentration of the lot should be around 10 mg/mL and endotoxin result should be <1.5
Chicken Embryo Extract	MP biomedical	2850145	it is also possible to prepare in the lab (Danoviz ME, Yablonka-Reuveni Z. Methods Mol Biol (2012))
Recombinant rat agrin	R&D systems	550-AG-100
Penicillin/Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122
Horse Serum	GE Healthcare	11581831
Lipofectamine RNAiMAX	Invitrogen	13778-150	used to transfect siRNA
Lipofectamine LTX	Invitrogen	15338-100	used to transfect DNA
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668030	used to transfect siRNA plus DNA
DPBS	Gibco	14190094
Fetal Bovine Serum (FBS)	Eurobio	CVFSVF0001
Cell strainer	Corning	21008-949
Fluorodishes	World precision instruments	FD35-100	dishes used to cultivate cells for live imaging
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284
16% PFA (Paraformaldehyde)	Science Services GmbH	E15710
Goat Serum	Sigma-Aldrich	G9023
BSA (Bovine Serum Albumine)	Sigma-Aldrich	A7906
Saponine	Sigma-Aldrich	47036
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542	use at 200 ng/µL
Fluoromount-G	SouthernBiotech	0100-01
Name	Company	Catalog Number	Comments
Solutions and Media
Digestion Mix			in DPBS 5 mg/mL collagenase 3.5 mg/mL dispase sterile filtered, can be stored in working aliquotes for 2 weeks at -20 °C
Dissection Medium			in IMDM Glutamax supplemented 10% FBS 1% Penicillin/Streptomycin sterile filtered
Growth Medium			in IMDM Glutamax supplemented 20% FBS 1% Chicken Embryo Extract 1% Penicillin-Streptomycin sterile filtered
Differentiation Medium			in IMDM Glutamax supplemented 2% Horse Serum 1% Penicillin-Streptomycin sterile filtered
Blocking Solution			in DPBS 10% Goat Serum 5% BSA add 0.1% saponine when incubating with primary and secondary antibodies