Ein Rapid-Filtereinsatz-basierte 3D-Kultursystem für die primäre Prostata Zelldifferenzierung

Zusammenfassung

Here, we present a method for the establishment of a rapid in vitro system that supports the three dimensional culturing and subsequent luminal differentiation of primary prostate epithelial cells.

Zusammenfassung

Bedingtes umprogrammiert Zellen (CRCs) eine nachhaltige Methode zur primären Zellkultur und die Fähigkeit, umfangreiche "living Biobanken" von Patienten abgeleiteten Zelllinien zu entwickeln. Für viele Typen von Epithelzellen, verschiedene dreidimensionale (3D) Kultur Ansätze beschrieben worden, die eine verbesserte differenzierten Zustand unterstützen. Während CRCs ihre Abstammung Engagement für das Gewebe zu halten, aus dem sie isoliert sind, versagen sie viele der Differenzierungsmarker mit dem Ursprungsgewebe assoziiert auszudrücken, wenn sie unter normalen zweidimensionalen (2D) Kulturbedingungen gezüchtet. Um die Anwendung von Patienten stamm CRCs für Prostatakrebs Forschung verbessern, ein 3D-Kultur-Format definiert wurde, die eine schnelle (2 Wochen insgesamt) luminalen Zelldifferenzierung in normalen und Tumor-abgeleitete Prostata-Epithelzellen ermöglicht. Hierbei wird ein Filtereinsatz basierten Format wird sowohl für die Kultivierung und Differenzierung von normalen und malignen Prostata CRCs beschrieben. A dedetaillierte Beschreibung der Zellenerfassung und -verarbeitung für immunhistochemischen und Immunfluoreszenzanfärbung erforderlichen Verfahren für vorgesehen sind. Zusammengefasst das 3D-Kultur-Format beschrieben, mit den primären CRC-Linien kombiniert wird, liefert einen wichtigen mittel- Durchsatz Modellsystem für High- Bioprobe-basierte Prostata Forschung.

Einleitung

Die Identifizierung und Nutzung von Krebstherapien, die auf Einzelpersonen personalisiert sind ein vorrangiges Ziel in der Krebsforschung. Kürzlich wurden neue Konzepte entwickelt, die in die Einrichtung von primären Zellkulturen für größere Leichtigkeit ermöglichen, möglicherweise Weisen sowohl die Identifizierung und Prüfung personalisierten Therapien bieten. Zum Beispiel kann der R-spondin Basis Prostata organoiden Ansatz ¹ für dreidimensionale (3D) Kultivierung von normalen und metastatischen Prostatakrebszellen in einer kommerziellen extrazellulären Matrix (beispielsweise Matrigel), während die Bedingter Reprogrammierung von Zellen (CRC) Verfahren an der Georgetown ^{2 entwickelt,} nutzt ³ weitere Standard - 2D - Kulturbedingungen. Insbesondere führen die Kombination aus einem Rho - Kinase - Inhibitor (Y-27632) und bestrahlten J2 Maus - Fibroblasten - Feeder - Zellen auf unbestimmte Zeit Kultivierung von Keratinozyten CRCs ^2. Die CRC-Methodik istextrem robust, mit primären Zelllinien erfolgreich etabliert und auf unbestimmte Zeit aus der Prostata und viele andere normalen und malignen epithelialen Geweben ³ gehalten. Wichtig ist, dass unsere CRC-Technologie für die schnelle Identifizierung der ursächlichen Basis für rezidivierende Atemwegs Papillomatose bei einem Patienten erlaubt, die eine Reihe von früheren medikamentösen Behandlungen versagt hatte. Darüber hinaus mit normalen und tumorabgeleiteten CRCs genehmigte die erfolgreiche Identifizierung eines FDA Droge, Vorinostat, wurde innerhalb von zwei Wochen nach der anfänglichen Gewebebiopsie gemacht. Der Patient wurde auf vorinostat platziert, in der erfolgreichen Behandlung ihrer Erkrankung ⁴ führt.

Die normale Prostata wird von Luminal, basal umfasste und den seltenen neuroendokrinen Zellen ^5. Luminalen Zellen bilden die säulen Epithelschicht der Drüse und drücken den Androgen-Rezeptor (AR), sowie andere luminalen Marker wie Zytokeratine 8 und 18 und Prostate-spezifischen Antigens (PSA) ^6. Im Gegensatz dazu sind die basale Zellen unterhalb der luminalen Schicht lokalisiert und Zytokeratin 5 und p63 exprimieren, aber geringe Mengen des AR ^5. Wir haben ^{7, 8, 9} und andere ¹⁰ haben erfolgreich Prostata CRCs in präklinischen mechanistischen Arzneimittelempfindlichkeit Untersuchungen verwendet. Wenn jedoch unter Standard - 2D - Gewebekulturbedingungen gezüchtet, versagen diese Zellen vollständig AR Signalisierung ¹⁰ zu beteiligen. Wichtig ist gesetzt, wenn sie unter die Nierenkapsel von immungeschwächten Mäusen, gewann die CRCs normalen Prostatadrüsen Architektur und Funktion anzeigt, dass Prostata CRCs ihre Abstammung Engagement beibehalten, wenn sie in einer permissiven Umgebung platziert. Die Entwicklung des Filtereinsatzes basierenden Zellkultur hier beschriebene System ermöglicht eine schnelle (2 Wochen) in vitro Differenzierung von Prostata CRCs als belegt by die erhöhte Expression des AR und AR Zielgene sowie verringerte Mengen an p63.

Die Filtereinsätze verwendet werden, enthalten Polycarbonatmembranen (Porengröße 0,4 & mgr; m), die die Kultivierung von Säugetierzellen zu unterstützen. Das System, wie entwickelt, macht Gebrauch von normalen und malignen Prostata CRCs, 6-Well-Kulturschalen und die Filtereinsätze. Zellkulturmedien bedingt durch J2 - Zellen ¹¹ ist in der unteren Kammer und der Prostata Differenzierungsmedien in der oberen Kammer angeordnet. Die hierin beschriebenen Techniken Prostata luminalen Zelldifferenzierung innerhalb einer 2-wöchigen Zeitraum, im Einklang mit den Zielen der personalisierten Medizin zu unterstützen. Es war auch zwingend notwendig, die Methoden zu entwickeln, die für die umfassende molekulare, genetische und zelluläre Profilierung der Kulturen ermöglichen. Ansätze zur Isolierung von DNA, RNA und Protein aus Zellen von der Filteroberfläche gelöst wurden für eine genaue Wiederholungsprobenverarbeitung entwickelt und rationalisiert. Finally, Einbettung zu ermöglichen, die Methode zum Entfernen des Filters erforderlich ist, Schneiden und für H & E, immunhistochemischen und Immunfluoreszenzfärbung wird vollständig beschrieben.

Protokoll

1. Aufbau des 3D-Zellkultur Insert System

1. Platzieren 2 Polycarbonat Zellkultureinsätze in einer umgekehrten Ausrichtung (Filterseite nach oben) nach unten in einer 6 - Well - Platte (1A).
2. Tragen Sie eine dünne Schicht von 0,1% Gelatine in Wasser auf die Unterseite des Einsatzes und erlauben (10-20 min) in einem biologischen Sicherheitsschrank trocknen Sterilität aufrecht zu erhalten.
3. Wiederholen Sie Schritt 1.2 zwei weitere Male für insgesamt 3-Anwendungen von 0,1% Gelatine auf die Einsätze.
   HINWEIS: Die Gelatinebeschichtung Grenze Diffusion zwischen den Kammern helfen.
4. Um die primäre CRCs von Standardkulturbedingungen sammeln, 5 ml PBS, die Kulturflasche zu waschen.
   1. Trypsinize die Zellen unter Verwendung von (1 ml für eine T-25 und 2 ml für eine T-75) 0,25% Trypsin-EDTA für 5 min bei 37 ° C. Klopfen Sie leicht auf die Seite des Kolbens in Verdrängen der Zellen zu unterstützen. Dann gehen die Trypsin Reaktion zu stoppen und die Zellen zu sammeln, indem 5 ml komplettem DMEM.
   2. Sammeln die Zellen in ein 15 ml Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 4 ° C und 188 xg und zählen eine automatisierte Zellzähler oder eine Zählkammer.
   3. Re-suspend 600.000 CRCs in 250 & mgr; l konditioniertes Medium (CM) und zu der richtig ausgerichtet (Filterseite nach unten) Kultureinsatz (Abbildung 1B). Dies wird bezeichnet als die innere Kammer.
      Anmerkung: CM ist F-Medien durch bestrahlte J2 - Zellen konditioniert und enthält 10 & mgr; m Y-27632 , wie vorstehend beschrieben , ^{7, 8, 9, 11.}
5. Bewerben 2 ml CM in die äußere Kammer des 6-Well-Platte und Inkubation über Nacht bei 37 ° C (für mindestens 18 h).
6. Entfernen Sie vorsichtig die CM auf der inneren Kammer mit einer 1 ml oder 200 & mgr; l-Pipette und langsam Differenzierungsmedium (DM) in die innere Kammer mit einer 1-ml-Pipette bis zur vollständigen hinzuzufügen. Seien Sie vorsichtig, um nicht die Zellschicht stören.

le "> 2. Wartung von 3D-Kulturen

1. Überprüfen Sie jeden Tag die Kulturen. Gesunde Zellen erscheinen , wie in Abbildung 2 dargestellt.
2. Ändern des CM in der äußeren Kammer jeden Tag oder jeden zweiten Tag in Abhängigkeit vom Stoffwechsel der Zellen.
3. Wenn die Medien der inneren Kammer ändert sich die Farbe (gelb), sorgfältig die Medien auf der inneren Filterkammer zu entfernen mit einem 1 ml oder 200 & mgr; l-Pipette.
4. Saugen Sie das Medium in der Kammeraußen 6-Well-Platte mit einem saugenden Spitze.
5. Unter Verwendung einer 1 ml Pipette gelten langsam frisch DM in die innere Kammer bis zur vollständigen. Achten Sie darauf, nicht zu kratzen oder auf andere Weise die Zellschicht entfernen.
6. Ersetzen Sie die Medien in die äußere Kammer mit 2 ml frischem CM.
7. Pflegen die Kulturen für 2 Wochen und dann die Verarbeitung für die gewünschte Isolations bimolekularen fortzufahren.
   HINWEIS: Jede Zeile in der 6 - Well - Platte, insgesamt sechs Einsätze (Abbildung 1B), sollte pro Experiment verarbeitet werden , um genügend Zellen für die DN zu erwerbenA, RNA oder Protein, für die Analyse.
8. Aspirat Medien in der äußeren Kammer und Spülen mit 2 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
9. Sorgfältig Medien aus der inneren Kammer mit einer 1 ml Pipette oder 200 & mgr; l zu entfernen und 500 & mgr; l PBS hinzu. Vermeiden Abkratzen oder anderweitig stören die Zellen auf der Membran.
10. Aspirat PBS von der äußeren Kammer und vorsichtig PBS aus der inneren Kammer mit einer 1 ml oder 200 & mgr; l-Pipette entfernen. Sobald die PBS entfernt wurde, gehen direkt an die entsprechende Anwendung weiter unten beschrieben. Nicht in die Membran austrocknen. Die Kultur kann kurz in der PBS gehalten werden, bis die Anwendung bereit ist, zu beginnen.

3. Die Verarbeitung der Filter für die Pellet-Banking

1. Füge 100 & mgr; l 0,25% Trypsin-EDTA zu jeder Innenkammer und Inkubieren bei 37 ° C für 5 min.
2. Kurz und vorsichtig rühren / kratzen die Zellen auf der Membranoberfläche mit einer 200 & mgr; l Pipette beim Pipettieren nach oben und unten (vermeiden puncTuring die Membran). Inkubieren für 1 min bei 37 ° C.
3. Fügen Sie 250 ul von CM zu der ersten inneren Kammer und Pipette nach oben und unten vorsichtig den Filter zu spülen.
4. Transfer-Zellen zu der benachbarten Filterkammer resuspendiert, die dieselben Medienbedingungen enthält und wiederholen Auf- und Abpipettieren.
5. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jeden der Einsätze aus einem einzigen Zustand. Sammeln und zu transferieren Zellen in ein 1,5 ml-Zentrifugenröhrchen.
6. Spülen jede innere Kammer mit einer zusätzlichen 100-200 uL CM alle verbleibenden Zellen zu sammeln. In den 1,5 ml Zentrifugenröhrchen in Schritt 3.5.
7. Dreh die Zellen bei 423 · g in einer Mikrozentrifuge bei 4 ° C für 5 min.
8. Den Überstand aspirieren und waschen einmal das Zellpellet mit 1000 ul PBS.
9. Spin wieder bei 423 xg in einer Mikrozentrifuge bei 4 ° C für 5 min.
10. Absaugen PBS und Einfrieren bei -80 ° C für die spätere Verwendung.

4. Die Verarbeitung der Filter für die RNA oder DNA-Isolierung

1. Mit 200 & mgr; l Guanidiniumthiocyanat-Phenol-Chloroform oder ähnlichen Extraktionsreagens zu der inneren Kammer und kurz auf die Zellen auf der Membranoberfläche agitieren durch Auf- und Abpipettieren.
2. Inkubieren in dem Extraktionsreagenz für 5 min bei Raumtemperatur mit der äußeren Kammer trocken.
   1. Da der Filter aus dem Einsatz distanzieren kann, waschen Sie die distanzierte Filtermembran durch Auf- und Abpipettieren der Extraktionslösung. Sammeln Sie so viel des Extraktionsreagenz wie möglich durch die 6-Well-Platte Kippen und Restflüssigkeit abgesaugt.
3. Folge dem Protokoll des Herstellers zur Reinigung und Rückgewinnung von DNA, RNA oder Protein.

5. Die Verarbeitung der Filter für die Proteinisolierung

1. Setzen Sie den Filtereinsatz in der 6-Well-Platte auf Eis. Zu der inneren Kammer, mit 10 ul Puffer Protein Lyse, supplementiert mit 1 mM Natriumfluorid (NaF), 1 mM Natriumvanadat (NaV), 100 mM dithiothreITOL (DTT) und 100 & mgr; l anti-Protease-Cocktail.
2. Rühre / kratzen die Zellen auf der Membranoberfläche mit einer Pipette 20 ul beim Pipettieren nach oben und unten. Vermeiden Blasen in dem Lysepuffer erzeugen.
3. Inkubieren Sie die 6-Well-Platte mit Filtereinsätzen auf Eis für 10 min.
4. Wiederholen Sie kratzen und dann spülen Sie die Membranoberfläche mit dem Lysepuffer.
5. Sammeln Sie die Lysate aus den 6-Einsätze und Transfer in ein 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen auf Eis.
6. Spülen der ersten Membran mit zusätzlichen 10 & mgr; l Lysepuffer und Transfer zum nächsten Filter.
7. Wiederholen Sie Schritt 5.6 für alle Einsätze, restliche Lyse-Pufferlösung zu sammeln und zu der 1,5 ml-Röhrchen (Schritt 5.5).
8. Inkubieren Sie die Probe auf Eis für weitere 5 min.
9. Spin bei maximaler Geschwindigkeit (16.873 xg in einer Tischzentrifuge) für 15 min bei 4 ° C.
10. Pipette Lysatüberstand in ein frisches 1,5 ml-Röhrchen.
11. Fahren Sie mit der Analyse der Proteinkonzentration oder store Lysate bei -80 ° C.

6. Verarbeitung für H & E und Immuno-Färbung

1. Fügen 500 ul und 1 ml 10% NBF (neutral gepuffertes Formalin) zu der inneren und der äußeren Kammer und ließ über Nacht bei 4 ° C inkubieren.
2. Absaugen NBF von der äußeren Kammer und 1 mL hydroxyethyl Agarose (HEA) Verarbeiten Gel auf eine 1,5-ml-Zentrifuge. Langsam schmelzen die Agarose in einem Mikrowellen niedriger Leistung mit und 10-20 s Impulse wiederholt, bis die Agarose geschmolzen ist.
3. Halten Sie die HEA in einem 37 ° C warmen Bad Erstarrung zu verhindern, bis sofort einsatzbereit.
4. Entfernen Sie die NBF aus der inneren Kammer und anzuwenden 25 ul geschmolzenes HEA in die innere Kammer und damit die Agarose für 2-5 min verfestigt.
5. Wet 2 Schaum Histologie Pads in 10% NBF und legen Sie ein Pad in einer Einbettungskassette (siehe 3D).
6. Verwenden Sie ein # 11 Klinge Skalpell (was eine sehr scharfe hat, fein spitzer Klinge), um den Filter von der Unterseite des Einsatzes zu punktenKammer, indem Sie sie teilweise aus der Kunststoffeinsatz Kammer.
7. Legen Sie eine kleine Menge (100-200 ul) NBF in einer Petrischale und tauchen Sie den teilweise verdrängt Filter in der NBF (3A).
8. Mit einem # 10 Skalpellklinge, drücken leicht gegen die Mitte des Filters, von der Innenseite des Einsatzkammer, um vollständig den Filter aus dem Einsatz barrel (3B) entfernen. Wenn es irgendein Teil des Filters ist, die noch an der Trommel angebracht ist, trennen sie mit dem Skalpell.
9. Schneiden Sie die HEA-beschichteten Filter in der Hälfte mit dem # 10 Klinge Skalpell (3C).
10. Platzieren Sie jede Hälfte des Filters auf das Schaumstoffpolster in der Kassette Histologie vorbereitet in Schritt 6.4 (3D).
11. In den zweiten 10% NBF getränkten Schwamm in die Kassette, zwischen denen die Filter.
12. Snap-Siegel der Kassette, in NBF und über Nacht inkubiert.
13. Prozessfilter in Paraffinblöcke für das Schneiden und Färben alszuvor beschrieben ^12.

Ergebnisse

Der Zellkultureinsatz basiertes System ist ein relativ einfaches und schnelles Verfahren für die 3D-Kulturen von Prostata-CRCs produzieren, die luminale Zelldifferenzierung unterstützt. Eine schematische Darstellung des Systems gezeigt (Abbildung 1A) , die Anwendung der Gelatinebeschichtung an der unteren Oberfläche des Filtereinsatzes hervorhebt. Die Einsätze sind nur für die Anwendung der Gelatine umgeworfen. In 1B sind die Filter in der geeignete...

Diskussion

Primäre Zelllinien sind ein wichtiges und sich schnell entwickelnde Plattform für die Krebsforschung. Die Kultureinsatz-basierte 3D-Kultursystem unterstützt die Differenzierung von primären Prostata CRCs innerhalb einer zweiwöchigen Frist. Der CRC-Filter-Methode stellt eine neue, mittlere Durchsatzverfahren für Prostata-Forschung. Bestehende Maus PDX-Modelle sind zeitaufwendig und extrem teuer, und viele der PDX Proben nicht in Kultur gezüchtet werden, Forschern initiierte Experimente und ihre Nützlichkeit begre...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Corning Costar Snapwell Culture Inserts	Corning	3801
Millicell Cell Culture Inserts	Millipore	PIHP01250
Multiwell 6 Well	Falcon	353046
Gelatin 0.1% in water	Stemcell Technologies	7903
Sterile Saftey Scapel 10 Blade	Integra Miltex	4-510
Sterile Standard Scalpel 11 Blade	Integra Miltex	4411
RIPA Lysis and Extraction Buffer	Thermofisher Scientific	89900
Sodium Fluoride	Fishcer Scientific	S299-100
Sodium Vanadate	Fishcer Scientific	13721-39-6
Dithiothreitol	Sigma-Aldrich	3483123
Protease Inhibitor Cocktail (AEBSF, Aprotinin, Bestatin, E-64, Leupeptin and Pepstatin A)	Sigma-Aldrich	P8340
0.25% Trypsin-EDTA (1x)	Thermofisher Scientific	25200-056
DMEM	Thermofisher Scientific	11965-092
FBS	Sigma-Aldrich	F2442
Glutamine	Thermofisher Scientific	25030081
Penicillin Streptomycin	Thermofisher Scientific	15140-122
F-12 Nutrient Mix Media	Thermofisher Scientific	11765054
Y-27632 dihydrochloride Rock inhibitor	Enzo	ALX-270-333-M025
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H0888
EGF	Thermofisher Scientific	PHG0315
Insulin	Thermofisher Scientific	12585-014
Cholera Toxin	Sigma-Aldrich	C3012
Gentamicin	Thermofisher Scientific	15710-064
Fungizone	Fisher Scientific	BP264550
Trizol Reagent	Invitrogen	15596026
Histogel Specimen Processing Gel (hydroxyethyl agarose (HEA))	Thermo Scientific	HG-4000-012
Non-Adherent Dressing	Telfa	KDL2132Z
Cell Culture Dish	Sigma	SIAL0167
HISTOSETTE II Tissue Processing / Embedding Cassettes	Crystalgen	CG-M492