نظام الثقافة 3D على أساس إدراج تصفية السريع لالبروستاتا الابتدائية تمايز الخلايا

Summary

Here, we present a method for the establishment of a rapid in vitro system that supports the three dimensional culturing and subsequent luminal differentiation of primary prostate epithelial cells.

Abstract

الخلايا المعاد برمجتها مشروط (مراكز التأهيل المجتمعي) توفر طريقة مستدامة لزراعة الخلايا الأولية والقدرة على تطوير "المصارف البيولوجية الحية" واسعة من المريض المستمدة من خطوط الخلايا. لأنواع عديدة من الخلايا الظهارية، وقد وصفت مختلف المناهج ثلاثية الأبعاد، (3D) الثقافة التي تدعم تحسين حالة متباينة. بينما مراكز التأهيل المجتمعي تحتفظ التزام نسبهم إلى الأنسجة التي تكون معزولة، فإنها تفشل في التعبير عن العديد من علامات التمايز المرتبطة الأنسجة الأصلية عندما نمت في ظل شرطين الأبعاد (2D) ثقافة العادية. لتعزيز تطبيق مراكز التأهيل المجتمعي المستمدة من المريض لأبحاث السرطان البروستاتا، وقد تم تحديد شكل ثقافة 3D تمكن السريع (2 أسابيع الإجمالي) اللمعية تمايز الخلايا في كل من الخلايا الظهارية البروستاتا العادية والمشتقة من الورم. هنا، يتم وصف شكل على أساس إدراج مرشح للزراعة والتفريق بين كل من مراكز التأهيل المجتمعي البروستاتا الطبيعية والخبيثة. وديويقدم وصفا الذيل من الإجراءات المطلوبة لجمع الخلايا وتجهيزها لتلطيخ المناعى ومناعي. بشكل جماعي شكل ثقافة 3D وصفها، جنبا إلى جنب مع خطوط اتفاقية حقوق الطفل الأساسية، يوفر متوسطة المهم تسليط نظام نموذجي الخرج للبحث البروستاتا القائم على biospecimen.

Introduction

تحديد واستخدام علاجات السرطان التي يتم الشخصية للأفراد هي الهدف الأساسي في أبحاث السرطان. مؤخرا، تم وضع مناهج جديدة تسمح لسهولة أكبر في إنشاء مزارع الخلايا الأولية، وتوفير يحتمل سبل كلا تحديد واختبار علاجات شخصية. على سبيل المثال، البروستاتا استنادا R-spondin-نهج عضوي الشكل ¹ يسمح للثلاثي الأبعاد (3D) زراعة خلايا سرطان البروستاتا العادية والمنتشر في المصفوفة خارج الخلية التجارية (على سبيل المثال، Matrigel)، في حين أن مشروطة إعادة برمجة خلايا (CRC) طريقة وضعت في جورج تاون ^{2، 3 ويستخدم} أكثر من الشروط ثقافة 2D القياسية. على وجه التحديد، والجمع بين كيناز رو (Y-27632) والخلايا الليفية تغذية الفئران J2 المشع يؤدي إلى زراعة غير محددة من مراكز التأهيل المجتمعي القرنية ^2. منهجية اتفاقية حقوق الطفل هيقوية للغاية، مع خطوط الخلايا الأولية إنشاء بنجاح والحفاظ عليها إلى ما لا نهاية من البروستاتا وغيرها من العديد من الأنسجة الطلائية العادية والخبيثة ^3. الأهم من ذلك، تكنولوجيا CRC لدينا سمحت للالتعرف السريع على أساس المسببة لحليمي الجهاز التنفسي المتكررة في المريض الذي قد فشل عدد من العلاجات الدوائية السابقة. وبالإضافة إلى ذلك، وذلك باستخدام مراكز التأهيل المجتمعي العادية والمشتقة من الورم، وافق على تحديد الناجح لادارة الاغذية والعقاقير المخدرات، vorinostat، قدم في غضون أسبوعين من خزعة الأنسجة الأولي. تم وضع المريض على vorinostat، مما أدى إلى نجاح العلاج من المرض ^(4).

وتتألف غدة البروستاتا الطبيعية من اللمعية، القاعدية والخلايا الغدد الصم العصبية النادرة ^5. الخلايا اللمعية تشكل طبقة الطلائية للغدة وتعبر عن مستقبلات الاندروجين (AR)، فضلا عن غيرها من علامات اللمعية مثل cytokeratins 8 و 18 و المؤيدمستضد محددة للدولة (PSA) ^6. على العكس من ذلك، يتم ترجمة الخلايا القاعدية تحت طبقة اللمعية والتعبير عن cytokeratin 5 و p63، ولكن انخفاض مستويات ع ^{5. لدينا 7،} استخدمت ^{8 و 9} و ¹⁰ آخرين بنجاح مراكز التأهيل المجتمعي البروستاتا في التحقيقات حساسية العقاقير الميكانيكية قبل السريرية. ومع ذلك، عندما نمت في ظل ظروف زراعة الأنسجة 2D القياسية، تفشل هذه الخلايا بشكل كامل الانخراط AR يشير ^10. الأهم من ذلك، عندما وضعت تحت كبسولة الكلى من الفئران العوز المناعي، استعاد مراكز التأهيل المجتمعي العادية البروستاتا العمارة غدي وظيفة مشيرا إلى أن مراكز التأهيل المجتمعي البروستاتا تحتفظ التزام نسبهم عند وضعها في بيئة متساهلة. تطوير نظام زراعة الخلايا استنادا إدراج مرشح الموصوفة هنا تسمح لالسريعة (2 أسابيع) في المختبر التفريق بين مراكز التأهيل المجتمعي البروستاتا وب يتضحذ زيادة التعبير عن الجينات المستهدفة AR AR وكذلك انخفاض مستويات p63.

لإدراج مرشح المستخدمة تحتوي على أغشية البولي (حجم المسام، 0.4 ميكرومتر) التي يمكن أن تدعم زراعة الخلايا الثديية. النظام، كما وضعت، يجعل من استخدام مراكز التأهيل المجتمعي البروستاتا الطبيعية والخبيثة، أطباق ثقافة 6 جيدا وإدراج مرشح. وسائل الإعلام ثقافة الخلية مكيفة من قبل خلايا J2 ¹¹ يوضع في الغرفة والبروستاتا التفريق وسائل الإعلام القاع في الغرفة العليا. وصف تقنيات تدعم هذه الوثيقة البروستاتا اللمعية تمايز الخلايا في إطار زمني 2 الأسبوع، بما يتفق مع أهداف الطب الشخصي. وكان أيضا لا بد من تطوير المنهجيات التي تسمح للتنميط شامل الجزيئي، وراثي والخلوية من الثقافات. وقد تم تطوير المناهج لعزل DNA و RNA والبروتين من الخلايا التي صدرت من سطح مرشح ومبسطة لتجهيز العينات دقيقة تكرار. فيناLLY، والمنهجية اللازمة لإزالة مرشح لتمكين التضمين، باجتزاء ول H & E، المناعى وتلطيخ مناعي، يتم وصفه.

Protocol

1. إنشاء خلية 3D الثقافة إدراج نظام

1. ضع إدراج ثقافة خلية 2 البولي في التوجه المقلوب (فلتر جانب متابعة) بانخفاض في 6 لوحة جيدا (الشكل 1A).
2. تطبيق طبقة رقيقة من 0.1٪ الجيلاتين في الماء إلى الجانب السفلي من إدراج والسماح ليجف (10-20 دقيقة) في خزانة السلامة البيولوجية للحفاظ على عقم.
3. كرر الخطوة 1.2 مرتين أخريين ليصبح المجموع 3 طلبات من الجيلاتين 0.1٪ على إدراج.
   ملاحظة: سوف طلاء الجيلاتين يساعد حد الانتشار بين الغرف.
4. لجمع مراكز التأهيل المجتمعي الأولية من الظروف والثقافة القياسية، إضافة 5 مل من برنامج تلفزيوني لغسل القارورة الثقافة.
   1. يعرض للتريبسين الخلايا باستخدام (1 مل لT-25 و 2 مل لT-75) 0.25٪ التربسين-EDTA لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية. اضغط برفق على جانب من قارورة للمساعدة في طرد الخلايا. ثم المضي قدما لوقف رد الفعل التربسين، وجمع الخلايا عن طريق إضافة 5 مل من DMEM كاملة.
   2. تجميع خلايا في أنبوب 15 مل. أنبوب الطرد المركزي في 4 درجات مئوية و 188 x ج والعد باستخدام عداد الخلية الآلي أو عدادة الكريات.
   3. اعادة تعليق 600،000 مراكز التأهيل المجتمعي في 250 ميكرولتر مكيفة وسائل الاعلام (CM) وإضافة إلى المنحى بشكل صحيح (الجانب مرشح لأسفل) إدراج الثقافة (الشكل 1B). هذا ويشار إليها باسم الغرفة الداخلية.
      ملاحظة: CM هو F-وسائل الإعلام مشروطة خلايا J2 المشع ويحتوي على 10 ميكرومتر Y-27632 كما هو موضح سابقا ^{7، 8، 9، 11.}
5. تطبيق 2 مل من سم إلى الغرفة الخارجية للوحة 6 جيدا واحتضان عند 37 درجة مئوية خلال الليل (لمدة 18 ساعة على الأقل).
6. إزالة بعناية سم في الغرفة الداخلية مع 1 مل أو ماصة 200 ميكرولتر وإضافة ببطء وسائل الإعلام التمايز (DM) إلى الغرفة الداخلية مع مل ماصة 1 حتى الشبع. كن حذرا حتى لا تعكر صفو طبقة الخلايا.

لو "> 2. صيانة الثقافات 3D

1. تحقق ثقافات كل يوم. تظهر الخلايا السليمة كما هو مبين في الشكل 2.
2. تغيير سم في الغرفة الخارجية كل يوم او كل يومين اعتمادا على عملية الأيض في الخلايا.
3. عندما وسائل الإعلام من داخل يتغير لون الغرفة (الصفراء)، وإزالة بعناية وسائل الإعلام على غرفة مرشح الداخلية مع 1 مل أو 200 ماصة ميكرولتر.
4. نضح في وسائل الإعلام في غرفة وحة جيدا الخارجي 6 مع تلميح الشفط.
5. باستخدام ماصة 1 مل، وتطبيق ببطء DM جديدة للغرفة الداخلية حتى الشبع. يجب الحرص على عدم كشط أو إزاحة طبقة الخلايا.
6. استبدال وسائل الإعلام في غرفة الخارجي مع 2 مل من CM جديدة.
7. الحفاظ على الثقافات لمدة 2 أسابيع، ومن ثم الشروع في معالجة لعزل ثنائي الجزيء المطلوب.
   ملاحظة: كل صف في لوحة 6 جيدا، ما مجموعه ستة إدراج (الشكل 1B)، يجب أن تتم معالجتها في التجربة للحصول على ما يكفي من الخلايا لDNA، RNA أو البروتين للتحليل.
8. وسائل الاعلام نضح في الغرفة الخارجية وشطف مع 2 مل الفوسفات مخزنة المالحة (PBS).
9. إزالة بعناية وسائل الإعلام من الغرفة الداخلية مع 1 مل أو 200 ماصة ميكرولتر وإضافة 500 ميكرولتر برنامج تلفزيوني. تجنب إلغاء أو إزعاج وإلا فإن الخلايا على الغشاء.
10. نضح في برنامج تلفزيوني من الغرفة الخارجية وإزالة بعناية برنامج تلفزيوني من الغرفة الداخلية مع 1 مل أو 200 ماصة ميكرولتر. مرة واحدة تمت إزالة برنامج تلفزيوني، الانتقال مباشرة إلى التطبيق المناسب المفصلة أدناه. لا تسمح للغشاء لتجف. ثقافة يمكن أن تبقى لفترة وجيزة في برنامج تلفزيوني حتى الطلب على استعداد للبدء.

3. معالجة المرشحات لبيليه المصرفية

1. إضافة 100 ميكرولتر 0.25٪ التربسين-EDTA لكل غرفة الداخلية واحتضان لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
2. لفترة وجيزة وبعناية تحرض / تتخلص من الخلايا على سطح الغشاء مع ماصة 200 ميكرولتر في حين pipetting صعودا وهبوطا (تجنب puncتورينج الغشاء). احتضان لمدة 1 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
3. إضافة 250 ميكرولتر من سم إلى أول الغرفة الداخلية وماصة صعودا وهبوطا بلطف لشطف التصفية.
4. نقل معلق الخلايا إلى غرفة مرشح المجاورة التي تحتوي على الشروط وسائل الإعلام نفسها وتكرار pipetting صعودا وهبوطا.
5. كرر هذا الإجراء لكل من يدرج في حالة واحدة. جمع ونقل الخلايا إلى أنبوب الطرد المركزي 1.5 مل.
6. شطف كل الغرفة الداخلية مع 100-200 ميكرولتر إضافية من سم إلى جمع أي الخلايا المتبقية. إضافة إلى أنبوب 1.5 مل الطرد المركزي في الخطوة 3.5.
7. تدور الخلايا في 423 x ج في microcentrifuge عند 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
8. نضح طاف ويغسل بيليه الخلايا مرة واحدة مع 1000 ميكرولتر في برنامج تلفزيوني.
9. تدور مرة أخرى في 423 x ج في microcentrifuge عند 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
10. نضح في برنامج تلفزيوني وتجميد في -80 درجة مئوية لاستخدامها لاحقا.

4. معالجة المرشحات لRNA أو DNA عزل

1. إضافة 200 ميكرولتر من guanidinium ثيوسيانات الفينول كلوروفورم، أو ما شابه ذلك كاشف استخراج إلى الغرفة الداخلية وتستنهض الهمم لفترة وجيزة الخلايا على سطح غشاء من قبل pipetting صعودا وهبوطا.
2. احتضان في الكاشف استخراج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة مع غرفة الخارجي الجافة.
   1. وبما أن المرشح قد تنأى من إدراج، وغسل غشاء فلتر نأت من قبل pipetting الحل استخراج صعودا وهبوطا. جمع أكبر قدر من كاشف استخراج ممكن عن طريق إمالة لوحة 6 جيدا والشفط أي السائل المتبقي.
3. اتبع بروتوكول الشركة المصنعة لتنقية والانتعاش من الحمض النووي، RNA أو البروتين.

5. معالجة المرشحات لعزل بروتين

1. ضع إدراج مرشح في لوحة 6 جيدا على الجليد. إلى الغرفة الداخلية، إضافة 10 ميكرولتر من العازلة البروتين تحلل تستكمل مع 1 ملم فلوريد الصوديوم (ناف)، 1 ملم الصوديوم فانادات (NAV)، و 100 ملي dithiothreitol (DTT) و 100 ميكرولتر من الكوكتيل مكافحة البروتيني.
2. تستنهض الهمم / تتخلص من الخلايا على سطح الغشاء مع ماصة 20 ميكرولتر في حين pipetting صعودا وهبوطا. تجنب توليد فقاعات في المنطقة العازلة تحلل.
3. احتضان لوحة 6 جيدا مع إدراج مرشح على الجليد لمدة 10 دقيقة.
4. كرر كشط ثم شطف سطح الغشاء مع تحلل العازلة.
5. جمع لست] من 6 إدراج ونقل إلى أنبوب 1.5 مل الطرد المركزي على الجليد.
6. شطف الغشاء الأول مع 10 ميكرولتر إضافية من تحلل العازلة ونقل إلى تصفية المقبل.
7. كرر الخطوة 5.6 لجميع الملاحق، وجمع أي حل العازلة تحلل المتبقية وإضافة إلى أنبوب 1.5 مل (الخطوة 5.5).
8. احتضان العينة على الجليد لمدة 5 دقائق إضافية.
9. تدور في أقصى سرعة (16873 x ج في أعلى الجدول الطرد المركزي) لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية.
10. ماصة المحللة طاف في الطازجة 1.5 مل أنبوب.
11. انتقل إلى تحليل تركيز البروتين أو ستوإعادة لست] في -80 درجة مئوية.

6. تجهيز لH & E والمناعية تلطيخ

1. إضافة 500 ميكرولتر و 1 مل من 10٪ بنك الفجيرة الوطني (محايد مخزنة الفورمالين) إلى الغرفة الداخلية والخارجية والسماح احتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
2. نضح بنك الفجيرة الوطني من الغرفة الخارجية وإضافة 1 مل هيدروكسي الاغاروز (هيئة التعليم العالي) معالجة هلام إلى 1.5 مل الطرد المركزي. تذوب ببطء الاغاروز في الميكروويف باستخدام الطاقة المنخفضة وكرر 10-20 الصورة البقول حتى ذاب الاغاروز.
3. حافظ على هيئة التعليم العالي في حمام دافئ 37 درجة مئوية إلى منع التصلب حتى جاهزة للاستخدام.
4. إزالة بنك الفجيرة الوطني من الغرفة الداخلية وتطبيق 25 ميكرولتر من هيئة التعليم العالي المنصهر إلى الغرفة الداخلية والسماح للالاغاروز ليصلب لمدة 2-5 دقيقة.
5. الرطب منصات الأنسجة 2 رغوة في 10٪ بنك الفجيرة الوطني وتضع وسادة واحدة في كاسيت تضمينها (انظر الشكل 3D).
6. استخدام شفرة مشرط رقم 11 (التي لديها حادة جدا، شفرة غرامة الرؤوس) ليسجل مرشح من الجانب السفلي للإدراجغرفة، والإفراج جزئيا عليه من الغرفة إدراج البلاستيكية.
7. ضع كمية صغيرة (100-200 ميكرولتر) من بنك الفجيرة الوطني في طبق بتري وتزج مرشح فكها جزئيا في بنك الفجيرة الوطني (الشكل 3A).
8. بشفرة مشرط رقم 10، اضغط بلطف على منتصف مرشح، من داخل غرفة ملحقة، لإزاحة الكامل لمرشح من إدراج برميل (الشكل 3B). إذا كان هناك أي جزء من التصفية التي لا تزال تعلق على برميل، قطع مع مشرط.
9. قطع مرشح المغلفة هيئة التعليم العالي في نصف مع # 10 مشرط شفرة (الشكل 3C).
10. وضع كل نصف من مرشح على وسادة رغوة في الكاسيت الأنسجة أعد في خطوة 6.4 (الشكل 3D).
11. إضافة الثاني 10٪ بنك الفجيرة الوطني الإسفنج غارقة في الكاسيت، يقحم التصفية.
12. التقط ختم كاسيت، مكان في بنك الفجيرة الوطني، واحتضان بين عشية وضحاها.
13. مرشحات العملية إلى كتل البارافين لباجتزاء وتلطيخ كماسبق وصفها ^12.

النتائج

نظام إدراج الثقافة خلية مقرها هو إجراء بسيط نسبيا وسريع لإنتاج الثقافات 3D من مراكز التأهيل المجتمعي البروستاتا التي تدعم تمايز الخلايا اللمعية. ويرد التخطيطي للنظام (الشكل 1A) تسليط الضوء على تطبيق طلاء الجيلاتين على السطح السفلي من إدراج ?...

Discussion

خطوط الخلايا الأولية هي منصة هامة والتطور السريع لأبحاث السرطان. نظام الثقافة 3D على أساس إدراج الثقافة يدعم التفريق بين مراكز التأهيل المجتمعي البروستاتا الابتدائية في إطار زمني لمدة أسبوعين. يمثل طريقة تصفية اتفاقية حقوق الطفل، طريقة الإنتاجية المتوسطة جديد للبح?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Corning Costar Snapwell Culture Inserts	Corning	3801
Millicell Cell Culture Inserts	Millipore	PIHP01250
Multiwell 6 Well	Falcon	353046
Gelatin 0.1% in water	Stemcell Technologies	7903
Sterile Saftey Scapel 10 Blade	Integra Miltex	4-510
Sterile Standard Scalpel 11 Blade	Integra Miltex	4411
RIPA Lysis and Extraction Buffer	Thermofisher Scientific	89900
Sodium Fluoride	Fishcer Scientific	S299-100
Sodium Vanadate	Fishcer Scientific	13721-39-6
Dithiothreitol	Sigma-Aldrich	3483123
Protease Inhibitor Cocktail (AEBSF, Aprotinin, Bestatin, E-64, Leupeptin and Pepstatin A)	Sigma-Aldrich	P8340
0.25% Trypsin-EDTA (1x)	Thermofisher Scientific	25200-056
DMEM	Thermofisher Scientific	11965-092
FBS	Sigma-Aldrich	F2442
Glutamine	Thermofisher Scientific	25030081
Penicillin Streptomycin	Thermofisher Scientific	15140-122
F-12 Nutrient Mix Media	Thermofisher Scientific	11765054
Y-27632 dihydrochloride Rock inhibitor	Enzo	ALX-270-333-M025
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H0888
EGF	Thermofisher Scientific	PHG0315
Insulin	Thermofisher Scientific	12585-014
Cholera Toxin	Sigma-Aldrich	C3012
Gentamicin	Thermofisher Scientific	15710-064
Fungizone	Fisher Scientific	BP264550
Trizol Reagent	Invitrogen	15596026
Histogel Specimen Processing Gel (hydroxyethyl agarose (HEA))	Thermo Scientific	HG-4000-012
Non-Adherent Dressing	Telfa	KDL2132Z
Cell Culture Dish	Sigma	SIAL0167
HISTOSETTE II Tissue Processing / Embedding Cassettes	Crystalgen	CG-M492