La stimolazione di Notch segnalazione in mouse osteoclasti Precursori

Riepilogo

Notch signaling is a form of cellular communication that relies upon direct contact between cells. To properly induce Notch signaling in vitro, Notch ligands must be presented to cells in an immobilized state. This protocol describes methods for in vitro stimulation of Notch signaling in mouse osteoclast precursors.

Abstract

Notch signaling is a key component of multiple physiological and pathological processes. The nature of Notch signaling, however, makes in vitro investigation of its varying and sometimes contradictory roles a challenge. As a component of direct cell-cell communication with both receptors and ligands bound to the plasma membrane, Notch signaling cannot be activated in vitro by simple addition of ligands to culture media, as is possible with many other signaling pathways. Instead, Notch ligands must be presented to cells in an immobilized state.

Variations in methods of Notch signaling activation can lead to different outcomes in cultured cells. In osteoclast precursors, in particular, differences in methods of Notch stimulation and osteoclast precursor culture and differentiation have led to disagreement over whether Notch signaling is a positive or negative regulator of osteoclast differentiation. While closer comparisons of osteoclast differentiation under different Notch stimulation conditions in vitro and genetic models have largely resolved the controversy regarding Notch signaling and osteoclasts, standardized methods of continuous and temporary stimulation of Notch signaling in cultured cells could prevent such discrepancies in the future.

This protocol describes two methods for stimulating Notch signaling specifically in cultured mouse osteoclast precursors, though these methods should be applicable to any adherent cell type with minor adjustments. The first method produces continuous stimulation of Notch signaling and involves immobilizing Notch ligand to a tissue culture surface prior to the seeding of cells. The second, which uses Notch ligand bound to agarose beads allows for temporary stimulation of Notch signaling in cells that are already adhered to a culture surface. This protocol also includes methods for detecting Notch activation in osteoclast precursors as well as representative transcriptional markers of Notch signaling activation.

Introduzione

Il percorso di segnalazione Notch dei mammiferi è omologa alla stessa via in Drosophila melanogaster e si compone di quattro recettori transmembrana Notch (Notch1-4) e cinque ligandi di membrana della Jagged (JAG1 & JAG2) e Delta-like (DLL1, 3, e 4) le famiglie ^1. Notch viene avviata quando il recettore Notch su una cellula ricevente è vincolato da ligando su una cella di trasmissione ^2. Nel corso di questo trans-attivazione, il Notch ligando legato alla membrana produce una forza che si estende sul Notch recettore di membrana ^{3, 4.} La forza di stiramento del ligando di legame induce cambiamenti conformazionali del recettore Notch che facilitano scissione extracellulare del recettore da TNFalfa enzima di conversione (TACE) seguito da un evento clivaggio intracellulare mediato da un gamma-secretasi complesso (γ-secretasi) presenilina-contenenti. γ-secretasi rilascia la int Notchdominio racellular (NiCd), che trasloca nel nucleo dove forma un complesso trascrizionale con CBF-1-Su (H) -Lag-1 (CSL), mente-like (MAML), e fattori specifici tipo di cellula a guidare l'espressione di geni bersaglio ^5.

Gli elementi meccanici di risultato di attivazione del segnale di Notch nella necessità di metodi unici di attivazione Notch percorso in vitro. leganti Notch solubili possono legarsi ai recettori Notch, ma non riescono a produrre estende forze necessarie per il rilascio NiCd mentre allo stesso tempo inibizione competitiva del legame di ligandi Notch associati alle cellule. Così, l'aggiunta di ligandi solubili Notch a mezzo di coltura può attenuare Notch normale segnalazione ^{6, 7.} Fortunatamente, leganti Notch possono indurre liberazione NICD se sono fissati ad un substrato adeguatamente rigida ^{5, 8, 9,10.} Semina cellule su substrati di coltura ligando rivestite o l'applicazione di perline ligando rivestite di cellule in grado di attivare sia segnale di Notch, e la scelta tra i due dipende in primo luogo la tempistica desiderata della stimolazione Notch. Infatti, l'attivazione di Notch immediata temporanea, come sarebbe desiderato durante il punto medio di un saggio funzionale o differenziazione, Notch ligando può essere associato a agarosio perline, applicati alle cellule in coltura, e lavato in qualsiasi momento. Per ulteriori Notch sostenuta dall'inizio di un periodo di coltura, piastre di coltura di tessuto possono essere rivestiti con legante prima della semina cellulare.

Ai fini di questo protocollo, i metodi vengono effettuati utilizzando il mouse precursori degli osteoclasti, ma i metodi e le variazioni sui metodi qui descritti sono applicabili ad un'ampia varietà di tipi cellulari ^{6, 11, 12, 13, 14.} Gli osteoclasti sono cellule terminalmente differenziate Linage ematopoietiche che sono responsabili per il riassorbimento del tessuto osseo, e sono implicati in molteplici disturbi della perdita di massa ossea ^15. Così, studio in vitro della differenziazione degli osteoclasti dai loro precursori monociti / macrofagi lignaggio e dei meccanismi molecolari che controllano la loro funzione è essenziale per una migliore comprensione degli osteoclasti e sviluppo di nuove terapie osso-rigenerante. Mentre è ormai generalmente accettato che la segnalazione Notch gioca un ruolo positivo nella differenziazione e la funzione degli osteoclasti, variazioni sia la stimolazione di Notch e osteoclasti cultura precursore e la differenziazione ha portato a risultati contraddittori inizialmente ^{16, 17, 18, 19.} Un esame più attento delle differenze nei metodi e l'uso di geneticamodelli sono notevolmente chiarito il ruolo della segnalazione Notch in osteoclastogenesis, ma l'applicazione di metodi di stimolazione e cultura Notch standardizzati potrebbero impedire tali controversie in studi futuri di segnalazione di Notch in altri tipi cellulari ^{20, 21, 22, 23.}

Esistono diversi metodi per la coltura e differenziare precursori del mouse osteoclasti, e, come con vari metodi per stimolare segnalazione Notch, il metodo migliore dipenderà dalla domanda sperimentale. Qui, sarà presentato il nostro metodo preferito di coltura frazioni aderenti e non aderenti di cellule di midollo lavata dalle ossa lunghe del mouse. Questo metodo ha il vantaggio di richiedere essenzialmente alcun attrezzature specializzate e produrre cellule che sono applicabili ad una varietà di metodi di differenziazione.

Protocollo

Tutte le ricerche sugli animali vertebrati è stata eseguita in conformità con i protocolli approvati dalla University of Pennsylvania Istituzionale cura degli animali e del Comitato uso (IACUC).

1. Culture Media Preparazione

1. Preparare α-MEM sciogliendo medium (MEM) in polvere essenziale minimo e 1,9 g di bicarbonato di sodio in 900 ml di H ₂ O e integrare con 2 mM L-glutammina, 100 unità / ml di penicillina, 100 ug / ml di streptomicina e 100 ml calore siero fetale bovino inattivato. Sterilizzare usando un filtro di 0,22 micron polietersulfone (PES).
2. Preparare medio macrofagi, completandolo α-MEM con 35 ng / ml ricombinante topo macrofagi fattore stimolante le colonie (M-CSF)
3. Preparare medio degli osteoclasti, completandola medio macrofagi con 100 RANKL ng / ml

L'isolamento delle cellule 2. midollo osseo

1. Riempire una siringa da 10 ml con un ago calibro 25⅝ per mouse con 10 ml di α-MEM.
2. Euthanize topi via 10 min esposizione a CO ₂ ad una portata di 1,3 L / min. Garantire la morte degli animali seguendo CO ₂ l'esposizione con la dislocazione cervicale prima di procedere con la dissezione.
3. Usando una tecnica pulita, sezionare e separeranno i tibie e femori. Disinfettare la pelle del mouse con il 70% di etanolo prima di fare un'incisione lungo la superficie anteriore di ogni arto posteriore per esporre la tibia e femore.
   1. Tagliare il ginocchio per liberare l'estremità distale del femore, e tagliare il femore più vicino al bacino possibili. Rimuovere il femore e pulire il tessuto più morbido possibile. Per rimuovere la tibia, tagliare la caviglia e rimuovere quanto più tessuti molli possibile.
4. Tenere l'osso con una pinza e di midollo a filo in un tubo da 15 ml con 2,5 ml di temperatura ambiente α-MEM combinando vampate osseo da un singolo mouse in un unico tubo.
   NOTA: Un rossore midollo successo cambierà la colorazione di tegli osso dal rosso al beige.
5. Lasciare che i detriti di depositarsi sul fondo della provetta e trasferire il surnatante in un ambiente pulito tubo da 15 ml avendo cura di evitare il trasferimento di eventuali detriti.
   NOTA: Alcune cellule possono risolvere con i detriti osseo. Se è necessario un maggior numero di cellule, vampate osseo possono essere filtrati attraverso un filtro cella 70 micron in una provetta pulita 15 ml.
6. provetta da centrifuga (s) a 300 xg per 5 min a temperatura ambiente a pellet cellule.
7. Vacuum aspirare il surnatante e risospendere pellet di cellule in 0,5 ml di ammonio-cloruro-potassio (ACK) lisi buffer e incubare a 37 ° C per 3 minuti per lisare i globuli rossi.
8. Aggiungere 10 ml di PBS direttamente su ACK-cell soluzione e centrifugare a 300 xg per 5 min.
   NOTA: Il pellet cellulare precedentemente rosso dovrebbe essere beige.
9. Vacuum aspirare il surnatante e risospendere pellet in 10 ml di α-MEM, e la piastra in un piatto di coltura trattata mm tessuto 100. Incubare le cellule notte a 37 ° C in un umidificatatessuto cultura incubatore.
   NOTA: Conteggio cellule non è necessario per questo passaggio. Durante questo tempo, cellule aderenti dal midollo osseo si attaccarsi alla superficie coltura; popolazioni di cellule di midollo osseo non aderenti rimarranno in sospensione. MCSF non è presente nel mezzo di coltura durante questo incubazione iniziale.

3. Arricchimento di osteoclasti Precursori

1. Dopo incubazione durante la notte delle vampate di midollo, il trasferimento di cultura surnatante contenente le cellule non aderenti a un tubo da 50 ml.
   NOTA: i piatti di coltura con cellule aderenti, tra cui le cellule del midollo mesenchimali progenitrici del midollo, può essere scartato o alimentati con fresco α-MEM, se lo si desidera per altri esperimenti.
   NOTA: osteoclasti possono essere differenziati direttamente da queste cellule di midollo osseo non aderenti da essi placcatura in tessuto piatti di coltura trattata ad una densità di 4 x 10 ⁵ cellule / cm ² in terreno osteoclasti e medio rinfrescante ogni altro giorno per 5 giorni.
2. Aggiungere α-MEM per soluzione di cellule non aderente ad un volume finale di 18 ml e M-CSF ad una concentrazione finale di 35 ng / ml.
3. Aggiungere 3 ml di sospensione cellulare ciascuna a 6 piatti della cultura sospensione di 60 mm.
4. Incubare le piastre per una notte a 37 ° C in un incubatore umidificato coltura tissutale. Durante questo tempo, M-CSF stimolerà differenziazione dei macrofagi, che possono aderire anche a superfici di coltura trattato non-tessuto.
5. Dopo l'incubazione durante la notte, ri-alimentazione precursori degli osteoclasti con 3 ml di mezzo macrofagi fresco. Questo rimuovere le cellule non aderenti che non sono differenziate in macrofagi.
6. Continuare a cultura precursori degli osteoclasti a 37 ° C e 5% di CO ₂ per 2 giorni o fino a quando le culture raggiungono circa il 70% di confluenza.

4. Osteoclasta Differenziazione

1. Lavare precursori degli osteoclasti con 5 ml di PBS e il trattamento di cellule con 1 ml marine origine proteolitico / enzima collagenolitica a temperatura ambiente fino al cells possono essere sloggiati con lievi colpetti della piastra.
   NOTA: Osteoclasta precursori possono essere sollevati solo se sono coltivate in piatti di sospensione; precursori attribuiscono troppo saldamente alle superfici di coltura di tessuti trattati da sollevare. Tripsina può attivare precursori degli osteoclasti e deve essere evitato.
2. Aggiungere 4 ml di α-MEM per ciascuno cellule piatto e trasferire in una provetta da 50 ml. Contare le cellule utilizzando un emocitometro e diluire le cellule ad una densità di 5 x 10 ⁴ cellule / ml e aggiungere M-CSF ad una concentrazione finale di 35 ng / ml e RANKL ad una concentrazione finale di 100 ng / ml.
3. Cellule Seed ad una densità di 2,6 x 10 ⁴ cellule / cm ² in piastre di coltura dei tessuti trattati e incubare a 37 ° C in un incubatore umidificato coltura tissutale per 2 giorni. Differenziazione è tipicamente effettuata in piastre da 24 pozzetti, dove 5 x 10 ⁴ cellule sono seminate in ogni pozzetto.
4. 2 giorni dopo l'inizio delle cellule differenziazione, ri-alimentazione sostituendo medio di 1 ml osteoc frescaultima media.
   NOTA: la differenziazione degli osteoclasti solito sarà completa entro 3 giorni. osteoclasti risultante può essere TRAP-macchiato per una facile quantificazione e analisi morfologica.

5. Stimolazione Continua di Notch segnalazione con superficie rivestita Jagged1

1. Sospensione di capra anti-IgG umane Fc degli anticorpi in PBS ad una concentrazione di 10 ug / ml (1: 1.000 diluizione 10 mg / ml magazzino). Aggiungere la soluzione di anticorpi sulla superficie coltura ad una densità di 1,3 g / cm ² e incubare a temperatura ambiente per 1 ora. Nel caso di piastre da 24 pozzetti, aggiungere 250 microlitri (2,5 mcg) per pozzetto.
2. Aspirare pozzi vuoto e riempire con 1 ml di PBS. Ripetere questa operazione 2 volte.
3. Sospendere ricombinante Jagged1-Fc proteina di fusione in PBS ad una concentrazione di 10 ug / ml. Aggiungere la soluzione Jagged1-FC alla superficie coltura anticorpi rivestita con una densità di 1,3 g / cm ² e incubare a temperatura ambiente per 2 ore. superfici Cultura rivestite con un anticorpo only possono essere usati come controlli.
4. Aspirare pozzi vuoto e riempire con 1 ml di PBS. Ripetere questa operazione 2 volte. Mantenere PBS in pozzetti fino a poco prima cella semina per impedire loro di essiccazione.
5. Seed 2.6 x 10 ⁴ osteoclasti precursori / cm ² su superfici rivestite. Notch sarà continuamente stimolata per almeno 3 giorni.

6. La stimolazione temporanea di Notch segnalazione con Perle Jagged1 rivestite

1. Combinare il seguente in una provetta di dimensioni: 0,5 mg / cm ² Jagged1-Fc, 21 microlitri / cm ² perline proteina G agarosio, e PBS fino ad un volume finale di 1,5 ml. Per preparare un numero adeguato di perline Jagged1 per 1 pozzetto di una piastra ben 24, unire 1 mg Jagged1-Fc, 40 proteine ​​ul G perline agarosio, e PBS a 1,5 ml.
2. Incubare tubo con rotazione a 4 ° C per 2 ore.
3. provetta da centrifuga a 300 xg per 1 minuto a perline pellet. perline risospendere in 1,5 ml di PBS. Ripetere questo lavaggioaltre 2 volte.
4. Perline risospendere Jagged1 in 130 microlitri terreno di coltura / cm ² e si applicano alle cellule in coltura.
5. Incubare le cellule con perline a 37 ° C e 5% CO ₂ per il periodo desiderato. Rimuovere perline con diversi lavaggi di PBS o terreno di coltura.
6. Verifica attivazione segnalazione Notch mediante misurazione del bersaglio Notch trascritti genici ^10.

Risultati

Lo scopo di questo metodo è quello della cultura e stimolare segnale di Notch in precursori degli osteoclasti. Se correttamente colto, precursori degli osteoclasti presentano una morfologia a forma di fuso principalmente allungata con citoplasma liscia (Figura 1A). Si deve prestare attenzione per evitare l'attivazione immunologica dei precursori degli osteoclasti. Dopo l'attivazione, precursori diffondono e diventano appiattito con schiuma citoplasma (Fi...

Discussione

Passaggi critici all'interno del protocollo

Cultura e nella differenziazione in vitro dei precursori degli osteoclasti fornisce una piattaforma utile per l'indagine dei meccanismi molecolari di osteoclastogenesi e l'identificazione di bersagli terapeutici per la rigenerazione ossea e la conservazione della massa ossea. Quando la coltura precursori degli osteoclasti del mouse, l'elemento più critico è la manutenzione dei precursori in uno stato ingenuo. Come m...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Recombinant mouse M-CSF	Biolegend	576402	Available from multiple suppliers, test activity before experiments
Recombinant mouse RANKL	Shenandoah Biotechnology	200-04	Available from multiple suppliers, test activity before experiments
Recombinant human Jagged1-Fc	R&D Systems	1277-JG-050	Available from multiple suppliers, test activity before experiments
Protein G agarose beads	InvivoGen	gel-agg-2
Goat anti-human IgG Fc	Jackson ImmunoResearch	109-001-008
Minimum Essential Medium powder	Sigma-Aldrich	M0894
Accutase cell dissociation reagent	ThermoFisher	A1110501	Used to lift osteoclast precursors
Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit	Sigma-Aldrich	387A-1KT	Used to stain differentiated osteoclasts