Fare Osteoklast Öncüleri Notch Sinyal uyarılması

Özet

Notch signaling is a form of cellular communication that relies upon direct contact between cells. To properly induce Notch signaling in vitro, Notch ligands must be presented to cells in an immobilized state. This protocol describes methods for in vitro stimulation of Notch signaling in mouse osteoclast precursors.

Özet

Notch signaling is a key component of multiple physiological and pathological processes. The nature of Notch signaling, however, makes in vitro investigation of its varying and sometimes contradictory roles a challenge. As a component of direct cell-cell communication with both receptors and ligands bound to the plasma membrane, Notch signaling cannot be activated in vitro by simple addition of ligands to culture media, as is possible with many other signaling pathways. Instead, Notch ligands must be presented to cells in an immobilized state.

Variations in methods of Notch signaling activation can lead to different outcomes in cultured cells. In osteoclast precursors, in particular, differences in methods of Notch stimulation and osteoclast precursor culture and differentiation have led to disagreement over whether Notch signaling is a positive or negative regulator of osteoclast differentiation. While closer comparisons of osteoclast differentiation under different Notch stimulation conditions in vitro and genetic models have largely resolved the controversy regarding Notch signaling and osteoclasts, standardized methods of continuous and temporary stimulation of Notch signaling in cultured cells could prevent such discrepancies in the future.

This protocol describes two methods for stimulating Notch signaling specifically in cultured mouse osteoclast precursors, though these methods should be applicable to any adherent cell type with minor adjustments. The first method produces continuous stimulation of Notch signaling and involves immobilizing Notch ligand to a tissue culture surface prior to the seeding of cells. The second, which uses Notch ligand bound to agarose beads allows for temporary stimulation of Notch signaling in cells that are already adhered to a culture surface. This protocol also includes methods for detecting Notch activation in osteoclast precursors as well as representative transcriptional markers of Notch signaling activation.

Giriş

Memeli Çentik sinyal yolu, Drosophila melanogaster, aynı yol homolog olan dört transmembran Çentik reseptörleri (Notch1-4) ve sivri (JAG1 ve JAG2) Delta-benzeri (DLL1, 3 beş zara bağlı ligand içerir ve 4) aileleri ^1. Bir alıcı hücreye Çentik alıcısı bir iletim hücresi ² ligandı ile bağlı olduğunda, Çentik sinyal başlatılır. Bu şekilde trans-aktivasyon sırasında zara bağlı Çentik ligand zara bağlı Çentik alıcısı ^{3, 4} üzerinde bir germe kuvveti üretir. bağlayıcı ligandın germe kuvveti presenilin-içeren y-sekretaz kompleksi (γ-sekretaz) tarafından aracılık edilen bir hücreiçi bölünme etkinliği ve ardından enzim (TACE), dönüştürücü TNFalfa ile reseptörünün hücre dışı ayrılmasını kolaylaştıran Çentik reseptörde konformasyonel değişikliklere neden olur. γ-sekretaz bültenleri Notch intBu CBF-1-Su (lH) -Lag-1 (CSL), beyni benzeri (MAML) bir transkripsiyonel aktivasyon kompleks oluşturan çekirdek içine geçiş yapar ve hücre tipine spesifik faktörler, ekspresyonu hızlandırmak için racellular alan (NiCd) genler ⁵ hedef.

In vitro Notch yolu aktivasyonu eşsiz yöntemlere ihtiyaç Notch sinyal aktivasyon sonucu mekanik elemanlar. Eriyebilir Çentik ligandlarmın reseptörlerine Notch bağlanan, ancak aynı zamanda, rekabetçi, hücreye birleşik Çentik ligandların bağlanmasını inhibe ederken NICD serbest bırakılması için gerekli kuvvetleri gerilme özelliklerine göre başarısız olabilir. Bu nedenle, kültür ortamına eriyebilir Çentik ligandlarmın eklenmesi ^{6, 7} sinyal, normal Notch azaltabilir. Bunlar uygun bir şekilde katı bir alt-tabaka ^{5, 8, 9} sabitlenmektedir Neyse ki, Çentik ligandları NICD ^{salınmasını,10.} Ligand kaplı kültür yüzeylerde hücreleri tohumlama veya hücrelere ligand kaplı boncuklar uygulayarak hem Notch sinyali etkinleştirmek ve aralarındaki seçim Notch stimülasyon istenen zamanlaması öncelikle bağlıdır olabilir. fonksiyonel ya da farklılaşma deneyinde orta noktası boyunca arzulanan gibi anında geçici Çentik sinyal aktivasyonu için, Çentik ligand kültürlenmiş hücrelere uygulanan boncuklar, agaroz bağlı olabilir ve herhangi bir zamanda yıkanmıştır. bir kültür süresinin başlangıcından itibaren daha sürekli Çentik sinyallemesinin için, doku kültürü plakaları Hücre Serpilmesi önce bir ligant ile kaplanabilir.

Bu protokol amaçları için, yöntemler, fare osteoklast öncüler kullanılarak gerçekleştirilebilir, ancak burada tarif edilen yöntemler ile ilgili yöntemler ve varyasyonların hücre tipleri ^{6, 11, 12, 13,} çok çeşitli ^{uygulanabilir, 14.} Osteoklastlar terminal kemik dokusunun emilmesinden sorumlu olan farklılaşmış hematopoietik nesilli hücreleridir ve bunlar kemik kaybı ¹⁵ birden fazla rahatsızlığa rol oynar. Böylece, monosit / makrofaj-soy öncüleri osteoklastlar ve fonksiyon osteoklastlar ve yeni kemik-yenileyici tedavilerin geliştirilmesi daha iyi anlaşılması için gereklidir kontrol eden moleküler mekanizmaların farklılaşma in vitro çalışmada. Bu artık, genel olarak bu çentik sinyal osteoklast farklılaşması ve fonksiyonunda pozitif bir rol oynadığını kabul edilmekle birlikte, her iki çentik sinyal uyarılması ve osteoklast ön-kültürü ve farklılaşmasında varyasyonlar ilk çelişkili sonuçlar ^{16, 17, 18, 19} yol açmıştır. Yakından yöntemleri farklılıkların incelenmesi ve genetik kullanımımodeller büyük ölçüde osteoklastogenez Notch sinyalizasyon rolünü açıklık, ama standardize Notch uyarılması ve kültür yöntemlerinin uygulama diğer hücre tipleri ^{20, 21, 22, 23} Notch sinyalizasyon gelecekteki çalışmalarda bu tür tartışmaları engelleyebilir.

Notch sinyali teşvik etmek için çeşitli yöntemler olduğu gibi, en iyi yöntem deneysel soru bağlı olacaktır, orada kültüre ve fare osteoklast öncülerini ayırt etmek için birden çok yöntem vardır ve. Burada, fare uzun kemiklerde temizlendi ilik hücrelerinin yapışık ve yapışmaz kesirler kültüre bizim tercih edilen yöntem sunulacaktır. Bu yöntem, farklılaşma çeşitli yöntemler uygulanabilir hücreleri esas olarak herhangi bir özel ekipman gerektiren ve üretme avantajına sahiptir.

Protokol

omurgalı hayvanları da içeren tüm araştırma Pennsylvania Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi Üniversitesi (IACUC) tarafından onaylanan protokoller çerçevesinde gerçekleştirildi.

1. Kültür Medya Hazırlık

1. Ve 100 ml ısı, 900 _{mi, H2O} içinde en az temel ortam (MEM) tozu ve 1.9 g sodyum bikarbonat çözülmesiyle α-MEM hazırlanması ve 2 mM L-glutamin, 100 birim / ml penisilin, 100 ug / ml streptomisin ile takviye inaktive edilmiş fetal büyükbaş hayvan serumu. 0.22 mikron polyethersulfone (PES) filtre kullanarak sterilize edin.
2. 35 ng α-MEM ilave makrofajın orta hazırlayın / ml rekombinant fare makrofaj koloni uyarıcı faktör (M-CSF)
3. 100 ng / ml RANKL ile makrofaj ortamı ilave ederek osteoklast ortamı hazırlayın

2. Kemik iliği Hücre İzolasyonu

1. 10 mi α-MEM ile fare başına 25⅝ gauge iğne ile bir 10 ml şırınga doldurun.
2. 1.3 L / dakikalık bir akış oranında CO _2-10 dakika maruz kalma ile fareler öldürülür. Diseksiyon başlamadan önce servikal dislokasyon ile CO ₂ pozlama takip ederek hayvan ölümü sağlayın.
3. Temiz tekniği kullanarak, teşrih ve fibula ve femora ayırın. Kaval ve femur maruz her arka bacak ön yüzeyi boyunca bir kesi yapmadan önce% 70 etanol ile fare cildi dezenfekte edin.
   1. femur distal ucunu serbest diz eklemine kesti, ve mümkün olduğunca pelvis yakın olarak femur kesti. Uyluk çıkarın ve mümkün olduğu kadar yumuşak doku temizleyin. ayak bileği kesti tibia, kaldırmak ve mümkün olduğunca yumuşak doku kaldırmak için.
4. 2.5 ml oda sıcaklığında α-MEM, tek bir tüp içine tek bir fare kemik iliği basması birleştirerek bir 15 ml konik tüp içine forseps ve gömme iliği ile kemik tutun.
   NOT: Başarılı bir kemik iliği floş t renklerini değişecekO kırmızı kemik bej.
5. enkaz tüpün dibe ve herhangi bir enkaz aktarılmasını engellemek için temiz bir 15 ml konik tüp alma bakımına süpernatant aktarmak için izin verin.
   NOT: Bazı hücreler de kemik iliği enkaz ile razı olabilir. hücrelerin daha fazla sayıda gerekli ise, kemik iliği basması temiz 15 ml'lik bir tüp içine 70 mikron hücre süzgecinden süzülür.
6. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj tüpüne (ler) hücreler pelet.
7. Vakum tampon lize 0.5 mi Amonyum Klorür-Potasyum (ACK) supernatant ve tekrar süspansiyon hücre pelletini aspire ve kırmızı kan hücreleri lize etmek için 3 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
8. 5 dakika boyunca 300 x g'de çözeltisi ve santrifüj hücresi ACK doğrudan 10 ml PBS ilave edin.
   NOT: Daha önce kırmızı hücre pelet şimdi bej olmalıdır.
9. 100 mm doku kültürü ile tedavi edilen çanak vakum aspirasyon supernatant ve tekrar süspansiyon pelet 10 ml α-MEM içinde ve plaka. nemlendirilmiş, 37 ° C de bir gece boyunca inkübe hücreleridoku kültürü kuluçka.
   NOT: hücrelerin sayılması bu adım için gerekli değildir. Bu süre boyunca, kemik iliğinden yapışan hücreler, kültür yüzey eklenecektir; yapışmayan kemik iliği hücre popülasyonları süspansiyon içinde kalır. MCSF Bu ilk inkübasyon sırasında kültür ortamında mevcut değildir.

Osteoklast Öncüleri 3. zenginleştirilmesi

1. iliği basması, 50 ml yıkanarak yapışmayan hücreler konik tüp içeren transfer kültür süpernatanının gece boyunca inkübe edildikten sonra.
   Not: Kemik iliği mezenkimal projenitör hücreleri, yapışık hücreler ile kültür tabaklarında, iptal edilebilir ya da başka deneyler için arzu edildiği takdirde, taze α-MEM ile beslenir.
   Not: Osteoklastlar, 5 gün boyunca her gün osteoklast orta ve ferahlatıcı bir ortam içinde 4 x 10 ⁵ hücre / ^cm2 yoğunluğunda doku kültürü ile muamele edilmiş tabaklar içine kaplama ile, bu yapışmayan kemik iliği hücreleri ile irtibata ayırt edilebilir.
2. 18 ml'lik bir son hacme yapışmayan hücre çözeltisine α-MEM ilave edin ve 35 ng / ml'lik nihai bir konsantrasyona kadar M-CSF ekleyin.
3. 6 60 mm süspansiyonu kültür tabaklarında hücre süspansiyonu her bir 3 ml ekleyin.
4. nemlendirilmiş bir doku kültürü kuluçka makinesi içinde 37 ° C'de gece boyunca inkübe edin. Bu süre boyunca, M-CSF daha olmayan doku kültürü ile muamele edilmiş yüzeylerin yapışabilir makrofajlar, farklılaşmasını teşvik edecektir.
5. bir gecede 3 ml taze makrofaj ortamı ile, yeniden besleme osteoklast öncülerini kuluçka sonra. Bu makrofajlar içine farklılaştırılmış değil yapışmayan hücreleri çıkarmak olacaktır.
6. 2 gün veya kültürlerinin yaklaşık 70% konfluansta ulaşana kadar _CO2, 37 ° C'de, kültür osteoklast öncüler devam ve% 5.

4. Osteoklast Farklılaşma

1. cel kadar oda sıcaklığında 1 mi Deniz menşeli proteolitik / kolajenolitik enzim hücreler 5 ml PBS ile osteoklast öncüler yıkayın ve tedavisils plakanın nazik dokunarak yerinden yapılabilir.
   NOT: süspansiyon yemekleri kültüre ise osteoklast öncüleri sadece kaldırılabilir; öncüleri kaldırılması için doku kültürü ile işlenmiş yüzeylere çok sıkı bir şekilde takın. Tripsin osteoklast öncülerini aktive edebilir ve kaçınılmalıdır.
2. 50 ml konik tüp, her çanak ve aktarım hücrelere 4 ml α-MEM ekleyin. Bir hemasitometre kullanarak hücreleri sayın ve mi, 5 x 10 ⁴ hücre / bir yoğunluğa hücreleri sulandırmak ve 100 ng / ml 'lik bir nihai konsantrasyona kadar 35 ng / ml ve RANKL nihai konsantrasyona M-CSF ekleyin.
3. Doku kültürü ile muamele edilmiş plakalara 2.6 x 10 ⁴ hücre / ^cm2 yoğunluğunda tohum hücreleri ve 2 gün boyunca nemlendirilmiş bir doku kültürü kuluçka makinesi içinde 37 ° C'de inkübe edin. Farklılaşma, tipik olarak 5 x 10 ⁴ hücre her bir kuyunun içine ekilir 24 oyuklu plakalar içinde gerçekleştirilmektedir.
4. 2 gün 1 ml taze osteoc ile ortamının değiştirilmesiyle farklılık yeniden besleme hücrelerinin başladıktan sonraGeçen ortam.
   Not: osteoklast başkalaşımı, genellikle 3 gün içinde tamamlanır. Ortaya çıkan osteoklastlar TRAP-lekeli kolay ölçümü ve morfolojik analizler için olabilir.

Jagged1 kaplı Yüzeyli Notch Sinyal 5. Sürekli Stimülasyon

1. 10 ug / ml bir konsantrasyonda PBS içinde keçi anti-insan IgG Fc antikoru Askıya (1: 10 mg / ml stok 1000 seyrelti). 1.3 ug / ^cm2 'lik bir yoğunlukta kültür yüzey antikor solüsyonu ilave edin ve 1 saat oda sıcaklığında inkübe edin. 24 oyuklu plakalar halinde, oyuk başına 250 ul (2.5 ug) ilave edilir.
2. Vakum aspirasyon kuyuları ve 1 ml PBS ile doldurun. Bu adımı 2 kez tekrarlayın.
3. 10 ug / ml'lik bir konsantrasyonda PBS içinde yeniden birleştirici Jagged1-Fc füzyon proteinini süspanse edin. 1.3 ug / ^cm2 'lik bir yoğunlukta antikor kaplı kültür yüzey Jagged1-YP solüsyonu ilave edin ve 2 saat oda sıcaklığında inkübe edin. Kültür yüzey antikoru ONL ile kaplanmışY kontrol olarak da kullanılabilir.
4. Vakum aspirasyon kuyuları ve 1 ml PBS ile doldurun. Bu adımı 2 kez tekrarlayın. kurumasını önlemek için tohumlama hücre hemen önce kadar kuyu PBS tutun.
5. Tohum 2.6 x 10 ⁴ osteoklast ön-maddeleri / kaplanmış yüzeyler üzerine ^cm2. Çentik sinyal sürekli en az 3 gün süre ile teşvik edilecektir.

Jagged1 kaplı Boncuk ile Notch Sinyal 6. Geçici Stimülasyon

1. 1.5 ml'lik bir son hacimde 0.5 mg / cm ² Jagged1-Fc, 21 ul / ^cm2 protein G agaroz boncuklar, ve PBS: uygun boyutta bir boru aşağıdaki birleştirin. Bir 24 yuvalı plaka 1 kuyu için Jagged1 boncuk yeterli sayıda hazırlanması 1.5 ml 1 ug Jagged1-Fc, 40 ul protein G agaroz boncuklar, ve PBS birleştirmek için.
2. 4 dönme ile tüp inkübe 2 saat ° C.
3. Pelet tanelerine 1 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj tüpü. 1.5 ml PBS içinde süspanse boncuk. Bu yıkama tekrarlayın2 kez daha.
4. 130 ul / ^cm2, kültür ortamı içinde yeniden süspanse Jagged1 boncuk ve kültürlenmiş hücrelere uygulanır.
5. İstenen süre için _CO2 37 ° C'de boncuk hücreleri inkübe ve% 5. PBS veya kültür ortamının çok yıkama ile boncuk çıkarın.
6. Notch hedef gen kopyalarının ¹⁰ ölçümü yoluyla Notch sinyal aktivasyonunu doğrulayın.

Sonuçlar

Bu yöntemin amacı, kültürüne ve osteoklast öncüleri olarak Notch sinyali uyarır. Düzgün kültürlenmiş, osteoklast ön-maddeleri düzgün bir sitoplazma (Şekil 1A) ile esas olarak uzunlamasına aks-benzeri morfolojiye sergiler. Bakım osteoklast öncülerinin immünolojik aktivasyon önlemek için alınmalıdır. Aktivasyonu üzerine, ön-yayılmış ve köpüksü sitoplazma (Şekil 1B) basık hale gelir. Bu "kızarmış yumurta" h?...

Tartışmalar

protokolü içinde kritik adımlar

Kültür ve osteoklast ön-maddeleri arasında nitro farklılaşmasında osteoclastogenez ve kemik rejenerasyonu ve kemik kütlesinin korunması için terapötik hedeflerin tanımlanması moleküler mekanizmalarının incelenmesi için yararlı bir platform sağlar. Fare osteoklast öncülerini kültürlerken, en kritik unsur, bir naif bir durumda öncüleri bakımıdır. makrofaj-benzeri hücreler olarak, osteoklast ön-maddeleri, bakteriyel bileşen...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Recombinant mouse M-CSF	Biolegend	576402	Available from multiple suppliers, test activity before experiments
Recombinant mouse RANKL	Shenandoah Biotechnology	200-04	Available from multiple suppliers, test activity before experiments
Recombinant human Jagged1-Fc	R&D Systems	1277-JG-050	Available from multiple suppliers, test activity before experiments
Protein G agarose beads	InvivoGen	gel-agg-2
Goat anti-human IgG Fc	Jackson ImmunoResearch	109-001-008
Minimum Essential Medium powder	Sigma-Aldrich	M0894
Accutase cell dissociation reagent	ThermoFisher	A1110501	Used to lift osteoclast precursors
Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit	Sigma-Aldrich	387A-1KT	Used to stain differentiated osteoclasts