在鼠标破骨细胞前体Notch信号的刺激

摘要

Notch signaling is a form of cellular communication that relies upon direct contact between cells. To properly induce Notch signaling in vitro, Notch ligands must be presented to cells in an immobilized state. This protocol describes methods for in vitro stimulation of Notch signaling in mouse osteoclast precursors.

摘要

Notch signaling is a key component of multiple physiological and pathological processes. The nature of Notch signaling, however, makes in vitro investigation of its varying and sometimes contradictory roles a challenge. As a component of direct cell-cell communication with both receptors and ligands bound to the plasma membrane, Notch signaling cannot be activated in vitro by simple addition of ligands to culture media, as is possible with many other signaling pathways. Instead, Notch ligands must be presented to cells in an immobilized state.

Variations in methods of Notch signaling activation can lead to different outcomes in cultured cells. In osteoclast precursors, in particular, differences in methods of Notch stimulation and osteoclast precursor culture and differentiation have led to disagreement over whether Notch signaling is a positive or negative regulator of osteoclast differentiation. While closer comparisons of osteoclast differentiation under different Notch stimulation conditions in vitro and genetic models have largely resolved the controversy regarding Notch signaling and osteoclasts, standardized methods of continuous and temporary stimulation of Notch signaling in cultured cells could prevent such discrepancies in the future.

This protocol describes two methods for stimulating Notch signaling specifically in cultured mouse osteoclast precursors, though these methods should be applicable to any adherent cell type with minor adjustments. The first method produces continuous stimulation of Notch signaling and involves immobilizing Notch ligand to a tissue culture surface prior to the seeding of cells. The second, which uses Notch ligand bound to agarose beads allows for temporary stimulation of Notch signaling in cells that are already adhered to a culture surface. This protocol also includes methods for detecting Notch activation in osteoclast precursors as well as representative transcriptional markers of Notch signaling activation.

引言

哺乳动物Notch信号传导途径是同源的果蝇的相同的途径和由四个跨膜Notch受体（Notch1-4）和铁血（JAG1＆JAG2）和Delta样（DLL1，3-五膜结合配体，及4）家庭^1。当在接收单元Notch受体被配体结合在一传送单元² Notch信号被启动。在此反式激活，膜结合Notch配体上产生的膜结合Notch受体^3,4的拉伸力。配体结合的拉伸力诱导的Notch受体由肿瘤坏死因子α促进受体的胞外切割位转换酶（TACE），随后通过含早老-γ分泌复合物（γ分泌）介导的细胞内切割事件的构象变化。 γ分泌释放缺口INTracellular域（NICD），该易位进入它形成具有CBF -1-苏（H）-Lag-1（CSL），主脑样（MAML）一个转录激活复合物的核和细胞类型特异性的因素来驱动表达的靶基因^5。

的Notch信号传导的激活结果中，需要在体外 Notch途径激活的独特方法的机械元件。可溶性Notch配体可以结合Notch受体，但不能产生拉伸所需NICD释放力，而在同一时间竞争性地抑制细胞相关的Notch配体的结合。因此，除了可溶性Notch配体到培养基可以减轻正常Notch信号^6,7。幸运的是，Notch配体可诱导NICD释放，如果他们被固定到合适的刚性基板^{5，8，9，10。}上涂覆的配体培养基材播种细胞或施加涂覆配体珠的细胞可以既激活Notch信号，以及它们之间的选择主要取决于缺口刺激期望的定时。立即，临时Notch信号传导的激活，如将一个功能或分化测定的中点期间需要，Notch配体可以结合到琼脂糖珠，施加到培养的细胞，并在任何时间洗掉。为从培养期开始时更持续的Notch信号，组织培养板可涂之前细胞接种配体。

对于此协议的目的，方法被进行了使用小鼠的破骨细胞的前体，但在这里所描述的方法的方法和变体适用于各种各样的细胞类型^{6，11，12，13， 14。}破骨细胞是终末分化的造血行数的细胞，它们负责骨组织的再吸收，并且它们在骨损失¹⁵的多个障碍有关。因此， 在他们的单核/巨噬细胞系细胞前体破骨细胞和分子机制控制它们的功能是为了更好地理解破骨细胞和新骨再生疗法的发展至关重要分化的体外研究。而它现在普遍接受的是Notch信号起着破骨细胞的分化和功能的积极作用，在这两种Notch信号传导的刺激和破骨细胞的前体培养和分化的变化导致最初矛盾的发现^{16，17，18，19。}在方法的差异进一步检查和利用遗传模型已经大大澄清Notch信号在破骨细胞的作用，但标准化的缺口刺激和培养方法的应用程序可以防止这类争议在其他类型的细胞^{20，21，22，23} Notch信号的未来研究。

有用于培养和分化小鼠破骨细胞前体的多种方法，并且，与用于刺激Notch信号改变方法，最好的方法将取决于实验问题。这里，我们的优选培养来自小鼠长骨冲洗骨髓细胞的粘附和非粘附的级分的方法将提交。这种方法有本质上不需要专门的设备并生产了适用于各种分化方法的细胞的优点。

研究方案

按照由宾夕法尼亚机构动物护理和使用委员会大学（IACUC）批准的方案进行所有涉及脊椎动物的研究。

1.文化传媒准备

1. 由最低必需培养基（MEM）粉末和1.9克次硫酸钠碳酸氢钠溶解在900ml _的 H _2ö制备的α-MEM和补充有2mM L-谷氨酰胺，100单位/ ml青霉素，100微克/毫升链霉素和100毫升热灭活的胎牛血清。消毒使用0.22微米的聚醚砜（PES）过滤器。
2. 通过用35纳克补充的α-MEM制备巨噬细胞培养基/ ml重组小鼠巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）
3. 通过用100ng / ml的RANKL补充巨噬细胞培养基制备破骨细胞培养基

2.骨髓细胞分离

1. 填充1个10毫升注射器用每只小鼠一个25⅝号针用10毫升的α-MEM。
2. 以1.3升/分钟的流速安乐死经由10分钟暴露于CO ₂小鼠。通过解剖继续之前以下_的 CO ₂曝光颈椎脱位确保动物死亡。
3. 使用清洁技术，解剖并分离胫骨和股骨。一种制造切口沿着每一后肢的前表面，以暴露胫骨和股骨前消毒用70％乙醇的小鼠皮肤。
   1. 通过膝关节切割以释放股骨的远端，并且通过股骨尽可能靠近骨盆尽可能削减。取出股骨和清理尽可能多的软组织成为可能。要取出胫骨，通过脚踝削减和删除尽可能多的软组织成为可能。
4. 握住镊子和冲洗骨髓骨成用2.5ml室温α-MEM从一个单一的鼠标结合骨髓冲成单管15毫升锥形管。
   注:一个成功的骨髓冲洗会改变T的着色他从红骨米色。
5. 允许碎屑沉降到试管底部并转移上清至干净的15毫升锥形管中，并注意避免传输任何碎屑。
   注:某些细胞也可以解决与骨髓杂物。如果需要的细胞的更大数目，骨髓刷新可以通过一个70微米的细胞滤网过滤到干净的15ml试管中。
6. 离心管（多个）在300×g离心5分钟，在室温下沉淀细胞。
7. 真空吸出上清液和重悬细胞沉淀在0.5ml氯化铵-钾（ACK）裂解缓冲液，并在37°C孵育3分钟以溶解红细胞。
8. 直接加入10毫升的PBS至ACK细胞溶液和离心机在300×g离心5分钟。
   注意:先前的红色细胞团，现在应该是米色。
9. 真空吸上清，重新悬浮颗粒在10毫升α-MEM，和板100毫米的组织培养处理的菜。孵育细胞过夜，在37℃在加湿的组织培养的孵化器。
   注:计数细胞是没有必要的这一步。在此期间，从骨髓的贴壁细胞将附着在培养表面上;非粘附骨髓细胞群将保持在悬浮液中。 MCSF此初始孵育期间不存在于培养基中。

3.破骨细胞前体富集

1. 后骨髓潮红，包含非粘附细胞到50ml锥形管转移培养物上清液温育过夜。
   注:培养皿以贴壁细胞，其包括骨髓间充质祖细胞，可以被丢弃或用新鲜α-MEM供给，如果需要，对于其它实验。
   注:破骨细胞可以直接从这些非粘附骨髓细胞通过每隔一天中的破骨细胞培养基和清凉介质电镀它们到组织培养处理过的菜以4×10 ^5个细胞/ cm ²的密度5天分化。
2. 的α-MEM，以非贴壁细胞溶液添加到18 ml的终体积，并添加M-CSF为35纳克/毫升的最终浓度。
3. 加入3 ml的每种细胞悬浮液至6 60毫米的悬浮液培养皿。
4. 在湿润的组织培养箱在37℃下孵育板过夜。在这段时间中，M-CSF将刺激巨噬细胞，其可以附着甚至非组织培养处理过的表面的分化。
5. 温育过夜用3ml新鲜巨噬细胞培养基，重新进料的破骨细胞的前体之后。这将删除而没有分化成巨噬细胞非贴壁细胞。
6. 继续培养破骨细胞前体在37℃和5％CO ₂的2天或直到培养物达到大约70％汇合。

4.破骨细胞分化

1. 在室温下洗破骨细胞的前体用5毫升的PBS和治疗的细胞用1毫升海洋起源的蛋白水解/胶原溶解酶，直到CELLS可以通过板轻轻拍打被抛下。
   注意:如果他们是悬浮培养的菜破骨细胞前体只能解除;前体连接得太紧，以组织培养处理的表面得以解除。胰蛋白酶可激活破骨细胞的前体，应该避免。
2. 4毫升的α-MEM，以每个培养皿转移细胞加至50ml锥形管中。算使用血球细胞和细胞稀释至5×10 ^4个细胞/毫升的密度，并添加M-CSF为35纳克/毫升和RANKL的终浓度为100毫微克/毫升的最终浓度。
3. 种子细胞的密度2.6×10 ^4个细胞/ cm ²的成组织培养处理板孵育在37℃下在湿润的组织培养箱中2天。分化典型地在24孔板，其中5×10 ^4个细胞接种到每个孔中进行。
4. 分化，再进给细胞通过用1ml新鲜osteoc更换培养基开始后第2天去年网上平台。
   注:破骨细胞分化通常会在3天内完成。导致破骨细胞可以TRAP染色，便于量化和形态分析。

5. Notch信号的连续刺激与Jagged1的涂覆表面

1. 暂停在PBS山羊抗人IgG Fc抗体，以10微克/ ml的浓度（1:1000稀释度的10mg / ml的股票）。以1.3微克/ cm ²的密度加上抗体溶液对培养表面，在室温下孵育1小时。在24孔板的情况下，每孔加入250微升（2.5微克）。
2. 真空抽吸孔和填充用1毫升PBS中。重复此步骤2次。
3. 暂停在PBS重组Jagged1的-Fc融合蛋白以10微克/ ml的浓度。添加Jagged1的-FC溶液到抗体包被的培养表面以1.3微克/ cm ²的密度，并在室温下孵育2小时。涂有抗体外核层培养表面y可以有用作对照。
4. 真空抽吸孔和填充用1毫升PBS中。重复此步骤2次。请PBS井直到刚好在细胞接种，以防止它们干燥。
5. 种子2.6×10 ⁴的破骨细胞的前体/厘米²到涂覆的表面。 Notch信号将被不断刺激至少3天。

6. Notch信号的刺激临时用Jagged1处理涂层珠

1. 结合以下在一个适当大小的管:0.5微克/厘米² Jagged1的-Fc的，21微升/ cm ²的G蛋白琼脂糖珠，和PBS中至1.5 ml的终体积。以制备的Jagged1的珠粒足够数量为1以及一个24孔板的，结合1微克Jagged1的-Fc的，40微升G蛋白琼脂糖珠，和PBS 1.5毫升
2. 在4旋转管孵育 °下2小时。
3. 在300×g离心1分钟，以沉淀珠离心管中。悬浮珠粒在1.5ml PBS中。重复此洗2次以上。
4. 悬浮珠Jagged1的130微升/厘米²培养基，并适用于培养细胞。
5. 孵育小珠的细胞在37℃和5％所需的时间_的 CO _2。用PBS或培养基的几次洗涤除去珠子。
6. 通过Notch靶基因转录¹⁰的测量来验证Notch信号激活。

结果

该方法的目的是培养和刺激Notch信号中的破骨细胞的前体。当适当培养，破骨细胞的前体显示出具有光滑细胞质（ 图1A）一个主要的细长纺锤形的形态。应当小心，以避免破骨细胞前体的免疫激活。在激活时，前体扩散并成为泡沫状细胞质（ 图1B）平坦化。这些"煎鸡蛋"细胞对RANK信号耐不能有效地分化为成熟的破骨细胞。下正确培养和分化的条件?...

讨论

该协议中的关键步骤

文化与破骨细胞前体体外分化为破骨细胞和骨再生，骨量保存治疗靶点识别的分子机制研究一个有益的平台。当鼠标培养破骨细胞的前体，最关键的因素是一个天真的状态前体的维护。作为巨噬细胞样细胞，破骨细胞前体填装到细菌成分和促炎细胞因子响应。在激活时，破骨细胞前体将不再有效地分化成破骨细胞。前体活化的主要原因是炎性细...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Recombinant mouse M-CSF	Biolegend	576402	Available from multiple suppliers, test activity before experiments
Recombinant mouse RANKL	Shenandoah Biotechnology	200-04	Available from multiple suppliers, test activity before experiments
Recombinant human Jagged1-Fc	R&D Systems	1277-JG-050	Available from multiple suppliers, test activity before experiments
Protein G agarose beads	InvivoGen	gel-agg-2
Goat anti-human IgG Fc	Jackson ImmunoResearch	109-001-008
Minimum Essential Medium powder	Sigma-Aldrich	M0894
Accutase cell dissociation reagent	ThermoFisher	A1110501	Used to lift osteoclast precursors
Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit	Sigma-Aldrich	387A-1KT	Used to stain differentiated osteoclasts