기본 전립선 세포 분화에 대한 신속한 필터 삽입 기반의 3D 문화 시스템

요약

Here, we present a method for the establishment of a rapid in vitro system that supports the three dimensional culturing and subsequent luminal differentiation of primary prostate epithelial cells.

초록

조건부 재 프로그램 세포 (CRC가)는 차 세포 ​​배양 및 환자 유래 세포 라인의 광범위한 "살아있는 바이오 뱅크"를 개발 할 수있는 능력에 대한 지속 가능한 방법을 제공한다. 상피 세포의 많은 유형의 다양한 삼차원 (3D) 배양 방법은 개선 된 분화 상태를 지원하는 것을 설명 하였다. CRC가 그들이 절연되어있는 조직에 자신의 혈통의 의지를 유지하는 동안, 그들은 보통 두 개의 차원 (2D) 배양 조건 하에서 성장하는 경우 원산지의 조직과 관련된 분화 마커의 많은 표현하지 못한다. 전립선 암 연구 환자 유래의 CRC의 적용을 강화하기 위해, 3 차원 배양 포맷은 정상 및 종양 유래 전립선 상피 세포 모두에서 급속한 (2 주 전체) 내강 세포 분화를 가능하게한다는 정의되었다. 여기서, 필터 삽입 기반 포맷은 정상 및 악성 전립선 CRC가 양자의 배양과 분화를 위해 설명된다. 드면역 조직 화학 및 면역 형광 염색 세포 수집 및 처리에 필요한 절차 꼬리 설명이 제공됩니다. 총체적으로 기본 CRC 라인과 함께 설명 된 3D 배양 형식은 biospecimen 기반 전립선 연구 처리량 모델 시스템을 릅니 중요한 중간을 제공한다.

서문

개인에게 개인화 된 식별 및 암 치료의 사용은 암 연구의 주요 목표입니다. 최근, 새로운 접근법은 잠재적 모두 파악하고 맞춤형 치료를 테스트하는 방법을 제공하는 일차 세포 배양 확립 더 큰 용이성을 허용 개발되었다. 예를 들어, R-spondin 기반 전립선 organoid 접근법 ^{1 허용} 상용 외 매트릭스에서 정상 및 전이성 전립선 암 세포의 3 차원 배양 (예, 마트 리겔)에 대한 세포의 조건부 재 프로그래밍 (CRC) 법 반면 조지 타운 ^{2에서 개발, 3 개} 표준 2 차원 배양 조건을 사용한다. 구체적으로는, Rho 키나아제 억제제 (Y-27632) 및 조사 J2 뮤린 섬유 모세포 피더 세포의 결합은 각질 세포의 ^CRC가이 부정 배양 이어질. 상기 CRC 방법은매우 강력한 일차 전지 라인이 성공적으로 설립 전립선 및 기타 여러 정상 및 악성 상피 조직 ^(3)로부터 무기한 유지와 함께. 중요한 것은, 우리의 CRC 기술은 이전의 약물 치료의 숫자를 실패한 환자에서 재발 성 호흡기 유두종의 병인으로의 신속한 식별을 허용했다. 또한, 정상 및 종양 유래의 CRC를 사용하여, FDA의 성공적인 식별 초기 조직 생검의 2 주 이내에되었다, vorinostat을 약물을 승인했다. 환자들은 질환 ^(4)의 성공적인 치료 결과 vorinostat에 넣었다.

정상적인 전립선은 내강, 기초 및 희귀 신경 내분비 세포 ^(5)으로 구성되어 있습니다. 내강 세포 선의 원주 상피 층을 형성하고, 안드로겐 수용체 (AR),뿐만 아니라 8 및 18 cytokeratins 친 다른 내강 마커를 발현국가 특이 항원 (PSA) ^6. 역으로, 기저 세포 내강 층 아래에 지역화 및 사이토 케라틴 5 P63 있지만, AR ^(5)의 낮은 레벨을 표현한다. 우리는 ^{7, 8, 9, 10 등을} 성공적 임상 약물 역학적 감도 연구에서 전립선의 CRC를 사용했다. 2D 표준 조직 배양 조건 하에서 성장 된 경우에는, 이들 세포가 완전히 ^{열 신호} AR 맞물린 못한다. 면역 결핍 쥐의 신장 캡슐 아래에 위치 할 때 중요한 점은 CRC가이 허용 환경에 배치 할 때 전립선 CRC가 자신의 혈통의 의지를 유지할 것을 나타내는 정상 전립선 선의 구조와 기능을 회복했습니다. 여기에 설명 된 필터 인서트 계 세포 배양 시스템의 개발이 급속 (2 주)를위한 증명 B와 같은 전립선의 CRC의 체외 분화를 허용Y 증가 아칸소와 AR 대상 유전자의 발현도 감소 등의 P63 수준.

사용되는 필터 삽입은 포유 동물 세포의 배양을지지 할 수 카보네이트 멤브레인 (기공 크기 0.4 ㎛의)을 포함한다. 시스템이 개발로, 정상 및 악성 전립선 CRC로 6 웰 배양 접시 필터 인서트를 사용한다. J2 전지 ^(11)에 의해 조절 된 세포 배지는 상부 챔버 하부 측실 전립선 분화 배지에서 배치된다. 기술은 본원 맞춤 의학의 목적과 일치하는 2 주 기간 내에 전립선 내강 세포 분화를 지원 설명한다. 문화의 포괄적 인 분자 유전 학적 및 세포 프로파일을 허용 방법론을 개발하는 것이 필수적이었다. 필터 표면으로부터 방출 세포에서 DNA, RNA 및 단백질을 분리하는 방법을 개발하고 정확한 반복 시료 처리 간소화되었다. FINA에서야 베드로, 방법론은 H & E, 면역 조직 화학 및 면역 형광 염색, 삽입을 사용할 수 있도록 필터를 제거 절편과 필요한 완전히 설명되어 있습니다.

프로토콜

3 차원 셀의 1. 설립 문화 삽입 시스템

1. 아래로 6 웰 플레이트 (그림 1A)에서 역 방향 (최대 필터 측) 2 폴리 카보네이트 세포 배양 삽입을 놓습니다.
2. 인서트의 바닥면에 물을 0.1 % 젤라틴의 얇은 층을 적용하고 멸균을 유지하기 위해 생물학적 안전 캐비넷 (10-20 분) 건조 할 수있다.
3. 단계를 반복 1.2 삽입에 0.1 % 젤라틴의 3 응용 프로그램의 총 두 번 더.
   주 : 젤라틴 코팅 챔버 사이의 제한 확산 도움이 될 것입니다.
4. 문화 플라스크를 씻어 PBS의 5 mL를 넣고, 표준 배양 조건에서 차의 CRC를 수집합니다.
   1. 37 ° C에서 5 분 동안 0.25 % 트립신 EDTA (a T-75에 대한 T-25이 용액 1 ㎖)를 사용하여 세포를 Trypsinize. 부드럽게 세포를 빠지에 도움을 플라스크의 측면을 누릅니다. 이어서 트립신 반응을 정지하고 완전 DMEM 5 ㎖를 첨가하여 세포를 수집하기 위해 진행.
   2. 수집 15 ㎖의 튜브에 세포. 4 ° C와 188 XG에서 튜브를 원심 분리기 및 자동 셀 카운터 또는 혈구를 사용하여 계산합니다.
   3. 미디어 (CM)를 조절 250 μL에 60의 CRC를 다시 일시 중단하고 제대로 지향 (필터면을 아래로) 문화 삽입 (그림 1B)에 추가 할 수 있습니다. 이는 내부 챔버로 지칭된다.
      참고 : CM은 조사 J2 세포에 의해 조절 F-매체이며, 이전에 ^{7, 8, 9, 11} 설명 된대로 10 μm의 Y-27632이 포함되어 있습니다.
5. 6 웰 플레이트의 외부 챔버에 CM의 2 용액을 적용하고 (최소 18 시간) 밤새 37 ° C에서 품어.
6. 조심스럽게 한 ML 200 μL 피펫으로 내부 챔버에 CM을 제거하고 천천히 풀 때까지 1 ML의 피펫 내부 챔버에 차별화 미디어 (DM)를 추가합니다. 셀 계층을 방해하지 않도록주의해야합니다.

3D 문화의 제작 "> 2. 유지 관리

1. 매일 문화를 확인합니다. 그림 2와 같이 건강한 세포가 나타납니다.
2. 외부 챔버의 CM 매일 또는 세포의 신진 대사에 따라 매일 변경합니다.
3. (노란색) 내부 챔버 변경 색상의 매체는 조심스럽게 한 ML 200 μL 피펫으로 내부 필터 챔버에서 용지를 제거합니다.
4. 흡인 팁과 외부 6 웰 플레이트 챔버에서 미디어를 대기음.
5. 1 ML의 피펫을 사용하여 천천히 풀 때까지 내부 챔버에 신선한 DM을 적용합니다. 긁어하거나 셀 층을 제거하지 않도록주의하십시오.
6. 신선한 CM 2 mL로 외부 챔버에서 미디어를 교체합니다.
7. 2 주 문화를 유지 한 다음 원하는 생체 분자 분리에 대한 처리를 진행합니다.
   주 : 6 웰 플레이트의 각 행은, 여섯 삽입 (그림 1B)의 총, DN에 대한 충분한 세포를 얻기 위해 실험에 따라 처리해야분석을 위해 A, RNA 또는 단백질.
8. 외측 챔버 대기음 매체 및 2 ㎖의 인산 완충 식염수 (PBS)로 헹군다.
9. 조심스럽게 한 ML 200 μL 피펫과 내부 챔버에서 미디어를 제거하고 500 μL PBS를 추가합니다. 긁어하거나 막에 세포를 방해하지 마십시오.
10. 기음 외부 챔버에서 PBS 조심스럽게은 1 mL를 200 μL 피펫으로 내부 챔버에서 PBS를 제거합니다. PBS를 제거하고 나면 아래에 설명 된 해당 응용 프로그램에 직접 진행합니다. 멤브레인이 건조하는 것을 허용하지 않습니다. 응용 프로그램이 시작할 준비가 될 때까지 배양은 PBS로 잠시 유지할 수있다.

3. 펠렛 은행의 필터 처리

1. 각 내부 챔버 100 μL 0.25 % 트립신 - EDTA를 추가하고 37 ℃에서 5 분 동안 품어.
2. 아래로 피펫 팅하는 동안 간단히 조심스럽게이 / 교반 200 μL 피펫으로 막 표면에 세포를 긁어 (punc을 피하기) 막을 튜링. 37 ° C에서 1 분 동안 품어.
3. 필터를 씻어 아래로 부드럽게 제 1 내부 챔버에 CM의 250 μL를 추가하고 최대 피펫합니다.
4. 전송 매체 같은 조건을 포함하고, 상하 피펫 팅을 반복하여 인접하는 필터 챔버에 세포를 재현 탁.
5. 단일 조건의 삽입 각각에 대해이 절차를 반복합니다. 수집 및 1.5 mL의 원심 분리기 튜브에 세포를 전송합니다.
6. 남아있는 세포를 수집하는 CM의 추가로 100 ~ 200 μL 각 내부 챔버를 씻어. 단계 3.5에서 1.5 ML의 원심 분리기 튜브에 추가합니다.
7. 5 분 동안 4 ℃에서의 microcentrifuge 423 XG에 세포를 스핀.
8. 뜨는을 기음 1000 μL PBS로 한 번 세포 펠렛을 씻는다.
9. 5 분 동안 4 ° C에서의 microcentrifuge에서 423 XG에 다시 스핀.
10. 대기음 PBS하고 나중에 사용하기 위해 -80 ° C에서 동결.

4. RNA 또는 DNA 분리에 대한 필터 처리

1. 내부 챔버를 구 아니 디늄 티오 시아 네이트 - 페놀 - 클로로포름 추출 또는 유사 시약 200 μL를 첨가하고 잠시로 pipetting 아래로 막 표면에 세포를 교반한다.
2. 외부 챔버 건조한 실온에서 5 분간 추출 시약 부화.
   1. 필터 삽입로부터 해리되어 있으므로, 상하 추출 용액을 피펫 팅에 의해 해리 된 여과막을 씻는다. 6 웰 플레이트를 기울 남아있는 액체를 흡입하여 가능한 한 추출 시약의 정도를 수집합니다.
3. 정화 및 DNA, RNA 또는 단백질의 복구를 위해 제조 업체의 프로토콜을 따르십시오.

5. 단백질 분리를위한 필터 처리

1. 얼음의 6 웰 플레이트에서 필터 인서트를 놓습니다. 상기 내부 챔버에 10 μL 1 mM의 불소화 나트륨 (NaF로부터), 1 mM 나트륨 바나 데이트 (NAV)를 100mM dithiothre 보충 된 단백질을 용해 완충액으로 추가itol (DTT) 및 안티 단백질 분해 효소 칵테일의 100 μL.
2. / 교반로 pipetting 상하 동안 20 μL 피펫 막 표면에서 세포를 긁어. 용해 버퍼에 거품을 생성하지 마십시오.
3. 10 분 동안 얼음에 필터 삽입과 6 웰 플레이트를 품어.
4. 스크래핑 반복 한 후 용해 완충액으로 막 표면을 헹군다.
5. 6 삽입에서 해물을 수집하고 얼음에 1.5 mL의 원심 분리기 튜브로 전송할 수 있습니다.
6. 다음 필터 용해 완충액과 전사의 추가 10 μL와 제 막을 씻어.
7. 모든 삽입 단계를 반복 5.6, 잔류 용해 완충 용액을 수집하고 1.5 mL의 튜브 (단계 5.5)에 추가 할 수 있습니다.
8. 추가로 5 분 동안 얼음에 샘플을 품어.
9. 4 ℃에서 15 분 동안 최대 속도 (테이블 탑 원심 분리기에서 16,873 XG)에서 스핀.
10. 신선한 1.5 ML의 튜브에 피펫 해물 상청.
11. 단백질 농도 또는 석재의 분석을 진행-80 ° C에서 해물을 다시.

H & E 및 면역 염색 6. 처리

1. 내부 및 외부 챔버에 500 μL 10 %의 1 mL의 NBF (중성 완충 포르말린)를 추가하고 4 ℃에서 하룻밤 배양 할 수 있습니다.
2. 외부 챔버에서 NBF를 대기음 1 ML의 히드 록시 에틸 아가로 오스 (HEA) 1.5 mL를 원심 분리기로 처리 겔을 추가합니다. 천천히 낮은 전력을 사용하여 전자 레인지에 아가로 오스를 용융 아가로 오스가 용해 될 때까지 10 ~ 20의 펄스를 반복했다.
3. 사용할 준비가 될 때까지의 응고를 방지하기 위해 37 ℃ 온욕 중에서 HEA 유지.
4. 내부 챔버에서 NBF를 제거하고 내부 챔버에 용융 HEA의 25 μL를 적용하고 아가로 오스는 2-5 분 동안 응고 할 수 있습니다.
5. 10 % NBF 젖은 2 거품 조직학 패드 (그림 3D 참조) 포함 카세트에 하나의 패드를 배치합니다.
6. 삽입의 바닥면에서 필터를 점수 (매우 날카로운, 미세 뾰족한 날이있는)을 # 11 블레이드 메스를 사용하여챔버는 부분적으로 플라스틱 삽입 챔버에서 방출.
7. 페트리 접시에 NBF 소량 (100 ~ 200 μL)를 놓고 NBF (그림 3A)에서 부분적으로 벗겨져 필터를 체험.
8. A # 10 메스 블레이드 부드럽게 완전히 삽입 배럴 (도 3b)로부터 필터를 꺼 내려 삽입 챔버의 내부에서, 상기 필터의 중앙에 대해 누른다. 여전히 배럴에 부착 된 필터의 어느 부분이 있으면, 메스로 절단.
9. # 10 블레이드 메스 (그림 3C)와 함께 반으로 HEA 코팅 필터를 잘라.
10. 단계 6.4 (그림 3D)에서 제조 한 조직학 카세트의 폼 패드에 필터의 각각의 절반을 놓습니다.
11. 필터를 사이에두고, 카세트에 두 번째 10 % NBF 적신 스폰지를 추가합니다.
12. 스냅 NBF에서 카세트, 장소를 밀봉하고, 밤새 품어.
13. 단면 처리 및 염색 등을위한 파라핀 블록으로 처리 필터이전 ¹² 설명했다.

결과

세포 배양 인서트 기반 시스템 내강 세포 분화를 지원 전립선 CRC가 3 차원 배양 물을 제조하기위한 상대적으로 간단하고 신속한 방법이다. 시스템의 개략적 필터 인서트의 바닥면에 젤라틴 코팅의 적용을 강조 (도 1A)를 나타낸다. 삽입물은 젤라틴의 적용 번복된다. 도 1b에 필터는 배양에 적절한 방향이다. 투명 셀 인서트를 사용하여 3 차원 전립?...

토론

일차 세포주 암 연구의 중요하고 빠르게 개발 플랫폼이다. 배양 인서트 기반 3 차원 배양 시스템은 2 주 기간 내에 기본 전립선 CRC로의 분화를 지원한다. 상기 CRC 필터 방법은 전립선 연구를위한 새로운 중간 처리량 방법을 나타낸다. 기존 마우스 PDX 모델은 시간 소모적이며 매우 비싸고, 상기 PDX 샘플의 많은 연구자 시작한 실험과 그 유용성을 제한 배양에서 성장 될 수 없다. PDX 확립의 성공률을 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Corning Costar Snapwell Culture Inserts	Corning	3801
Millicell Cell Culture Inserts	Millipore	PIHP01250
Multiwell 6 Well	Falcon	353046
Gelatin 0.1% in water	Stemcell Technologies	7903
Sterile Saftey Scapel 10 Blade	Integra Miltex	4-510
Sterile Standard Scalpel 11 Blade	Integra Miltex	4411
RIPA Lysis and Extraction Buffer	Thermofisher Scientific	89900
Sodium Fluoride	Fishcer Scientific	S299-100
Sodium Vanadate	Fishcer Scientific	13721-39-6
Dithiothreitol	Sigma-Aldrich	3483123
Protease Inhibitor Cocktail (AEBSF, Aprotinin, Bestatin, E-64, Leupeptin and Pepstatin A)	Sigma-Aldrich	P8340
0.25% Trypsin-EDTA (1x)	Thermofisher Scientific	25200-056
DMEM	Thermofisher Scientific	11965-092
FBS	Sigma-Aldrich	F2442
Glutamine	Thermofisher Scientific	25030081
Penicillin Streptomycin	Thermofisher Scientific	15140-122
F-12 Nutrient Mix Media	Thermofisher Scientific	11765054
Y-27632 dihydrochloride Rock inhibitor	Enzo	ALX-270-333-M025
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H0888
EGF	Thermofisher Scientific	PHG0315
Insulin	Thermofisher Scientific	12585-014
Cholera Toxin	Sigma-Aldrich	C3012
Gentamicin	Thermofisher Scientific	15710-064
Fungizone	Fisher Scientific	BP264550
Trizol Reagent	Invitrogen	15596026
Histogel Specimen Processing Gel (hydroxyethyl agarose (HEA))	Thermo Scientific	HG-4000-012
Non-Adherent Dressing	Telfa	KDL2132Z
Cell Culture Dish	Sigma	SIAL0167
HISTOSETTE II Tissue Processing / Embedding Cassettes	Crystalgen	CG-M492