Die Stimulation der Notch-Signalweg in Maus-Osteoklasten Precursors

Zusammenfassung

Notch signaling is a form of cellular communication that relies upon direct contact between cells. To properly induce Notch signaling in vitro, Notch ligands must be presented to cells in an immobilized state. This protocol describes methods for in vitro stimulation of Notch signaling in mouse osteoclast precursors.

Zusammenfassung

Notch signaling is a key component of multiple physiological and pathological processes. The nature of Notch signaling, however, makes in vitro investigation of its varying and sometimes contradictory roles a challenge. As a component of direct cell-cell communication with both receptors and ligands bound to the plasma membrane, Notch signaling cannot be activated in vitro by simple addition of ligands to culture media, as is possible with many other signaling pathways. Instead, Notch ligands must be presented to cells in an immobilized state.

Variations in methods of Notch signaling activation can lead to different outcomes in cultured cells. In osteoclast precursors, in particular, differences in methods of Notch stimulation and osteoclast precursor culture and differentiation have led to disagreement over whether Notch signaling is a positive or negative regulator of osteoclast differentiation. While closer comparisons of osteoclast differentiation under different Notch stimulation conditions in vitro and genetic models have largely resolved the controversy regarding Notch signaling and osteoclasts, standardized methods of continuous and temporary stimulation of Notch signaling in cultured cells could prevent such discrepancies in the future.

This protocol describes two methods for stimulating Notch signaling specifically in cultured mouse osteoclast precursors, though these methods should be applicable to any adherent cell type with minor adjustments. The first method produces continuous stimulation of Notch signaling and involves immobilizing Notch ligand to a tissue culture surface prior to the seeding of cells. The second, which uses Notch ligand bound to agarose beads allows for temporary stimulation of Notch signaling in cells that are already adhered to a culture surface. This protocol also includes methods for detecting Notch activation in osteoclast precursors as well as representative transcriptional markers of Notch signaling activation.

Einleitung

Die Säuger Notch - Signalwegs ist homolog zu den gleichen Stoffwechselweg in Drosophila melanogaster und besteht aus vier transmembranen Notch - Rezeptoren (Notch1-4) und fünf membrangebundenen Liganden der Jagged (JAG1 & JAG2) und Delta-like (DLL1, 3, & 4) Familien ^1. Notch - Signal wird eingeleitet , wenn Notch - Rezeptor auf einer Empfangszelle , die durch Liganden auf einer Sendezelle ² gebunden ist. Während dieser trans-Aktivierung, die membrangebundene erzeugt Notch - Liganden eine Streckkraft auf die Membran-gebundenen Notch - Rezeptor ^{3, 4.} Die Dehnkraft der Ligandenbindung induziert Konformationsänderungen in dem Notch-Rezeptor, der von TNFalpha umwandelndes Enzym (TACE) extrazelluläre Spaltung des Rezeptors erleichtern durch ein intrazelluläres Spaltungsereignis von einem Presenilin-enthaltenden gamma-Sekretase-Komplex (γ-Sekretase) vermittelt gefolgt. γ-Sekretase gibt den Notch intracellular Domain (NICD), die in den Zellkern transloziert, wo es eine Transkriptionsaktivierungskomplex bildet mit CBF-1-Su (H) -LAG-1 (CSL), Mastermind-like (MAML) und zelltypspezifische Faktoren die Expression anzutreiben von Zielgenen ^5.

Die mechanischen Elemente des Notch - Signalaktivierung Ergebnis in der Notwendigkeit für einzigartige Verfahren der Notch - Signalweg - Aktivierung in vitro. Soluble Notch-Liganden binden an Rezeptoren Notch, aber nicht Dehnungskräfte zu erzeugen, die notwendig für die Freigabe NICD während zugleich kompetitiv die Bindung von zellassoziierte Liganden Notch hemmen. Somit Zugabe von löslichem Notch - Liganden an Kulturmedium können normale Notch dämpfen ^{6 Signalgebung, 7.} Glücklicherweise Notch - Liganden können NICD Freisetzung induzieren , wenn sie ⁵ zu einem geeigneten starren Substrat befestigt ^{sind, 8, 9,10.} Aussäen Zellen auf Liganden-beschichteten Kultursubstrate oder Aufbringen Ligand-beschichteten Kügelchen an Zellen kann sowohl aktivieren Notch-Signalisierung, und die Wahl zwischen ihnen hängt in erster Linie von dem gewünschten Zeitpunkt der Notch-Stimulation. Für sofortige temporäre Notch-Signalaktivierung, wie während der Mittelpunkt einer funktionellen oder Differenzierungsassay, Notch-Liganden an Agarose beads können, zu kultivierten Zellen angewendet würde erwünscht sein, werden gebunden und gewaschen jederzeit aus. Für länger anhalt Notch-Signalisierung von Beginn einer Kulturperiode, Gewebekulturplatten können vor dem Aussähen der Zellen mit dem Liganden überzogen werden.

Für die Zwecke dieses Protokolls werden Verfahren durchgeführt Maus Osteoklastenvorläufer verwenden, aber die Verfahren und Variationen der hier beschriebenen Verfahren sind anwendbar auf eine große Vielzahl von Zelltypen ^{6, 11, 12, 13, 14.} Osteoklasten sind terminal differenzierten hämatopoetischen linage Zellen , die für die Resorption von Knochengewebe verantwortlich sind, und sie sind in mehreren Erkrankungen des Knochenschwundes ¹⁵ gebracht. Somit ist in vitro Untersuchung der Differenzierung von Osteoklasten aus ihren Monocyten / Makrophagen-Abstammungslinie Vorstufen und die molekularen Mechanismen , die Kontrolle ihrer Funktion zu einem besseren Verständnis der Osteoklasten und Entwicklung neuer Knochenregenerierungs Therapien wesentlich ist. Während es nun , dass Notch - Signalweg spielt eine positive Rolle bei der Differenzierung und Funktion von Osteoklasten, Variationen sowohl in der Notch - Signal Stimulation und Osteoklasten - Vorläuferkultur und Differenzierung allgemein akzeptiert wird geführt zunächst widersprüchlichen Ergebnisse ^{16, 17, 18, 19.} Näherer Betrachtung der Unterschiede in den Verfahren und der Verwendung von genetischenModelle haben stark die Rolle der Notch - Signalweg in osteoclastogenesis geklärt, aber Anwendung standardisierter Notch Stimulation und Kulturmethoden könnten solche Kontroversen in zukünftigen Studien der Notch - Signalweg in anderen Zelltypen ^{20, 21, 22, 23} zu verhindern.

Es gibt mehrere Methoden zum Züchten und Maus Osteoklastenvorläufer Differenzierung und, wie mit unterschiedlichen Methoden zur Stimulierung von Notch-Signalisierung, die beste Methode hängt von der Versuchs Frage abhängen. Hier unsere bevorzugte Methode zur Kultivierung von adhärenten und nicht adhärenten Fraktionen von Mark aus Maus langen Knochen gespült Zellen präsentiert werden. Dieses Verfahren hat den Vorteil, erfordern im wesentlichen keine Spezialausrüstung und Herstellung von Zellen, die zu einer Vielzahl von Differenzierungsmethoden anwendbar sind.

Protokoll

Alle Forschung Wirbeltiere wurde in Übereinstimmung mit Protokollen, die von der University of Pennsylvania Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) genehmigt durchgeführt.

1. Kultur Nährmedienzubereitung

1. Bereiten α-MEM mit Minimum Essential Medium (MEM) -Pulver und 1,9 g Natriumbicarbonat in 900 ml H ₂ O und ergänzt mit 2 mM L-Glutamin Auflösen, 100 Einheiten / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin und 100 ml hitze- inaktiviertes fötales Rinderserum. Sterilisieren einen 0,22 um Polyethersulfon (PES) Filter.
2. Bereiten Sie Makrophagen-Medium durch Ergänzung α-MEM mit 35 ng / ml rekombinantem Maus-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (M-CSF)
3. Bereiten Sie Osteoklasten Medium durch Ergänzung Makrophagen-Medium mit 100 ng / ml RANKL

2. Knochenmarkzellisolierung

1. Füllen Sie eine 10-ml-Spritze mit einer 25⅝-Gauge-Nadel pro Maus mit 10 ml α-MEM.
2. Euthanize Mäuse über 10 min Einwirkung von CO ₂ bei einer Flussrate von 1,3 L / min. Stellen Sie sicher , Tier Tod durch folgende CO ₂ Exposition mit Genickbruch vor mit Dissektion fortfahren.
3. Mit sauberer Technik, sezieren und trennen die Tibiae und femora. Desinfizieren der Haut von Mäusen mit 70% Ethanol , bevor ein Einschnitt entlang der anterioren Oberfläche jedes Hinterbein machen Tibia und Femur zu belichten.
   1. Schnitt durch das Kniegelenk, das distale Ende des Femurs freizugeben, und durch den Femur so nahe am Becken wie möglich schneiden. Entfernen Sie den Oberschenkelknochen und reinigen so viel Weichgewebe wie möglich. die Tibia, schneiden durch den Knöchel und entfernen Sie so viel Weichgewebe wie möglich zu entfernen.
4. Halten Sie die Knochen mit einer Pinzette und bündig Mark in einem 15 ml konischen Röhrchen mit 2,5 ml Raumtemperatur α-MEM Kombination Markwallungen aus einer einzigen Maus in einem einzigen Rohr.
   HINWEIS: Eine erfolgreiche Mark Flush wird die Färbung von t änderner Knochen von rot bis beige.
5. Lassen Sie Trümmer auf den Boden der Röhre und Überstand in ein sauberes 15 ml konischen Röhrchen kümmert absetzen zu vermeiden, alle Ablagerungen zu übertragen.
   HINWEIS: Einige Zellen können auch mit dem Mark Trümmer absetzen. Wenn eine größere Anzahl von Zellen erforderlich ist, marrow Wallungen kann durch einen 70 & mgr; m Zellsieb in ein sauberes 15-ml-Röhrchen gefiltert werden.
6. Zentrifugenröhrchen (s) bei 300 xg für 5 min bei Raumtemperatur Zellen zu pelletieren.
7. Vakuum ansaugen den Überstand und resuspendiere Zellpellet in 0,5 ml Ammonium-Chlorid-Kalium (ACK) Lysepuffer und Inkubation bei 37 ° C für 3 min roten Blutkörperchen zu lysieren.
8. 10 ml PBS, um direkt ACK-Zelllösung und Zentrifugation bei 300 × g für 5 min.
   HINWEIS: Die bisher roten Zellpellet sollte nun beige sein.
9. Vakuum absaugen Überstand und Pellet in 10 ml α-MEM, und die Platte in einer 100-mm-Gewebekultur-behandelte Schale. Inkubiere Zellen über Nacht bei 37 ° C in einem befeuchtetenGewebekultur-Inkubator.
   HINWEIS: Zählung der Zellen für diesen Schritt nicht erforderlich ist. Während dieser Zeit werden adhärente Zellen aus dem Knochenmark in die Kulturoberfläche befestigen; nicht-adhärenten Zellpopulationen Knochenmark wird in der Schwebe bleiben. MCSF ist in dem Kulturmedium während dieser anfänglichen Inkubation nicht vorhanden.

3. Anreicherung von Osteoklasten Precursors

1. Nach Inkubation über Nacht von marrow Wallungen, Transferkulturüberstand, die nicht-adhärenten Zellen in eine 50 ml konischen Röhrchen.
   HINWEIS: Die Kulturschalen mit anhaftenden Zellen, die Knochenmark mesenchymale Vorläuferzellen umfassen, können mit frischen α-MEM verworfen oder eingespeist werden, wenn für andere Experimente gewünscht.
   HINWEIS: Osteoklasten können sie in Gewebekultur-behandelten Schalen bei einer Dichte von 4 x 10 ⁵ Zellen / cm ² in Osteoklasten - Medium und erfrischende Medium jeden zweiten Tag für 5 Tage durch direkt aus diesen nicht-adhärenten Knochenmarkzellen differenziert werden Plattieren.
2. Fügen α-MEM nicht-adhärenten Zelllösung auf ein Endvolumen von 18 ml und füge M-CSF bis zu einer Endkonzentration von 35 ng / ml.
3. 3 ml Zellsuspension jeder bis 6 60 mm Federung Kulturschalen.
4. Inkubieren Platten über Nacht bei 37 ° C in einer angefeuchteten Gewebekultur-Inkubator. Während dieser Zeit wird M-CSF stimuliert die Differenzierung von Makrophagen, die auch auf nicht-Gewebekultur-behandelten Oberflächen anhaften kann.
5. Nach über Nacht wieder Futter Osteoklastenvorläufer mit 3 ml frischen Makrophagen-Medium inkubiert. Dies entfernt nicht-adhärente Zellen, die nicht zu Makrophagen differenziert haben.
6. Weiter zur Kultur Osteoklastenvorläufer bei 37 ° C und 5% CO ₂ für 2 Tage oder bis Kulturen erreichen rund 70% Konfluenz.

4. Differenzierung von Osteoklasten

1. Osteoklasten-Vorläufer mit 5 ml PBS waschen und behandeln Zellen mit 1 ml marinen Ursprungs proteolytischen / kollagenolytischer Enzym bei Raumtemperatur bis zum cells kann durch leichtes Klopfen der Platte abgelöst werden.
   HINWEIS: Osteoklasten-Vorläufer kann nur aufgehoben werden, wenn sie in der Schwebe Geschirr kultiviert werden; Vorläufern befestigen zu fest auf Gewebekultur-behandelten Oberflächen angehoben werden. Trypsin kann Osteoklastenvorläufer aktivieren und sollte vermieden werden.
2. 4 ml α-MEM zu jeder Schale und Transfer Zellen einem 50 ml konischen Röhrchen. Zählen von Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers und verdünnter Zellen zu einer Dichte von 5 x 10 ⁴ Zellen / ml und füge M-CSF bis zu einer Endkonzentration von 35 ng / ml und RANKL zu einer Endkonzentration von 100 ng / ml.
3. Samenzellen in einer Dichte von 2,6 x 10 ⁴ Zellen / cm ² in Gewebekultur-behandelten Platten und Inkubieren bei 37 ° C in einer angefeuchteten Gewebekultur - Inkubator für 2 Tage. Differentiation wird typischerweise in 24-Well - Platten durchgeführt, wobei 5 x 10 ⁴ Zellen pro Vertiefung ausgesät.
4. 2 Tage nach dem Beginn der Differenzierung, Wiederfutterzellen durch Medium mit 1 ml frischem osteoc ersetzenletzte Medium.
   HINWEIS: die Differenzierung von Osteoklasten wird in der Regel innerhalb von 3 Tagen abgeschlossen sein. Resultierende Osteoklasten können TRAP-gefärbt für die einfache Quantifizierung und morphologische Analyse sein.

5. Kontinuierliche Stimulation der Notch-Signalweg mit Jagged1 beschichteten Oberfläche

1. Suspend-Ziege-Anti-Human-IgG Fc-Antikörper in PBS bei einer Konzentration von 10 ug / ml (1: 1000-Verdünnung von 10 mg / ml stock). Hinzufügen Antikörperlösung zu Kulturoberfläche mit einer Dichte von 1,3 & mgr; g / cm ² und Inkubation für 1 h bei Raumtemperatur. Im Fall von 24-Well-Platten, fügen 250 ul (2,5 ug) pro Vertiefung.
2. Vakuum absaugen Brunnen und füllen mit 1 ml PBS. Wiederholen Sie diesen Schritt 2 mal.
3. Suspend rekombinantes Jagged1-Fc-Fusionsprotein in PBS bei einer Konzentration von 10 ug / ml. Hinzufügen Jagged1-FC - Lösung auf den Antikörper-beschichteten Kulturoberfläche mit einer Dichte von 1,3 & mgr; g / cm ² und Inkubation für 2 h bei Raumtemperatur. Kulturflächen mit einem Antikörper beschichtet only können als Kontrollen verwendet werden.
4. Vakuum absaugen Brunnen und füllen mit 1 ml PBS. Wiederholen Sie diesen Schritt 2 mal. Halten PBS in Vertiefungen bis unmittelbar vor der Aussaat zu Zelle sie vor dem Austrocknen zu verhindern.
5. Seed 2,6 x 10 ⁴ Osteoklastenvorläufer / cm ² auf beschichteten Oberflächen. Notch-Signalweg wird kontinuierlich für mindestens 3 Tage stimuliert.

6. Temporäre Stimulation der Notch-Signalweg mit Jagged1 beschichteten Beads

1. Kombinieren der folgenden in einem entsprechend dimensionierten Schlauch: 0,5 & mgr; g / cm ² Jagged1-Fc, 21 & mgr; l / cm ² Protein G - Agarose - Perlen, und PBS auf ein Endvolumen von 1,5 ml. eine ausreichende Anzahl von Jagged1 Perlen für 1 Well einer 24-Well-Platte, kombinieren 1 ug Jagged1-Fc, 40 ul Protein G Agarose-Kügelchen, und PBS auf 1,5 ml zu bereiten.
2. Inkubieren Rohr mit Rotation bei 4 ° C für 2 Stunden.
3. Zentrifugenröhrchen bei 300 g für 1 min bis Pellet-Perlen. Resuspendieren Perlen in 1,5 ml PBS. Wiederholen Sie diesen Wasch2 weitere Male.
4. Resuspendieren Jagged1 Perlen in 130 & mgr; l / cm ² Kulturmedium und gelten für kultivierten Zellen.
5. Inkubieren Zellen mit Perlen bei 37 ° C und 5% CO ₂ für die gewünschte Zeit. Entfernen Perlen mit mehreren Wäschen von PBS oder Kulturmedium.
6. Stellen Sie sicher , Notch - Signalaktivierung über die Messung von Notch Zielgen Transkripte ^10.

Ergebnisse

Das Ziel dieser Methode ist es, Kultur und Notch-Signalweg in Osteoklasten-Vorläufer zu stimulieren. Wenn sie richtig kultiviert weisen Osteoklastenvorläufer eine hauptsächlich längliche spindelförmige Morphologie mit glatten Zytoplasma (1A). Sorgfalt sollte immunologische Aktivierung der Osteoklastenvorläufer zu vermeiden. Nach der Aktivierung aus und werden dabei Vorstufen mit schaumigen Zytoplasma abgeflacht (1B). Diese "Spiegelei" Zel...

Diskussion

Kritische Schritte innerhalb des Protokolls

Kultur und in vitro Differenzierung von Osteoklasten - Vorläufer liefert eine nützliche Plattform für die Untersuchung von molekularen Mechanismen der osteoclastogenesis und Identifizierung von therapeutischen Ziele für die Knochenregeneration und die Erhaltung der Knochenmasse. Wenn Maus Osteoklastenvorläufer Kultivierung ist das wichtigste Element Wartung von Vorläufern in einem naiven Zustand. Als Makrophagen-ähnliche Zellen werden ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Recombinant mouse M-CSF	Biolegend	576402	Available from multiple suppliers, test activity before experiments
Recombinant mouse RANKL	Shenandoah Biotechnology	200-04	Available from multiple suppliers, test activity before experiments
Recombinant human Jagged1-Fc	R&D Systems	1277-JG-050	Available from multiple suppliers, test activity before experiments
Protein G agarose beads	InvivoGen	gel-agg-2
Goat anti-human IgG Fc	Jackson ImmunoResearch	109-001-008
Minimum Essential Medium powder	Sigma-Aldrich	M0894
Accutase cell dissociation reagent	ThermoFisher	A1110501	Used to lift osteoclast precursors
Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit	Sigma-Aldrich	387A-1KT	Used to stain differentiated osteoclasts