تحفيز اشارة الشق في ماوس تآكل العظام Osteoclast السلائف

Summary

Notch signaling is a form of cellular communication that relies upon direct contact between cells. To properly induce Notch signaling in vitro, Notch ligands must be presented to cells in an immobilized state. This protocol describes methods for in vitro stimulation of Notch signaling in mouse osteoclast precursors.

Abstract

Notch signaling is a key component of multiple physiological and pathological processes. The nature of Notch signaling, however, makes in vitro investigation of its varying and sometimes contradictory roles a challenge. As a component of direct cell-cell communication with both receptors and ligands bound to the plasma membrane, Notch signaling cannot be activated in vitro by simple addition of ligands to culture media, as is possible with many other signaling pathways. Instead, Notch ligands must be presented to cells in an immobilized state.

Variations in methods of Notch signaling activation can lead to different outcomes in cultured cells. In osteoclast precursors, in particular, differences in methods of Notch stimulation and osteoclast precursor culture and differentiation have led to disagreement over whether Notch signaling is a positive or negative regulator of osteoclast differentiation. While closer comparisons of osteoclast differentiation under different Notch stimulation conditions in vitro and genetic models have largely resolved the controversy regarding Notch signaling and osteoclasts, standardized methods of continuous and temporary stimulation of Notch signaling in cultured cells could prevent such discrepancies in the future.

This protocol describes two methods for stimulating Notch signaling specifically in cultured mouse osteoclast precursors, though these methods should be applicable to any adherent cell type with minor adjustments. The first method produces continuous stimulation of Notch signaling and involves immobilizing Notch ligand to a tissue culture surface prior to the seeding of cells. The second, which uses Notch ligand bound to agarose beads allows for temporary stimulation of Notch signaling in cells that are already adhered to a culture surface. This protocol also includes methods for detecting Notch activation in osteoclast precursors as well as representative transcriptional markers of Notch signaling activation.

Introduction

والثدييات الشق يشير المسار هو مثلي إلى نفس المسار في ذبابة الفاكهة، ويتكون من أربعة مستقبلات الغشاء الشق (Notch1-4) وخمسة بروابط بغشاء من خشنة (JAG1 وJAG2) ودلتا مثل (DLL1، 3، & 4) أسر ^1. يبدأ الشق الإشارات عندما يرتبط مستقبلات درجة على خلية المستقبلة التي يجند على خلية يحيل ^2. خلال هذا التنشيط عبر والشق يجند بغشاء ينتج قوة تمتد على بغشاء الشق مستقبلات ^{3 و 4.} القوة تمتد من يجند ملزم يؤدي الى تغييرات بتكوين في مستقبلات الشق التي تسهل انشقاق خارج الخلية من المستقبلات التي كتبها TNFalpha تحويل انزيم (TACE)، يليه حدث انشقاق داخل الخلايا بوساطة التي تحتوي على presenilin جاما secretase معقدة (γ-secretase). النشرات γ-secretase كثافة العمليات الشقنطاق racellular حوال التي translocates داخل النواة حيث يشكل مجمع تفعيل النسخي مع البرازيلي-1-سو (H) -Lag-1 (CSL)، العقل المدبر مثل (MAML)، وخلية العوامل نوع معين لدفع التعبير استهداف الجينات ^5.

العناصر الميكانيكية الشق يشير نتيجة التنشيط في الحاجة إلى أساليب فريدة من تفعيل الشق المسار في المختبر. يمكن بروابط الشق القابلة للذوبان ربط الشق المستقبلات، لكنه يفشل في إنتاج تمتد القوات اللازمة للافراج حوال وفي الوقت نفسه تثبيط تنافسية ملزمة بروابط الشق المرتبط الخلية. وهكذا، إضافة بروابط الشق القابلة للذوبان في ثقافة المتوسط يمكن أن تخفف الشق الطبيعي يشير ^{6 و 7.} لحسن الحظ، يمكن بروابط الشق لحث على الإفراج حوال إذا كانت ثابتة على ركيزة صلبة مناسبة ^{5، 8، 9،10.} بذر الخلايا على ركائز الثقافة المغلفة يجند أو تطبيق حبات المغلفة يجند إلى الخلايا على حد سواء يمكن تفعيل الشق الإشارات، والاختيار بينها يعتمد في المقام الأول على توقيت المطلوب من التحفيز الشق. لتفعيل الشق يشير فوري، مؤقت، كما هو المطلوب خلال منتصف فحص وظيفي أو التمايز، يجند الشق يمكن أن تكون ملزمة لالاغاروز الخرز، وتطبيقها على الخلايا المستزرعة، وجرفت في أي وقت. لمزيد من الإشارات الشق متواصلة من بداية الفترة الثقافة، لوحات زراعة الأنسجة يمكن أن تكون مغلفة مع يجند قبل البذر الخلية.

لأغراض هذا البروتوكول، ويتم تنفيذ طرق من استخدام السلائف الماوس ناقضة العظم، ولكن الأساليب والاختلافات على الطرق الموضحة هنا تنطبق على مجموعة واسعة من أنواع الخلايا ^{6، 11، 12، 13، 14.} الآكلة هي عضال متباينة الخلايا المكونة للدم عدد الأسطر التي هي المسؤولة عن ارتشاف النسيج العظمي، وكانوا متورطين في الاضطرابات متعددة من فقدان العظام ^(15). وهكذا، الدراسة في المختبر من تمايز الخلايا الآكلة من السلائف الوحيدات / بلعم-نسبهم والآليات الجزيئية التي تتحكم في وظيفتها هي ضرورية لفهم أفضل للالآكلة وتطوير علاجات جديدة لتجديد العظام. في حين اصبح من المقبول عموما أن يشير الشق تلعب دورا إيجابيا في التمايز وظيفة الخلايا الآكلة، والاختلافات في كل من التحفيز يشير الشق وناقضة العظم ثقافة السلائف والتمايز أدى إلى البداية النتائج المتناقضة ^{16، 17، 18، 19.} دراسة أعمق للاختلافات في طرق واستخدام الوراثيةنماذج قد أوضح كثيرا من دور الإشارات الشق في osteoclastogenesis، ولكن تطبيق أساليب التحفيز الشق وثقافة موحدة يمكن منع مثل هذه الخلافات في الدراسات المستقبلية من الإشارات الشق في أنواع الخلايا الأخرى ^{20، 21، 22، 23.}

وهناك طرق متعددة لزراعة والتفريق السلائف الماوس ناقضة العظم، وكما هو الحال مع طرق مختلفة لتحفيز الشق إشارة، فإن أفضل طريقة تعتمد على مسألة تجريبية. هنا، سيتم تقديم أسلوبنا المفضل للزراعة كسور ملتصقة وغير ملتصقة من خلايا نخاع العظام مسح من الماوس طويلة. هذا الأسلوب له ميزة تتطلب في الأساس ليست معدات متخصصة وإنتاج الخلايا التي تنطبق على مجموعة متنوعة من الطرق التقليدية.

Protocol

تم إجراء كافة البحوث التي تنطوي على الحيوانات الفقارية وفقا للبروتوكولات المعتمدة من قبل جامعة ولاية بنسلفانيا رعاية الحيوان المؤسسية واللجنة الاستخدام (IACUC).

1. إعداد وسائل الإعلام الثقافة

1. إعداد ألفا-MEM عن طريق إذابة الحد الأدنى الضروري المتوسطة (MEM) مسحوق و 1.9 غرام بيكربونات الصوديوم في 900 مل H ₂ O وتكملة مع 2 مم L-الجلوتامين، و 100 وحدة / مل البنسلين، 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين، و 100 مل للحرارة المعطل الجنين المصل البقري. تعقيم باستخدام فلتر 0.22 ميكرون polyethersulfone (PES).
2. إعداد المتوسطة البلاعم التي كتبها المكمل ألفا-MEM مع 35 نانوغرام / مل المؤتلف الماوس بلعم مستعمرة عامل تحفيز (M-CSF)
3. إعداد المتوسطة ناقضة العظم من خلال استكمال المتوسطة بلعم مع 100 نانوغرام / مل RANKL

2. نخاع العظم عزل الخلايا

1. ملء واحدة حقنة 10 مل مع إبرة 25⅝ قياس في الماوس مع 10 مل α-MEM.
2. الموت ببطء الفئران عن طريق التعرض 10 دقيقة إلى CO ₂ بمعدل تدفق 1.3 لتر / دقيقة. ضمان موت الحيوان باتباع CO ₂ التعرض مع خلع عنق الرحم قبل الشروع في تشريح.
3. باستخدام تقنية نظيفة، تشريح خارج وفصل الظنبوب وأفخاذ؛ فخذان. تطهير الجلد الفأر مع الايثانول 70٪ قبل إجراء شق على طول السطح الأمامي من كل أطرافه الخلفية لكشف الساق وعظم الفخذ.
   1. قطع طريق مفصل الركبة لتحرير النهاية البعيدة لعظم الفخذ، وقطع طريق عظم الفخذ وعلى مقربة من الحوض ممكن. إزالة عظم الفخذ وتنظيف الكثير من الأنسجة اللينة وقت ممكن. لإزالة الساق، قطع طريق الكاحل وإزالة أكبر قدر ممكن من الأنسجة اللينة وقت ممكن.
4. عقد العظام مع ملقط ونخاع دافق إلى 15 مل أنبوب مخروطي مع 2.5 مل درجة حرارة الغرفة α-MEM تجمع بين الإحمرار نخاع من ماوس واحدة في أنبوب واحد.
   ملاحظة: سوف مطاردة نخاع ناجحة تغيير تلوين رانه العظام من اللون الأحمر إلى البيج.
5. السماح الحطام لتستقر في قاع الأنبوب ونقل طاف لتنظيف 15 مل أنبوب مخروطي مع أخذ الحيطة لتجنب نقل أي حطام.
   ملاحظة: بعض الخلايا قد يستقر أيضا مع الحطام نخاع. إذا كنت بحاجة لعدد أكبر من الخلايا، الإحمرار نخاع يمكن أن تتم تصفيته من خلال مصفاة الخلية 70 ميكرومتر في أنبوب 15 مل نظيفة.
6. أنبوب الطرد المركزي (ق) في 300 x ج لمدة 5min في درجة حرارة الغرفة لتكوير الخلايا.
7. فراغ نضح طاف و resuspend الخلية بيليه في 0.5 مل الأمونيوم كلوريد البوتاسيوم (ACK) الناشر العازلة واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 3 دقائق لليز خلايا الدم الحمراء.
8. إضافة 10 مل برنامج تلفزيوني مباشرة إلى ACK خلايا حل، وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق.
   ملاحظة: يجب أن يكون بيليه الخلايا الحمراء سابقا الآن البيج.
9. فراغ طاف نضح وبيليه resuspend في 10 مل α-MEM، ولوحة في طبق المعالجة الثقافة 100 ملم الأنسجة. احتضان خلايا بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في ترطيبزراعة الأنسجة حاضنة.
   ملاحظة: عد خلايا ليس من الضروري لهذه الخطوة. خلال هذا الوقت، سوف الخلايا الملتصقة من نخاع العظام نعلق على سطح الثقافة؛ ستبقى غير ملتصقة نخاع العظام السكان الخلية في تعليق. MCSF لم يكن موجودا في مستنبت خلال هذه الحضانة الأولية.

3. إثراء تآكل العظام Osteoclast السلائف

1. بعد مرور فترة الحضانة بين عشية وضحاها من الإحمرار النخاع، ونقل ثقافة طاف التي تحتوي على الخلايا غير ملتصقة إلى 50 مل أنبوب مخروطي الشكل.
   ملاحظة: أطباق الثقافة مع الخلايا الملتصقة، والتي تشمل العظام خلايا نخاع الوسيطة سلف، يمكن التخلص منها أو تغذية مع الطازجة α-MEM، إذا رغبت في ذلك لتجارب أخرى.
   ملاحظة: الآكلة يمكن التفريق مباشرة من هذه الخلايا نخاع العظم غير ملتصقة من الطلاء لهم في أطباق المعالجة زراعة الأنسجة في كثافة 4 × 10 ⁵ خلية / سم ² في ناقضة العظم المتوسطة والمتوسطة منعش كل يوم لمدة 5 أيام.
2. إضافة ألفا-MEM إلى حل الخلايا غير ملتصقة إلى الحجم النهائي من 18 مل وإضافة M-CSF إلى تركيز النهائي من 35 نانوغرام / مل.
3. إضافة 3 مل من تعليق خلية كل و 6 اطباق الثقافة تعليق 60 ملم.
4. احتضان لوحات ليلا 37 درجة مئوية في نسيج الثقافة الحاضنة ترطيب. خلال هذا الوقت، سوف تحفز M-CSF التفريق بين الضامة، والتي يمكن أن تنضم حتى على الأسطح المعالجة ثقافة غير الأنسجة.
5. بعد تفرخ بين عشية وضحاها، وإعادة تغذية السلائف ناقضة العظم مع 3 مل المتوسطة بلعم جديدة. سيؤدي هذا إلى إزالة الخلايا غير ملتصقة التي لم يفرق في الضامة.
6. تواصل السلائف ناقضة العظم الثقافة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO ₂ لمدة 2 أيام أو حتى الثقافات تصل إلى ما يقرب من 70٪ التقاء.

4. تآكل العظام Osteoclast التمايز

1. يغسل السلائف ناقضة العظم مع 5 مل برنامج تلفزيوني وعلاج الخلايا مع 1 مل المنشأ البحرية بروتين / انزيم حال للكولاجين في درجة حرارة الغرفة حتى سلليرة سورية يمكن إقصاؤه من خلال التنصت لطيف من لوحة.
   ملاحظة: لا يمكن إلا ناقضة العظم السلائف أن يرفع إذا كانت مثقف في أطباق تعليق. السلائف نعلق بحزم أيضا على الأسطح المعالجة زراعة الأنسجة لرفعه. التربسين يمكن تنشيط السلائف ناقضة العظم ويجب تجنبها.
2. إضافة 4 مل α-MEM إلى كل طبق ونقل الخلايا إلى 50 مل أنبوب مخروطي الشكل. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات وتمييع الخلايا إلى كثافة 5 × 10 ⁴ خلية / مل وإضافة M-CSF إلى تركيز النهائي من 35 نانوغرام / مل وRANKL إلى تركيز النهائي من 100 نانوغرام / مل.
3. خلايا البذور في مناطق ذات كثافة من 2.6 × 10 ⁴ خلية / سم ² في لوحات المعالجة زراعة الأنسجة واحتضان عند 37 درجة مئوية في نسيج الثقافة الحاضنة ترطيب لمدة 2 أيام. ويتم التفريق عادة في 24 لوحات جيدا، حيث هي المصنفة 5 × 10 ⁴ خلايا في كل بئر.
4. 2 بعد أيام من بدء الخلايا والتمايز، وإعادة تغذية عن طريق استبدال المتوسطة مع 1 مل osteoc جديدةمتوسطة الماضي.
   ملاحظة: سوف تآكل العظام Osteoclast التمايز وعادة ما تكون كاملة خلال 3 أيام. يمكن الآكلة الناتجة عن ذلك لتقدير سهل والتحليل الصرفي الملطخة الفخ.

5. تحفيز المستمر للاشارة الشق مع السطح المطلي Jagged1-

1. تعليق الماعز مكافحة الإنسان مفتش التيسير الأجسام المضادة في برنامج تلفزيوني في تركيز 10 ميكروغرام / مل (1: 1000 تخفيف من 10 ملغ / مل الأسهم). إضافة حل الأجسام المضادة للسطح الثقافة في مناطق ذات كثافة من 1.3 ميكروغرام / سم ² ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة. في حالة 24 لوحات جيدة، إضافة 250 ميكرولتر (2.5 ميكروغرام) لكل بئر.
2. فراغ الآبار نضح والملء مع 1 مل برنامج تلفزيوني. كرر هذه الخطوة 2 مرات.
3. تعليق المؤتلف Jagged1-FC البروتين الانصهار في برنامج تلفزيوني في تركيز 10 ميكروغرام / مل. إضافة Jagged1-FC حل لسطح الثقافة المغلفة الأجسام المضادة في مناطق ذات كثافة من 1.3 ميكروغرام / سم ² ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة. السطوح الثقافة المغلفة مع الأجسام المضادة فقط. tذ يمكن استخدامها والضوابط.
4. فراغ الآبار نضح والملء مع 1 مل برنامج تلفزيوني. كرر هذه الخطوة 2 مرات. حافظ على برنامج تلفزيوني في الآبار حتى قبيل الخلية البذر لمنعهم من الجفاف.
5. البذور السلائف 2.6 × 10 ⁴ ناقضة العظم / سم ² على الأسطح المطلية. سيتم حفز درجة يشير بشكل مستمر لمدة 3 أيام على الأقل.

6. تحفيز المؤقت للاشارة الشق مع الخرز المغلفة Jagged1-

1. الجمع بين ما يلي في أنبوب بحجم مناسب: 0.5 ميكروغرام / سم ² Jagged1-FC، 21 ميكرولتر / سم ² حبات بروتين G الاغاروز، وبرنامج تلفزيوني إلى الحجم النهائي من 1.5 مل. لإعداد عدد كاف من الخرز Jagged1 ل1 بئر من 24 لوحة جيدا، والجمع بين 1 ميكروغرام Jagged1-FC، 40 بروتين ميكرولتر G الخرز الاغاروز، وبرنامج تلفزيوني إلى 1.5 مل.
2. احتضان أنبوب مع دوران في 4 ° مئوية لمدة 2 ساعة.
3. أنبوب الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 1 دقيقة لحبات بيليه. الخرز resuspend في 1.5 مل برنامج تلفزيوني. كرر هذا يغسل2 أكثر من مرة.
4. Resuspend الخرز Jagged1 في 130 ميكرولتر / مستنبت سم ² وتنطبق على الخلايا المستزرعة.
5. احتضان الخلايا مع حبات عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO ₂ للفترة المطلوبة. إزالة الخرز مع عدة يغسل من برنامج تلفزيوني أو مستنبت.
6. تحقق الشق يشير تفعيل عبر قياس الشق الهدف النصوص الجين ^10.

النتائج

والهدف من هذه الطريقة هو أن الثقافة وتنشيط الشق يشير في السلائف ناقضة العظم. عندما مثقف بشكل صحيح، السلائف ناقضة العظم يحمل التشكل ممدود في المقام الأول على شكل مغزل مع السيتوبلازم السلس (الشكل 1A). يجب توخي الحذر لتجنب تنشيط المناعة من السل?...

Discussion

الخطوات الحاسمة في البروتوكول

ثقافة والتمايز المختبر السلائف ناقضة العظم توفر منبرا مفيدا للتحقيق في الآليات الجزيئية من osteoclastogenesis وتحديد الأهداف العلاجية لتجديد العظام والحفاظ على كتلة العظام. عندما زراعة السلائف الماوس ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Recombinant mouse M-CSF	Biolegend	576402	Available from multiple suppliers, test activity before experiments
Recombinant mouse RANKL	Shenandoah Biotechnology	200-04	Available from multiple suppliers, test activity before experiments
Recombinant human Jagged1-Fc	R&D Systems	1277-JG-050	Available from multiple suppliers, test activity before experiments
Protein G agarose beads	InvivoGen	gel-agg-2
Goat anti-human IgG Fc	Jackson ImmunoResearch	109-001-008
Minimum Essential Medium powder	Sigma-Aldrich	M0894
Accutase cell dissociation reagent	ThermoFisher	A1110501	Used to lift osteoclast precursors
Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit	Sigma-Aldrich	387A-1KT	Used to stain differentiated osteoclasts