Canlı Görüntüleme Olgun Myofibers İn Vitro Farklılaşma içinde

Özet

Muscle cells are among the most complex eukaryotic cells. We present a protocol for the in vitro differentiation of highly mature myofibers that allows for genetic manipulation and clear imaging during all developmental stages.

Özet

İskelet kas myofibers, büyük memeli vücudundaki hücrelerin ve çok az sinsitya birine oluşmaktadır. Nasıl oluşturan karmaşık ve evrimsel olarak korunmuş yapılar monte edilir soruşturma altında kalır. Onların büyüklüğü ve fizyolojik özellikleri genellikle manipülasyon ve görüntüleme uygulamaları kısıtlamaktadır. ölümsüzleştirilmiş hücre soylarının kültür yaygın olarak kullanılmaktadır, ancak tek fark, erken aşamaları çoğaltabilir.

Burada, birincil fare miyoblastların kaynaklanan myofibers kolay genetik manipülasyon sağlayan bir protokol açıklar. farklılaşma, bir hafta sonra, myofibers kontraktilite hizalanır sarkomer ve üçlüleri, hem de periferal çekirdek gösterir. Tüm farklılaşma süreci canlı görüntüleme veya immünofloresan ile takip edilebilir. Bu sistem, mevcut ex vivo ve in vitro protokollerinde avantajlarını birleştirir. kolay ve etkin bir transfeksiyon olasılığı olaraktüm farklılaşma aşamaları erişim kolaylığı potansiyel uygulamalarını genişletmektedir. Myofibers sonra, ilgili gelişimsel ve hücre biyolojisi soruları için değil, aynı zamanda klinik uygulamalar için kas hastalığı fenotipleri çoğaltmak değil sadece kullanılabilir.

Giriş

İskelet kası, insan vücut ağırlığının ^1% 40'a kadar oluşturur. Kas-ilişkili bozukluklar muazzam bir sağlık ve ekonomik yük ² temsil etmektedir. Bu son derece karmaşık ve organize doku kurdu muhafaza ve yeniden nasıl bir kapsamlı ve köklü bir araştırma alanını oluşturur. ^{6 -} Belirli bir bilimsel ilgi bağlı olarak, en uygun yaklaşım in vivo modellerde ³ basitten komplekse mihotüp kültürlerden uzanabilir.

Bu protokolün amacı canlı görüntüleme ve immünofloresans vasıtasıyla Miyogenesis izlenmesi için izin veren, bir in vitro sistem sağlamaktır. Geleneksel yöntemlere göre, bu sistem fare myojenik sürecine bir çok tam ve dinamik bir bakış sunuyor. Hücreler enine gizli suç şebekesi ve periferik çekirdekleri ⁷ görüntüleme olgun, çok çekirdekli myofiber için myoblast aşamasından takip edilebilir. Bu olgunlaşma düzeyi canKarmaşık uyarıcı veya mekanik aparatlar için gerek kalmadan normal hücre kültürü ekipman kullanılarak elde edilebilir. In vitro sistemlerde bazı başarılı ^8,9 bildirilmiş olmasına rağmen, bildiğimiz kadarıyla, bu çapraz sarkoplazmik retikulum (SR) ile eşleştirilmiş T-tübüller olgun fare myofibers üreten tek protokoldür. Böylece, bu in vitro sistem hala zayıf ¹⁰ anlaşılamamıştır üçlü oluşumu moleküler mekanizmaları, incelemek için kullanılabilir.

Bu sistemi kullanarak bir başka avantajı, bu tür antikorlar, ilaçlar, ve RNAi araçları olarak doğrulanmış fare hedefli kaynaklar mevcudiyetidir. Nispeten basit bir protokoldür zahmetli adımlar, çok yetenekli manipülasyon, ya da pahalı ve özel ekipman gerektirmez. Olgun myofibers kalsiyum kıvılcım (yayınlanmamış veri) ile birleştiğinde kasılma göstererek, kültür farklılaşması ⁷ 5 d sonra görünmeye başlayacak. Bir hafta içinde, farklı gelişimmemeli vücudundaki en karmaşık hücreler birinin ark aşamaları, in vitro bir dizi analiz ile kombinasyon halinde incelenebilir.

Protokol

NOT: Yaklaşık iki adet 35 mm yemekleri ya da iki canlı görüntüleme yemekleri, yani planı Mattings, diseksiyon ve buna göre kaplama (adım 2.6) için bir fare verimleri yeterli miyoblastlar. 10 hayvandan - miyoblastlar sıralı santrifüj ve preplating yoluyla izole olduğundan, protokol 5 gruplar halinde yapılmalıdır.

Hayvan denekleri Tüm işlemler Instituto de Medicina Moleküler ve Üniversite Pierre et Marie Curie de Hayvan Etik Komitesi tarafından onaylandı

Yenidoğan Fareler Hind-bacak kasları 1. Diseksiyon

1. Peşin (Malzeme Tablosu) tüm çözümleri hazırlayın ve filtrasyon (0.22 mikron filtre) sterilize edilir. Tüm ortam bazal membran matrisi (ör Matrigel) ihtiva eden formülasyonlar hariç hücrelere ilave edilmeden önce 37 ° C 'de olduğundan emin olun.
2. , Kavisli makas, düz makas, düzenli forseps: diseksiyon malzemesi (biri her sterilizeve ince uçlu forseps) ve% 70 etanol ile silerek tezgah.
3. kas toplama Dulbecco'nun fosfat tamponlu tuzlu (DPBS) 5 ml ile 100 mm Petri kabı hazırlayın ve kıyma aşamasına kadar buz üzerinde tutmak.
4. düz makas ile P8 fareler ve% 70 etanol ile cilt sterilize - P6 başını kesmek.
5. arka deride bir kesi yapmak ve tamamen arka ekstremite kas açığa çıkarılana kadar arka bacaklarda doğru yavaşça çekin.
6. kasları zarar vermeden yağ dokusu çıkarmak için forseps kullanın.
7. dorsal arka ekstremite kasları kaldırmak için, gergin ekstremite tutmak ve topuk tendon ortaya çıkarmak için pençe bükün. hafifçe kayar ve yukarı keserek, tendon başlayarak, kemik ayrı kas kavisli makas kullanın. kasları tüketim ve buzlu DPBS koyun.
8. ince uçlu forseps ile kas sıkışması ve femur veya diz eklemini zarar vermeden etrafında keserek kuadriseps izole edin.
9. tüm hayvanları diseksiyon sonra, tüm aşağıdaki adımlar yapılmalıdır steril bir laminer akış hücre kültürü kaputu, geçin.

2. Miyoblast İzolasyon

1. DPBS fazlalığını çıkarın. homojen bir kitle elde etmek için steril kavisli makas ile doku kıyma.
2. Sindirim karışımı, 5 ml ile 50 ml konik santrifüj tüpü içinde kıyılmış doku toplamak ve 90 dakika süreyle 37 ° C'de çalkalama ile inkübe edin.
3. kalan doku pelet 75 xg'de diseksiyon orta ve santrifüj, 5 dakika boyunca bir süspansiyon, 6 ml ekleyerek sindirim durdurun.
4. Süpernatantı dikkatlice toplamak. Doku enkaz toplamak değil emin olun. 5 dakika boyunca 350 xg'de bunu santrifüj; Diseksiyon ortamın 5 mL'si içinde tekrar süspansiyon.
5. 40 mikron hücre süzgecinden hücre süspansiyonu Filtre. 25 ml diseksiyon ortamı ilave edin ve bir hücre kültürü inkübatöründe 4 saat boyunca (37 ° C ve% 5 _{CO2 150 mm'lik çanak içinde preplate/ Sub>) fibroblastlar uymak için izin vermek.}
6. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca soğuk IMDM 100: preplating birlikte, bazal membran matrisi 500 ul kat yemekler 1 seyreltilmiştir. DPBS ile bir kez yıkayın ve derhal hücreleri plaka (2.8 adım) ya da kaplama kadar büyüme ortamı ile bırakın.
7. preplating sonra supernatant toplamak ve 10 dakika boyunca 350 x g'de santrifüj o.
8. büyüme ortamında bunu tekrar süspansiyon ve bir hemasitometre hücreleri saymak. 150.000 ila 250.000 hücreleri bazal membran matris kaplı çanak başına kaplanır ve böylece ses düzeyini ayarlayın. bir hücre kültür inkübatörü içinde hücreleri tutun.

3. Myofiber Farklılaşma

NOT: 3 gün sonra hücreler,% 70 civarında confluency (Şekil 1B) de sigorta ve form miyotüplerinden başlamalıdır.

1. arzu edildiği takdirde, bu noktada, siRNA veya ilgi DNA ile, hücreleri transfekte. Hücreler transfekte edilecek değilseniz, farklılaşma orta ve kayak doğrudan değiştirmekp 3.4 adıma.
2. Üreticinin talimatları izleyerek transfeksiyon reaktifleri ile transferinde. siRNA lipit kompleksleri ile 5 saat boyunca hücrelerin (ayıracın 20 nM + 1 uL) ya da DNA-lipid kompleksleri (1 ug reaktifi + 1 uL) inkübe edin. Gerekirse siRNA ve DNA konsantrasyonları optimize edin.
3. farklılaşma ortamı ile bir kez yıkayın ve sonra yeni farklılaşma ortamına geçiş.
4. Ertesi gün, bazal membran matrisi 1 seyreltin: 2 buz soğukluğunda farklılaşma ortamı içinde. Mevcut Ortamı çıkarın ve her bir çanak buz soğukluğunda matrisin 200 uL ekleyin.
5. hücre kültürü inkübatöründe 30 dakika boyunca inkübe edin.
6. Agrin olan farklılaşma ortamı (100 ng / ml) Supplement ve dikkatli bir şekilde hücrelere 2 ml.
7. Dikkatle her 100 ng / ml bir son konsantrasyona kadar Agrin ile ilave ortamın yarısı her 2 günde bir değiştirin.
8. hücre farklılaşması ve canlılığı izleyin. Bu FBS ve C gibi faktörler (çeşitli bağlı olarakTam olgunlaşmayı (Şekil 2) ulaşmak için 10 farklılaşma d - Hicken embriyo özü kökeni), hücreler 5 arasında sürebilir.

Cam alt Yemekleri 4. immün

1. immün için, ilgi konusu her bir zaman noktasında, 10 dakika boyunca oda sıcaklığında% 4 PFA ile DPBS ile bir kez hücreler yıkama ve düzeltin.
2. DPBS ile iki kez yıkayın. Bu noktada, hücreler 4 ° C'de saklanabilir.
3. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca% 0.5 Triton X-100 ile geçirgenliği.
4. PBS ile iki kez yıkanır ve oda sıcaklığında 30 dakika süre ile çözelti engelleme engeller.
5. Çözelti O / N 4 ° C'de bloke seyreltilmiş primer antikor ile inkübe edin.
6. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca DPBS ile yıkayın 3x.
7. İkincil antikor, oda sıcaklığında 1 saat boyunca DAPI 0.2 ug / mL ile inkübe edin.
8. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca DPBS ile yıkayın 3x.
9. montaj orta 200 mcL ekleyin ve görüntüleme geçin.

Sonuçlar

myofiber gelişme derecesi, çoğunlukla izole miyoblastların saflık ve canlılığı ile belirlenir. Yapışma, proliferasyon ve füzyon kapasitesi ampirik bu parametreleri (Şekil 1 A, B) ulaşmak için kullanılabilir. çoğalması D2 anda, miyoblastlar yapışmış olması ve tipik fusiform şeklini göstermesi gerekir. Silahların Yayılmasını Önleme kendiliğinden mihotüp oluşumu ertesi gün (Şekil 1B) yol açan, bu aşamada yoğun gerçekleşmesi bekleniyor.

Hücre confluency hafif ayarlamalar gerekebilir. miyoblastlar çoğalmak ve sigorta fazla 3 d almak eğer artırılmalıdır. myofibers nedeniyle yoğunluk büyümek ve nispeten düz uzamasına izin verilmez eğer azaltılmalıdır. En iyi myofibers dış bölgelere yönelik bulunan bu yüzden konfluansa Tipik olarak, çanağın merkezinden dış yüzey sınırına azalır.

Myotubes hızla uzamasına ve ekran birden merkezi hizalanmış çekirdekler (Şekil 1C) olacaktır. D5 tarafından, bazı hücreler çizgilerin edinme ve çevre onların çekirdekleri hareket başlatmak. Olgun özelliklere sahip myofibers sayısı zamanla aynı zamanda hücre kalınlığı (Şekil 1D) ile birlikte artacaktır.

farklılaşma derecesi daha da immünofloresan gözlenebilir. farklılaşma D8 mevcut enine üçlü sabit Myofibers. Bu üçlü (Şekil 2) colocalize beklenen T kamışı (DPHR) ve SR (triadin), görüntüleme bileşenleri tarafından teyit edilebilir.

myofibers işlevselliği canlı görüntüleme ile ele alınabilir. itibaren farklılaşma D3, hücreler kendiliğinden seğirmesi görüntüler. Bir kalsiyum sensörü transfekte edilmesiyle (örneğin., GCaMP6f ^11), kasılmaları kalsiyum zirveleri (Şekil 3) ile birleştiğinde olduğunu gözlemlemek mümkündür.

Bu sistemi kullanarak, bu nedenle yenilikçi moleküler tedaviler ⁷ için yeni bir hedef olabilir Sentronükleer miyopatilerde ve miyotonik distrofilerinde bozulur yeni bir moleküler yol tanımlamak için başardık. Biz de nöromüsküler kavşakta (NMJ) ¹² gelişimini incelemek için bu yöntemi adapte var. Sıçan omurilik eksplant ile kokültürü sayesinde, biz NMJ formasyonu ¹³ dinein bir rol tarif etmişlerdir.

Şekil 1: Miyoblast Kültür Gelişim Evreleri. A) çoğalması D2 anda, miyoblastlar yapıştırılır ve çoğalan başladı. Prolif At B)eration D3, 60 bir confluency -% 80 ulaşıldığında ve miyoblastlar kendiliğinden eritme başlar. Farklılaşma D3 anda C), merkezi bir konumda bulunan çekirdek içeren myotubes baskındır. Itibaren farklılaşma D5 itibaren D) (örneğin, gün 8), myofibers çizgilerin ve periferik çekirdekleri sergileyen başlar ve kalınlaştırmak için başlar. Ölçek çubuğu: 50 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2: D8 Myofiber immunostain Temsilcisi Konfokal görüntü. A) dihidropiridin reseptörü (DHPR, üst panel) için immün ve (TRDN, orta panel) triadin. DHPR, TRDN ve DAPI kanalı bir bindirme üçlü bileşenlerin ko gösterir. B) A. C çizilen sarı hat) α-aktinin (yeşil) ve DAPI (mavi) için boyandı myofibers hacmi render 3D görüntünün bir yoğunluk profili. Ölçek çubuğu ve ızgara genişliği: 5 mm. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3: Spontan seğirmesi ile Myofibers Kalsiyum Düzeyleri Canlı Görüntüleme. Bir seğirmesi myofiber bir kalsiyum kıvılcım A) Yüksek hızlı time-lapse (20 ms kare) mikroskopi. Kalsiyum GCaMP6f sentezlenmesi (Addgene plazmid # 40755) ile tespit edilmiştir. Panel A'da kalsiyum sensör için zamanla floresan yoğunluğu B) Niceleme"_blank> Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Tartışmalar

Birincil miyoblastların yetiştirilmesi için bu protokolün kullanımı büyük ölçüde myofibers gelişimini besleyen özel bir niş yol açmaktadır. Bu da çok az sayıda bulunan diğer hücre tiplerine, kısmen bağlıdır. myoblast konsantrasyonu ve kültür saflığı arasında bir denge sağlanmalıdır. İyi bir hücre kültürü de orta formülasyon için kullanılan ürünlerin kalitesine bağlıdır. hayvansal kaynaklardan elde edilen bütün ürünler iyice test edilmelidir. Bizim tecrübelerimize göre, sindirim koşulları da takip edilmelidir.

Birincil kültürler için her zaman olduğu gibi, deneysel değişkenliği izole elyaflar ya da ölümsüzleştirilmiş miyoblastların olan çalışmalara göre daha yüksek olabilir. Bu değişkenlik orta ve sindirim bileşenleri, fareler ve boyutu ve kültür manipülasyon ve sonuçları toplanması için zaman noktalarında standardizasyonun azaltılabilir. Bununla birlikte, karmaşık mekanizmalar gerçek zamanlı olarak tetkik avantajımyofiber gelişimi için gerekli ölçüde değişkenlik dezavantajı geçti.

Bu protokol, hücre farklılaşmasını ödün vermeden, in vitro yaklaşımların avantajlar sağlar. triads oluşur ve kasılmalar kalsiyum kıvılcım birleştiğinde kadar Myofibers olgun. Bu fonksiyonel çıkışlar, farklı deneysel koşullarda ulaşılabilir. Ayrıca, protokole yapılan birçok teknik farklılıklar olabilir. Miyoblastlar kas gelişimi ile ilgili ilgi mutasyonlar ile neonatal fareden hasat edilebilir. Hücreler farklı farklılaşma zaman noktalarında biyokimyasal analiz için parçalanmış olabilir. Kalsiyum göstergeleri dinamiklerini takip etmek kültüre eklenebilir. Optogenetic yapılar bazı sinyal yolaklarını zorlamak için ya da belirli yerel tepkiler teşvik etmek için kullanılabilir. Son olarak, myofibers etkileşimlerini incelemek için, diğer hücre tipleri ile kültive edilebilir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dispase II	Gibco	17105041
Collagenase type V	Sigma-Aldrich-Aldrich	C9263
IMDM, Glutamax supplemented	Gibco	31980022
Matrigel Growth reduced factor	Corning	354230	protein concentration of the lot should be around 10 mg/mL and endotoxin result should be <1.5
Chicken Embryo Extract	MP biomedical	2850145	it is also possible to prepare in the lab (Danoviz ME, Yablonka-Reuveni Z. Methods Mol Biol (2012))
Recombinant rat agrin	R&D systems	550-AG-100
Penicillin/Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122
Horse Serum	GE Healthcare	11581831
Lipofectamine RNAiMAX	Invitrogen	13778-150	used to transfect siRNA
Lipofectamine LTX	Invitrogen	15338-100	used to transfect DNA
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668030	used to transfect siRNA plus DNA
DPBS	Gibco	14190094
Fetal Bovine Serum (FBS)	Eurobio	CVFSVF0001
Cell strainer	Corning	21008-949
Fluorodishes	World precision instruments	FD35-100	dishes used to cultivate cells for live imaging
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284
16% PFA (Paraformaldehyde)	Science Services GmbH	E15710
Goat Serum	Sigma-Aldrich	G9023
BSA (Bovine Serum Albumine)	Sigma-Aldrich	A7906
Saponine	Sigma-Aldrich	47036
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542	use at 200 ng/µL
Fluoromount-G	SouthernBiotech	0100-01
Name	Company	Catalog Number	Comments
Solutions and Media
Digestion Mix			in DPBS 5 mg/mL collagenase 3.5 mg/mL dispase sterile filtered, can be stored in working aliquotes for 2 weeks at -20 °C
Dissection Medium			in IMDM Glutamax supplemented 10% FBS 1% Penicillin/Streptomycin sterile filtered
Growth Medium			in IMDM Glutamax supplemented 20% FBS 1% Chicken Embryo Extract 1% Penicillin-Streptomycin sterile filtered
Differentiation Medium			in IMDM Glutamax supplemented 2% Horse Serum 1% Penicillin-Streptomycin sterile filtered
Blocking Solution			in DPBS 10% Goat Serum 5% BSA add 0.1% saponine when incubating with primary and secondary antibodies