La estimulación de la señalización de Notch en el ratón osteoclastos precursores

Resumen

Notch signaling is a form of cellular communication that relies upon direct contact between cells. To properly induce Notch signaling in vitro, Notch ligands must be presented to cells in an immobilized state. This protocol describes methods for in vitro stimulation of Notch signaling in mouse osteoclast precursors.

Resumen

Notch signaling is a key component of multiple physiological and pathological processes. The nature of Notch signaling, however, makes in vitro investigation of its varying and sometimes contradictory roles a challenge. As a component of direct cell-cell communication with both receptors and ligands bound to the plasma membrane, Notch signaling cannot be activated in vitro by simple addition of ligands to culture media, as is possible with many other signaling pathways. Instead, Notch ligands must be presented to cells in an immobilized state.

Variations in methods of Notch signaling activation can lead to different outcomes in cultured cells. In osteoclast precursors, in particular, differences in methods of Notch stimulation and osteoclast precursor culture and differentiation have led to disagreement over whether Notch signaling is a positive or negative regulator of osteoclast differentiation. While closer comparisons of osteoclast differentiation under different Notch stimulation conditions in vitro and genetic models have largely resolved the controversy regarding Notch signaling and osteoclasts, standardized methods of continuous and temporary stimulation of Notch signaling in cultured cells could prevent such discrepancies in the future.

This protocol describes two methods for stimulating Notch signaling specifically in cultured mouse osteoclast precursors, though these methods should be applicable to any adherent cell type with minor adjustments. The first method produces continuous stimulation of Notch signaling and involves immobilizing Notch ligand to a tissue culture surface prior to the seeding of cells. The second, which uses Notch ligand bound to agarose beads allows for temporary stimulation of Notch signaling in cells that are already adhered to a culture surface. This protocol also includes methods for detecting Notch activation in osteoclast precursors as well as representative transcriptional markers of Notch signaling activation.

Introducción

La vía de señalización Notch de mamífero es homóloga a la misma vía en Drosophila melanogaster y consta de cuatro receptores transmembrana muesca (Notch1-4) y cinco ligandos unidos a la membrana del Jagged (JAG1 y JAG2) y Delta-como (DLL1, 3, y 4) las familias ^1. La señalización de Notch se inicia cuando el receptor Notch en una célula receptora está obligado por ligando en una célula de transmisión ^2. Durante este trans-activación, el ligando Notch unida a la membrana produce una fuerza de estiramiento sobre el receptor Notch unida a la membrana ^{3, 4.} La fuerza de estiramiento de ligando de unión induce cambios conformacionales en el receptor Notch que facilitan la escisión extracelular del receptor de TNF por la enzima de conversión (TACE), seguido de un evento de escisión intracelular mediada por una gamma-secretasa complejo (γ-secretasa) que contiene la presenilina. comunicados de γ-secretasa la int Notchdominio racellular (NICD), que se transloca al núcleo donde se forma un complejo de activación de la transcripción con CBF-1-Su (H) -Lag-1 (CSL), mastermind-como (MAML), y los factores específicos del tipo de células para dirigir la expresión de los genes objetivo ^5.

Los elementos mecánicos del resultado de la activación de la señalización de Notch en la necesidad de métodos únicos de activación de la vía de Notch in vitro. ligandos Notch solubles pueden unirse a Notch receptores, pero no producir fuerzas de estiramiento necesarias para la liberación NICD mientras que al mismo tiempo competitivamente inhibir la unión de ligandos de Notch asociados a células. Por lo tanto, la adición de ligandos de Notch solubles al medio de cultivo puede atenuar normal de señalización ^{6, 7} Notch. Afortunadamente, los ligandos de Notch pueden inducir la liberación de NICD si se fijan a un sustrato rígido apropiado ^{5, 8, 9,10.} La siembra de células sobre sustratos de cultivo ligando recubiertos o la aplicación de perlas de ligando recubierto a las células puede tanto activar la señalización de Notch, y la elección entre ellos depende principalmente de la temporización deseada de estimulación Notch. Para la activación de señalización Notch inmediata y temporal, como sería deseado durante el punto medio de un ensayo funcional o la diferenciación, el ligando de Notch se puede unir a perlas de agarosa, aplicados a las células cultivadas, y se lavó a cabo en cualquier momento. Para obtener más señalización Notch sostenido desde el comienzo de un periodo de cultivo, placas de cultivo de tejido se pueden recubrir con el ligando antes de la siembra de células.

Para los fines de este protocolo, los métodos se llevan a cabo utilizando precursores de osteoclastos de ratón, pero los métodos y variaciones de los métodos descritos aquí son aplicables a una amplia variedad de tipos de células ^{6, 11, 12, 13, 14.} Los osteoclastos son células terminalmente diferenciadas linage hematopoyéticas que son responsables de la resorción del tejido óseo, y que están implicadas en varios trastornos de pérdida ósea ^15. Por lo tanto, en el estudio in vitro de la diferenciación de los osteoclastos a partir de sus precursores de monocitos / macrófagos linaje y los mecanismos moleculares que controlan su función es esencial para la mejor comprensión de los osteoclastos y desarrollo de nuevas terapias de regeneración de hueso. A pesar de que ahora se acepta generalmente que la señalización Notch desempeña un papel positivo en la diferenciación y función de los osteoclastos, las variaciones en la estimulación tanto de señalización Notch y la cultura de los osteoclastos precursores y la diferenciación condujeron a resultados contradictorios inicialmente ^{16, 17, 18, 19.} Un examen más detallado de las diferencias en los métodos y el uso de los recursos genéticosmodelos han aclarado en gran medida el papel de la señalización Notch en la osteoclastogénesis, pero la aplicación de métodos de estimulación y cultura Notch estandarizados podrían prevenir este tipo de controversias en futuros estudios de señalización Notch en otros tipos de células ^{20, 21, 22, 23.}

Existen múltiples métodos para el cultivo y la diferenciación de precursores de osteoclastos de ratón, y, como con diferentes métodos para estimular la señalización de Notch, el mejor método dependerá de la pregunta experimental. En este documento, se presentará nuestro método preferido de cultivo fracciones adherentes y no adherentes de células de la médula ELIMINADOS de los huesos largos del ratón. Este método tiene la ventaja de requerir esencialmente ningún equipo especializado y la producción de células que son aplicables a una variedad de métodos de diferenciación.

Protocolo

Toda la investigación con animales vertebrados que se llevó a cabo de acuerdo con los protocolos aprobados por la Universidad de Pennsylvania Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión (IACUC).

1. Medios de cultivo Preparación

1. Preparar α-MEM disolviendo medio polvo mínimo esencial (MEM) y 1,9 g de bicarbonato de sodio en 900 ml de _H2O y complementar con 2 mM L-glutamina, 100 unidades / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina y 100 ml calor suero bovino fetal inactivado. Esterilizar el uso de un filtro de 0,22 micras polietersulfona (PES).
2. Preparar macrófagos medio completándolo α-MEM con 35 ng / ml recombinante de ratón macrófagos factor estimulante de colonias (M-CSF)
3. Para preparar el medio de los osteoclastos, completándolo macrófagos medio con 100 RANKL ng / ml

El aislamiento de la célula 2. médula ósea

1. Llene una jeringa de 10 ml con una aguja de calibre 25⅝ por ratón con 10 ml de α-MEM.
2. La eutanasia a los ratones a través de la exposición 10 min a CO ₂ a un caudal de 1,3 L / min. Asegurar la muerte de los animales, siguiendo la exposición de CO ₂ con dislocación cervical antes de proceder a la disección.
3. Utilizando una técnica limpia, diseccionar y separar las tibias y fémures. Desinfectar la piel del ratón con 70% de etanol antes de hacer una incisión a lo largo de la superficie anterior de cada miembro posterior para exponer la tibia y el fémur.
   1. Cortar a través de la articulación de la rodilla para liberar el extremo distal del fémur, y cortar a través del fémur como cerca de la pelvis como sea posible. Retire el fémur y limpiar tanto los tejidos blandos como sea posible. Para eliminar la tibia, cortar a través del tobillo y eliminar la mayor cantidad de tejido blando como sea posible.
4. Sostener el hueso con fórceps y ósea ras en un tubo cónico de 15 ml con 2,5 ml a temperatura ambiente α-MEM que combina rubores ósea de un solo ratón en un solo tubo.
   NOTA: A ras ósea exitosa va a cambiar la coloración de tque los huesos del rojo al beige.
5. Permitir que los desechos que se depositan en el fondo del tubo y transferir el sobrenadante a un limpios de 15 ml tubo cónico teniendo cuidado de evitar la transferencia de los residuos.
   NOTA: Algunas células también pueden conformarse con los restos ósea. Si se requiere un mayor número de células, sofocos ósea pueden ser filtradas a través de un filtro de células de 70 m en un tubo limpio 15 ml.
6. tubo (s) centrifugar a 300 xg durante 5 min a temperatura ambiente para sedimentar las células.
7. Vacuum aspirar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular en 0,5 ml de amonio-cloruro y potasio (ACK) de tampón de lisis y se incuba a 37 ° C durante 3 min para lisar las células rojas de la sangre.
8. Añadir 10 ml de PBS directamente a ACK de células solución, y se centrifuga a 300 xg durante 5 min.
   NOTA: El sedimento de células previamente roja debería ser ahora de color beige.
9. De vacío se aspira el sobrenadante y el sedimento se vuelve a suspender en 10 ml de α-MEM, y la placa en una placa de cultivo de tejidos tratados con 100 mm. Se incuban las células durante la noche a 37 ° C en una atmósfera humidificadaincubadora de cultivo de tejidos.
   NOTA: el recuento de células no es necesario para este paso. Durante este tiempo, las células adherentes de la médula ósea se adherirán a la superficie de cultivo; poblaciones de células de médula ósea no adherentes permanecerán en suspensión. MCSF no está presente en el medio de cultivo durante esta incubación inicial.

3. Enriquecimiento de osteoclastos precursores

1. Después de la incubación durante la noche de las oleadas de la médula, la transferencia de sobrenadante de cultivo que contiene las células no adherentes a A 50 ml de tubo cónico.
   NOTA: Las placas de cultivo con células adherentes, que incluyen las células mesenquimales de médula ósea progenitoras, puede ser desechada o alimentado con α-MEM fresco, si se desea, para otros experimentos.
   NOTA: Los osteoclastos se pueden diferenciar directamente de estas células de médula ósea no adherentes en placas de ellas en placas de cultivo de tejidos tratados a una densidad de 4 x 10 ⁵ células / ^cm2 en medio de los osteoclastos y medio refrescante cada otro día durante 5 días.
2. Añadir α-MEM a la solución de células no adherente a un volumen final de 18 ml y añadir M-CSF a una concentración final de 35 ng / ml.
3. Añadir 3 ml de suspensión de células cada uno para 6 placas de cultivo de suspensión de 60 mm.
4. Incubar las placas durante la noche a 37 ° C en una incubadora de cultivo de tejidos humidificado. Durante este tiempo, M-CSF estimula la diferenciación de los macrófagos, que pueden adherirse incluso a las superficies tratadas con cultivo no tejido.
5. Después de incubar durante la noche, re-alimentación de los precursores de osteoclastos con 3 ml de medio fresco macrófagos. Esto eliminará las células no adherentes que no se han diferenciado en macrófagos.
6. Seguir los precursores de osteoclastos de cultivo a 37 ° C y 5% de _CO2 durante 2 días o hasta que los cultivos alcanzan aproximadamente el 70% de confluencia.

La diferenciación de los osteoclastos 4.

1. Lavar los precursores de osteoclastos con 5 ml de PBS y el tratamiento de las células con 1 ml de origen marino-proteolítica / enzima colagenolıtica a temperatura ambiente hasta que el cells pueden desprenderse con unos golpecitos suaves de la placa.
   NOTA: los osteoclastos precursores sólo pueden ser levantadas si se cultivan en placas de suspensión; precursores se unen también firmemente a las superficies tratadas con cultivo de tejido a elevar. Tripsina puede activar los precursores de osteoclastos y debe ser evitado.
2. Añadir 4 ml de α-MEM a cada plato células y transferir a un tubo cónico de 50 ml. Recuento de células utilizando un hemocitómetro y diluir las células a una densidad de 5 x 10 ⁴ células / ml y añadir M-CSF a una concentración final de 35 ng / ml y RANKL a una concentración final de 100 ng / ml.
3. Se siembran las células a una densidad de 2,6 x 10 ⁴ células / cm ² en placas de cultivo de tejidos tratados y se incuba a 37 ° C en una incubadora de cultivo de tejidos humidificado durante 2 días. La diferenciación se lleva a cabo típicamente en placas de 24 pocillos, en los que 5 x 10 ⁴ células se sembraron en cada pocillo.
4. 2 días después del inicio de las células diferenciación, re-alimentación mediante la sustitución de medio con 1 ml osteoc frescoeste último medio.
   NOTA: diferenciación de los osteoclastos por lo general será completa dentro de 3 días. osteoclastos resultantes pueden ser TRAP-manchado para facilitar la cuantificación y el análisis morfológico.

5. La estimulación continua de señalización Notch con la superficie recubierta con Jagged1

1. Suspender anticuerpo de cabra anti-humano IgG Fc en PBS a una concentración de 10 mg / ml (1: 1000 dilución de 10 mg / ml de stock). Añadir la solución de anticuerpo a la superficie de cultivo a una densidad de 1,3 g / cm ² y se incuba a temperatura ambiente durante 1 hr. En el caso de placas de 24 pocillos, añadir 250 l (2,5 g) por pocillo.
2. pozos de aspirado al vacío y volver a llenar con 1 ml de PBS. Repita este paso 2 veces.
3. Suspender proteína recombinante de fusión Jagged1-Fc en PBS a una concentración de 10 mg / ml. Añadir solución Jagged1-FC a la superficie de cultivo anticuerpo recubierto a una densidad de 1,3 g / cm ² y se incuba a temperatura ambiente durante 2 hr. superficies de cultivo recubiertas con anticuerpo ONLy se pueden usar como controles.
4. pozos de aspirado al vacío y volver a llenar con 1 ml de PBS. Repita este paso 2 veces. Mantenga PBS en los pocillos hasta justo antes de la siembra de células para evitar que se sequen.
5. Seed 2,6 x 10 ⁴ osteoclastos precursores / cm ² en las superficies recubiertas. la señalización de Notch se verá estimulada de forma continua durante al menos 3 días.

6. Estimulación temporal de señalización Notch con perlas revestidas de Jagged1

1. Combinar lo siguiente en un tubo de tamaño apropiado: 0,5 g / cm ² Jagged1-Fc, 21 l / cm perlas de proteína G agarosa ^2, y PBS a un volumen final de 1,5 ml. Para preparar un número adecuado de granos JAGGED1 para 1 pocillo de una placa de 24 pocillos, se combinan 1 g Jagged1-Fc, 40 proteína G l perlas de agarosa, y PBS hasta 1,5 ml.
2. Incubar tubo con rotación a 4 ° C durante 2 hr.
3. Tubo de centrífuga a 300 xg durante 1 min a perlas de pellets. Volver a suspender las perlas en 1,5 ml de PBS. Repita este lavado2 veces más.
4. Volver a suspender cuentas JAGGED1 en 130 l / ^cm2 medio de cultivo y se aplican a las células cultivadas.
5. Se incuban las células con perlas a 37 ° C y 5% de CO ₂ para el período deseado. Eliminar las perlas con varios lavados de PBS o medio de cultivo.
6. Verificar la activación de señalización Notch a través de la medición de la transcripción de genes diana de Notch ^10.

Resultados

El objetivo de este método es que la cultura y estimular la señalización Notch en los precursores de osteoclastos. Cuando está debidamente cultivadas, precursores de osteoclastos exhiben una morfología en forma de huso principalmente alargada con citoplasma lisa (Figura 1A). Se debe tener cuidado para evitar la activación inmunológica de los precursores de osteoclastos. Tras la activación, los precursores extienden y se aplanan con espumosa citoplasma (Fi...

Discusión

Los pasos críticos en el protocolo

Cultura y en la diferenciación in vitro de los precursores de osteoclastos proporciona una plataforma útil para la investigación de los mecanismos moleculares de la osteoclastogénesis y la identificación de dianas terapéuticas para la regeneración ósea y la conservación de la masa ósea. Cuando el cultivo de precursores de osteoclastos de ratón, el elemento más crítico es el mantenimiento de los precursores en un estado ingenuo. ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Recombinant mouse M-CSF	Biolegend	576402	Available from multiple suppliers, test activity before experiments
Recombinant mouse RANKL	Shenandoah Biotechnology	200-04	Available from multiple suppliers, test activity before experiments
Recombinant human Jagged1-Fc	R&D Systems	1277-JG-050	Available from multiple suppliers, test activity before experiments
Protein G agarose beads	InvivoGen	gel-agg-2
Goat anti-human IgG Fc	Jackson ImmunoResearch	109-001-008
Minimum Essential Medium powder	Sigma-Aldrich	M0894
Accutase cell dissociation reagent	ThermoFisher	A1110501	Used to lift osteoclast precursors
Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit	Sigma-Aldrich	387A-1KT	Used to stain differentiated osteoclasts