גירוי של מערכת איתות Notch עכבר osteoclast המבשר

Summary

Notch signaling is a form of cellular communication that relies upon direct contact between cells. To properly induce Notch signaling in vitro, Notch ligands must be presented to cells in an immobilized state. This protocol describes methods for in vitro stimulation of Notch signaling in mouse osteoclast precursors.

Abstract

Notch signaling is a key component of multiple physiological and pathological processes. The nature of Notch signaling, however, makes in vitro investigation of its varying and sometimes contradictory roles a challenge. As a component of direct cell-cell communication with both receptors and ligands bound to the plasma membrane, Notch signaling cannot be activated in vitro by simple addition of ligands to culture media, as is possible with many other signaling pathways. Instead, Notch ligands must be presented to cells in an immobilized state.

Variations in methods of Notch signaling activation can lead to different outcomes in cultured cells. In osteoclast precursors, in particular, differences in methods of Notch stimulation and osteoclast precursor culture and differentiation have led to disagreement over whether Notch signaling is a positive or negative regulator of osteoclast differentiation. While closer comparisons of osteoclast differentiation under different Notch stimulation conditions in vitro and genetic models have largely resolved the controversy regarding Notch signaling and osteoclasts, standardized methods of continuous and temporary stimulation of Notch signaling in cultured cells could prevent such discrepancies in the future.

This protocol describes two methods for stimulating Notch signaling specifically in cultured mouse osteoclast precursors, though these methods should be applicable to any adherent cell type with minor adjustments. The first method produces continuous stimulation of Notch signaling and involves immobilizing Notch ligand to a tissue culture surface prior to the seeding of cells. The second, which uses Notch ligand bound to agarose beads allows for temporary stimulation of Notch signaling in cells that are already adhered to a culture surface. This protocol also includes methods for detecting Notch activation in osteoclast precursors as well as representative transcriptional markers of Notch signaling activation.

Introduction

מסלול איתות Notch היונק הוא הומולוגי לאותו המסלול ב תסיסנית והיא מורכבת מארבעה קולטנים Notch הטרנסממברני (Notch1-4) וחמישה הליגנדים קרום נכנס של Jagged (JAG1 & JAG2) ודלתא הדמוית (DLL1, 3, & 4) משפחות ^1. איתות Notch מופעלת כאשר הקולטן Notch על תא מקבל מחויב ליגנד על תא שידור ^2. במהלך הפעלה טראנס זה, ליגנד Notch הקרום נכנס מייצר כוח מתיחה על קולט Notch הקרום נכנס ^{3, 4.} הכח המתיח של ליגנד מחייב גורם לשינויי קונפורמציה הקולטן Notch המאפשרים מחשופות תאים של הקולטן על ידי TNFalpha המרת אנזים (TACE) ואחריו אירוע מחשוף תאיים מתווך על ידי גמא-secretase המכיל presenilin המורכב (γ-secretase). γ-secretase ומשחרר את Notch intתחום racellular (NiCd) אשר translocates לתוך הגרעין בו צורות מתחם הפעלה תעתיק עם CBF-1-סו (H) -Lag-1 (CSL), המוח דמוי (maml), וגורמים סוג תא ספציפי לנהוג ביטוי של למקד גנים ^5.

האלמנטים המכאניים של תוצאת הפעלת איתות Notch בצורך השיטות ייחודיות של הפעלת מסלול Notch במבחנה. הליגנדים Notch מסיסים יכולים להיקשר Notch קולטנים, אבל לא מצליחים לייצר מתיחה הכוחות הדרושים לשחרור NiCd ובאותו זמן עיכוב תחרותי מחייב של הליגנדים Notch הקשורים התא. לפיכך, תוספת של הליגנדים Notch מסיסים עד בינוני התרבות יכולה להחליש Notch הנורמלי איתות ^{6, 7.} למרבה המזל, הליגנדים Notch יכול לגרום לשחרור NiCd אם הם קבועים כדי מצע קשיח כראוי ^{5, 8, 9,10.} זריעת תאים על מצעים תרבות מצופה ליגנד או החלת חרוזים מצופים ליגנד לתאים שניהם יכולים להפעיל Notch signaling, והבחירה ביניהן תלויה בעיקר בתזמון הרצוי של גירוי Notch. להגברת פעילות איתות Notch מיידית, זמנית, כפי שניתן היה רצוי במהלך האמצע של assay תפקודית או בידול, ליגנד Notch יכול להיות מאוגד agarose חרוזים, הוחלו תאים בתרבית, ו סחוט בכל עת. לאיתות Notch מתמשכת יותר מתחילת תקופת תרבות, צלחות בתרבית רקמה יכולות להיות מצופות ליגנד לפני זריעת תאים.

למטרות פרוטוקול זה, שיטות מתבצעות באמצעות מבשרי osteoclast העכבר, אבל שיטות וריאציות על השיטות שתוארו כאן ישימות למגוון רחב של סוגי תאים ^{6, 11, 12, 13, 14.} Osteoclasts הם סופני תאי linage hematopoietic הבדילו כי האחראים הספיגים של רקמת עצם, והם מעורבים בהפרעות מרובות של עצם פסד ^15. לפיכך, במחקר במבחנה של הבידול של osteoclasts מ מבשר מונוציטים / מקרופאג השושלת שלהם ואת המנגנונים המולקולריים השולטים תפקידם חיוני להבנה טובה יותר של osteoclasts ופיתוח של טיפולי עצם התחדשות חדשים. ואילו כיום הוא מקובלים כי איתות Notch ממלאת תפקיד חיוב הבידול והתפקוד של osteoclasts, וריאציות בשתי תרבות מבשר Notch איתות גירוי osteoclast וההבחנה הובילו לממצאים סותרים בתחילה ^{16, 17, 18, 19.} בדיקה מדוקדקת יותר של ההבדלים בשיטות ושימוש גנטייםמודלים מאוד הבהירו את התפקיד של Notch איתות osteoclastogenesis, אבל יישום של שיטות התרבות וגירוי Notch סטנדרטיות יכול למנוע מחלוקות כאלה במחקרים עתידיים של Notch איתות סוגי תאים אחרים ^{20, 21, 22, 23.}

ישנן מספר שיטות culturing ומבדל מבשרי osteoclast העכבר, וכמו עם שיטות שונות עבור מגרת Notch signaling, השיטה הטובה ביותר תהיה תלויה בשאלה הניסיונית. בזאת, השיטה המועדפת עלינו culturing שברים חסידים לא חסידים של תאי מח הסמוקים מן העצמות ארוכות עכבר יוצגה. שיטה זו יש יתרון בכך שנדרש למעשה שום ציוד מיוחד והפקת תאים החלימו על מגוון של שיטות בידול.

Protocol

כל המחקר מעורב בעלי חיים בעלי חוליות בוצע בהתאם פרוטוקולים שאושרו על ידי האוניברסיטה של ​​טיפול בבעלי החיים המוסדי פנסילבניה ועדת שימוש (IACUC).

1. הכנת מדיה ותרבות

1. הכן α-MEM ידי המסת מדיום חיוני מינימום אבקת (MEM) ו סודיום ביקרבונט 1.9 גרם ב 900 מ"ל H ₂ O ו להשלים עם 2 מ"מ L- גלוטמין, 100 יחידות / פניצילין מ"ל, 100 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין, ו -100 מ"ל תרמי בסרום שור עובר מומת. לעקר באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר polyethersulfone (PES).
2. הכן בינוני מקרופאג ידי השלמת α-MEM עם 35 ng / עכבר רקומביננטי מ"ל פקטור מגרה Macrophage-קולוני (M-CSF)
3. הכן בינוני osteoclast ידי משלים בינוני מקרופאג עם 100 RANKL ng / ml

2. בידוד תא מח עצם

1. מלאו מזרק אחד 10 מ"ל עם מחט מד 25⅝ לכל עכבר עם 10 מ"ל α-MEM.
2. להרדים עכברים באמצעות 10 דקות חשיפת CO ₂ בקצב זרימה של 1.3 ליטר / דקה. ודא מוות חיה על ידי ביצוע CO ₂ חשיפה עם נקע בצוואר הרחם לפני שתמשיך עם לנתיחה.
3. באמצעות טכניקה נקייה, לנתח את ולהפריד את tibiae ואת femora. לחטא את עור עכבר עם אתנול 70% לפני ביצוע חתך על פני השטח הקדמיים של כל גפיים אחוריים כדי לחשוף את עצם השוק ועצם ירך.
   1. חותך דרך מפרק הברך לשחרר את הקצה הדיסטלי של עצם הירך, לחתוך דרך הירך קרובה האגן ככל האפשר. הסר את הירך ולנקות כמו הרבה רקמות רכות ככל האפשר. כדי להסיר את השוקה, ביקע את הקרסול להסיר כמה שיותר רקמה רכה ככל האפשר.
4. החזק את העצם עם מלקחיים מח סומק לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל עם טמפרטורה 2.5 מ"ל חדר α-MEM שילוב גלי מוח של עכבר בודד לתוך צינור אחד.
   הערה: סומק מח מוצלח ישנה את הצבע של tהוא עצם מאדום בז '.
5. אפשר ושיירי ליישב לתחתית של התחתית ולהעביר supernatant אל בלטפל נקי חרוטי 15 מ"ל הצינור כדי למנוע העברת כל פסולת.
   הערה: כמה תאים עשויים גם להתיישב עם פסולת המח. אם מספר גדול יותר של תאים נדרש, גלי מוח ניתן לסנן דרך מסננת תא 70 מיקרומטר לתוך שפופרת 15 מ"ל נקי.
6. צינור צנטריפוגה (ים) ב XG 300 עבור 5min בטמפרטורת החדר כדי גלולה התאים.
7. אבק לשאוב התא גלולה supernatant ו resuspend ב 0.5 מ"ל אמוניום-כלוריד-אשלגן (ACK) lysing חיץ לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות כדי lyse כדוריות דם אדומות.
8. הוסף 10 מ"ל PBS ישירות ACK תאים פתרון, ו צנטריפוגות ב XG 300 במשך 5 דקות.
   הערה: תא גלולה אדומה בעבר כעת אמור להיות בצבע בז '.
9. supernatant לשאוב אבק ו resuspend גלולה ב 10 מ"ל α-MEM, צלחת בצלחת תרבות שטופלו רקמות 100 מ"מ. דגירה תאים לילה בשעה 37 מעלות צלזיוס humidifiedחממה בתרבית רקמה.
   הערה: ספירת תאים אין צורך בשלב זה. במהלך תקופה זו, תאים חסידים ממח העצם יצרפו אל פני שטח התרבות; לא חסידי אוכלוסיות תאים במח עצם תישארנה השעיה. MCSF אינו נוכח במדיום התרבות במהלך דגירה ראשונית זו.

3. העשרה של מבשרי osteoclast

1. לאחר הדגירה לילה של גלי מוח, supernatant תרבות העברה המכיל תאים שאינם חסיד צינור חרוטי 50 מ"ל.
   הערה: מנות תרבות עם תאים חסידים, הכוללים ובתאי mesenchymal מח עצם, יכולה להיות מושלכת או נמאס עם ממ α טרי, אם תרצה בכך לניסויים אחרים.
   הערה: ניתן להבדיל osteoclasts ישירות מתאי לא חסיד מח עצם אלה על ידי ציפוי אותם הכלים תרבות שטופלו רקמות בצפיפות של 4 x 10 ⁵ תאים / ² ס"מ במדיום osteoclast ובינוניים מרענן פעם ביומיים במשך 5 ימים.
2. להוסיף α-MEM כדי פתרון התא לא חסיד לנפח סופי של 18 מ"ל ולהוסיף M-CSF לריכוז סופי של 35 ng / ml.
3. הוסף 3 מ"ל של ההשעיה תא אחד עד 6 60 מ"מ צלחות תרבות ההשעיה.
4. דגירה צלחות לילה ב 37 מעלות צלזיוס חממה בתרבית רקמה humidified. במהלך תקופה זו, M-CSF יעודד בידול של מקרופאגים, אשר יכול לדבוק גם על משטחי תרבות שטופל שאינם רקמות.
5. לאחר דוגרים לילה, מחדש להאכיל מבשרי osteoclast עם המדיום מקרופאג טרי 3 מ"ל. פעולה זו תסיר שאינה חסידים תאים שלא הבדילו לתוך מקרופאגים.
6. המשך מבשרי osteoclast תרבות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ על 2 ימים או עד תרבויות מגיעות למפגש בערך 70%.

4. בידול osteoclast

1. לשטוף מבשרי osteoclast עם 5 מ"ל PBS ולטפל תאים עם 1 מ"ל פרוטאוליטים ימיים-המוצא / אנזים collagenolytic בטמפרטורת החדר עד cells ניתן וחילצה על ידי הקשה עדינה של הצלחת.
   הערה: מבשרי osteoclast ניתן להרים רק אם הם בתרבית מנות ההשעיה; מבשרים לצרף גם בתקיפות למשטחי תרבות שטופלה רקמות להיות הרים. טריפסין יכול להפעיל מבשרי osteoclast יש להימנע.
2. הוסף 4 מ"ל α-MEM לכל התאים צלחת והעברת צינור חרוטי 50 מ"ל. ספירת תאים באמצעות hemocytometer ו לדלל התאים בצפיפות של 5 x 10 ⁴ תאים / מ"ל ולהוסיף M-CSF לריכוז סופי של 35 ng / ml ו RANKL לריכוז סופי של 100 ng / ml.
3. תאי זרע בצפיפות של 2.6 x 10 ⁴ תאים / ² ס"מ לתוך צלחות תרבות שטופלו רקמות לדגור על 37 מעלות צלזיוס חממה בתרבית רקמה humidified למשך 2 ימים. הבידול מבוצע בדרך כלל 24 גם צלחות, שבו 5 x 10 ⁴ תאים הם זורעים לתוך כל טוב.
4. 2 ימים לאחר תחילת תאי בידול, מחדש ההזנה באמצעות החלפה בינונית עם 1 מיליליטר osteoc הטריהמדיום האחרון.
   הערה: בידול osteoclast בדרך כלל יהיה שלם בתוך 3 ימים. osteoclasts וכתוצאה מכך ניתן מוכתם TRAP כימות קל ניתוח מורפולוגי.

5. גירוי רציף של איתות Notch עם משטח מצופה Jagged1

1. להשעות נוגדן IgG Fc אנטי אנושי עז PBS בריכוז של 10 מיקרוגרם / מ"ל ​​(1: 1,000 דילול של 10 מ"ג / ml המלאי). הוסף פתרון נוגדנים משטח התרבות בצפיפות של 1.3 מיקרוגרם / ² ס"מ ו דגירה בטמפרטורת החדר למשך שעה 1. במקרה של צלחות 24-היטב, מוסיפים 250 μl (2.5 מיקרוגרם) לכל טוב.
2. בארות לשאוב אבק ולמלא עם 1 מ"ל PBS. חזור על פעולה זו 2 פעמים.
3. להשעות חלבון היתוך Jagged1-Fc רקומביננטי PBS בריכוז של 10 מיקרוגרם / מ"ל. הוסף פתרון Jagged1-FC אל פני השטח תרבות מצופה נוגדן בצפיפות של 1.3 מיקרוגרם / ² ס"מ ו דגירה בטמפרטורת החדר למשך 2 שעות. משטחי תרבות מצופים onl הנוגדןy יכול לשמש שולטים.
4. בארות לשאוב אבק ולמלא עם 1 מ"ל PBS. חזור על פעולה זו 2 פעמים. שמור PBS בבארות עד זמן קצר לפני תא זריעה כדי למנוע מהם הייבוש.
5. זרע 2.6 x 10 ⁴ מבשרי osteoclast / ² ס"מ על משטחים מצופים. איתות Notch תהיה מגורה ברציפות במשך 3 ימים לפחות.

6. גירוי זמני של מערכת האיתות Notch עם חרוזים מצופים Jagged1

1. מערבבים את הבאים בצינור בגודל מתאים: 0.5 מיקרוגרם / ² ס"מ Jagged1-FC, 21 μl / ² ס"מ חרוזים חלבון G agarose, ו- PBS לנפח סופי של 1.5 מ"ל. כדי להכין מספר מספיק של חרוזים Jagged1 עבור 1 גם צלחת 24 היטב, לשלב 1 מיקרוגרם Jagged1-FC, 40 חרוזים μl חלבון G agarose, ו- PBS 1.5 מ"ל.
2. דגירת צינור עם סיבוב ב 4 ° צלזיוס למשך 2 שעות.
3. צנטריפוגה צינור ב XG 300 דקות 1 חרוזים גלולים. חרוזים Resuspend ב 1.5 מ"ל PBS. חזור על זה לשטוףפי 2 יותר.
4. Resuspend Jagged1 החרוזים 130 μl / ² ס"מ בינוני תרבות ולמרוח על תאים בתרבית.
5. דגירת תאים עם חרוזים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ עבור תקופה רצויה. סר חרוז עם כמה שטיפות של PBS או בינוני תרבות.
6. ודא הפעלת איתות Notch באמצעות מדידה של תמלילי גן מטרת Notch ^10.

תוצאות

מטרת השיטה היא התרבות לעורר Notch איתות מבשר osteoclast. כאשר כראוי תרבותי, מבשרי osteoclast להפגין מורפולוגיה ציר בצורה מוארכת בעיקר עם הציטופלסמה חלקה (איור 1 א). יש להקפיד כדי להימנע מהפעלת אימונולוגיים של מבשרי osteoclast. לאחר ההפעלה, מבשרי להתפשט ולהפו?...

Discussion

צעדים קריטיים בתוך הפרוטוקול

תרבות בידול במבחנה של מבשרי osteoclast מספקת פלטפורמה שימושית לחקירה של מנגנונים מולקולריים של osteoclastogenesis וזיהוי מטרות טיפוליות עבור התחדשות עצם ושימור מסת עצם. כאשר culturing מבשר osteoclast העכבר, האלמנט הקר?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Recombinant mouse M-CSF	Biolegend	576402	Available from multiple suppliers, test activity before experiments
Recombinant mouse RANKL	Shenandoah Biotechnology	200-04	Available from multiple suppliers, test activity before experiments
Recombinant human Jagged1-Fc	R&D Systems	1277-JG-050	Available from multiple suppliers, test activity before experiments
Protein G agarose beads	InvivoGen	gel-agg-2
Goat anti-human IgG Fc	Jackson ImmunoResearch	109-001-008
Minimum Essential Medium powder	Sigma-Aldrich	M0894
Accutase cell dissociation reagent	ThermoFisher	A1110501	Used to lift osteoclast precursors
Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit	Sigma-Aldrich	387A-1KT	Used to stain differentiated osteoclasts