Un sistema di coltura 3D Rapid Cartuccia filtro-based per la prostata primaria cellulare Differenziazione

Riepilogo

Here, we present a method for the establishment of a rapid in vitro system that supports the three dimensional culturing and subsequent luminal differentiation of primary prostate epithelial cells.

Abstract

le cellule riprogrammate condizionale (CRC) forniscono un metodo sostenibile per la coltura di cellule primarie e la capacità di sviluppare ampie "biobanche di vita" di pazienti derivate linee cellulari. Per molti tipi di cellule epiteliali, vari approcci tridimensionale (3D) di coltura sono stati descritti che supporta uno stato differenziato migliorata. Mentre CRC mantengono la loro lineage committment al tessuto dal quale sono isolati, non riescono ad esprimere molti dei marcatori di differenziazione associate al tessuto di origine quando coltivate in normali due condizioni dimensionali (2D) di coltura. Per migliorare l'applicazione della CRC paziente-derivato per la ricerca sul cancro alla prostata, un formato di cultura 3D è stato definito che consente una rapida luminale differenziazione cellulare (2 settimane in totale) in entrambe le cellule epiteliali della prostata normali e tumorali di derivazione. Qui, un formato basato su inserto del filtro è descritto per la coltura e differenziazione di entrambe le normali e maligni CRC prostata. A deDescrizione coda delle procedure richieste per la raccolta delle cellule e di elaborazione per la colorazione immunoistochimica e immunofluorescenza sono forniti. Collettivamente formato coltura 3D descritto, in combinazione con le linee CRC primari, fornisce un importante medio per evidenziare sistema modello produttività per la ricerca della prostata biospecimen-based.

Introduzione

L'identificazione e l'uso di terapie del cancro che sono personalizzati per gli individui sono un obiettivo primario nella ricerca sul cancro. Recentemente, sono stati sviluppati nuovi approcci che consentono una maggiore facilità nella creazione di colture cellulari primarie, fornendo potenzialmente modi sia di identificare e testare terapie personalizzate. Ad esempio, la prostata basata R-spondina approccio organoide ¹ consente tridimensionale (3D) coltura di normali e metastatici cellule tumorali della prostata in una matrice extracellulare commerciale (ad esempio, Matrigel), mentre il metodo condizionale riprogrammazione delle cellule (CRC) sviluppato presso Georgetown ^{2, 3} utilizza più condizioni di coltura 2D standard. In particolare, la combinazione di un inibitore della chinasi Rho (Y-27632) e cellule feeder fibroblasti murini J2 irradiati portano alla coltura indefinito di CRC cheratinociti ^2. La metodologia è CRCestremamente robusto, con linee cellulari primarie stabilite con successo e mantenuto a tempo indeterminato dalla prostata e molti altri tessuti epiteliali normali e maligne ^3. È importante sottolineare che la nostra tecnologia CRC ha permesso la rapida identificazione della base eziologico per papillomatosi respiratoria ricorrente in un paziente che non era riuscito un certo numero di trattamenti farmacologici precedenti. Inoltre, utilizzando normali e tumorali derivate dal CRC, l'identificazione di successo di un farmaco approvato dalla FDA, vorinostat, è stata fatta entro due settimane dalla biopsia dei tessuti iniziale. Il paziente è stato posto sulla vorinostat, conseguente trattamento di successo della loro malattia ^4.

La prostata normale si compone di luminale, basale e le cellule neuroendocrine rari ^5. cellule luminali formano lo strato epiteliale colonnare della ghiandola ed esprimono il recettore degli androgeni (AR), così come altri marcatori luminali quali citocheratine 8 e 18 e proantigene specifico-stato (PSA) ^6. Viceversa, le cellule basali sono localizzati sotto lo strato luminale ed esprimono citocheratina 5 e p63, ma bassi livelli di AR ^5. Abbiamo ^{7, 8, 9} e altri ¹⁰ hanno utilizzato con successo CRC prostata in preclinici indagini sensibilità ai farmaci meccanicistici. Tuttavia, se coltivate in condizioni di coltura tissutale 2D standard, queste cellule non riescono a cooperare pienamente AR segnalazione ^10. È importante sottolineare che, quando posto sotto la capsula renale di topi immunodeficienti, il CRC riacquistato normale prostata architettura e la funzione ghiandolare che indica che CRC prostata mantengono il loro impegno lignaggio, quando sono immessi in un ambiente permissivo. Lo sviluppo del sistema di coltura cellulare basato inserto filtro qui descritto consente rapidi (2 settimane) differenziazione in vitro di CRC prostata come evidenziato by l'aumentata espressione di geni bersaglio AR e AR, nonché diminuzione dei livelli di p63.

Gli inserti del filtro utilizzati contengono membrane di policarbonato (dimensione dei pori, 0,4 micron) che possono sostenere la coltura di cellule di mammifero. Il sistema, sviluppato, fa uso di normali e maligne CRC prostata, piastre di coltura così 6 e gli inserti del filtro. Terreni di coltura cellulare condizionati dalle cellule J2 ¹¹ è posto nei media da camera e della prostata differenziazione di fondo nella camera superiore. Le tecniche descritte nel presente documento supportano la differenziazione delle cellule della prostata luminale entro una settimana 2 lasso di tempo, in linea con gli obiettivi della medicina personalizzata. Era inoltre indispensabile sviluppare le metodologie che consentono la profilatura molecolare, genetica e cellulare completa delle culture. Approcci per isolare DNA, RNA e proteine ​​da cellule rilasciate dalla superficie del filtro sono stati sviluppati e semplificato per l'elaborazione del campione accurata ripetizione. Finally, la metodologia necessaria per la rimozione del filtro per consentire incorporamento, sezionamento e per H & E, immunoistochimica e immunofluorescenza colorazione, è completamente descritto.

Protocollo

1. Istituzione del Cell 3D cultura sistema di inserimento

1. Posizionare inserti colture cellulari 2 policarbonato in un orientamento invertita (lato filtro verso l'alto) verso il basso in un piatto ben 6 (Figura 1A).
2. Applicare uno strato sottile di 0,1% di gelatina in acqua al lato inferiore dell'inserto e lasciare asciugare (10-20 min) in una cappa di sicurezza biologica per mantenere la sterilità.
3. Ripetere passaggio 1.2 altre due volte per un totale di 3 applicazioni di 0,1% di gelatina sugli inserti.
   NOTA: Il rivestimento di gelatina aiuterà diffusione limite tra le camere.
4. Per raccogliere i CRC primari da condizioni di coltura standard, aggiungere 5 ml di PBS per lavare il pallone di coltura.
   1. Trypsinize le cellule utilizzando (1 mL per un T-25 e 2 mL di T-75) 0,25% tripsina-EDTA per 5 min a 37 ° C. toccare delicatamente il lato del pallone per aiutare a sloggiare le cellule. Quindi procedere per bloccare la reazione tripsina e raccogliere le cellule con l'aggiunta di 5 ml di DMEM completo.
   2. Raccogliere le cellule in una provetta da 15 ml. Centrifugare la provetta a 4 ° C e 188 XG e contare utilizzando un contatore di cellule automatico o un emocitometro.
   3. Risospendere 600.000 CRC in 250 microlitri mezzi (CM) condizionati e aggiungere alla correttamente orientata (lato del filtro verso il basso) la cultura inserto (Figura 1B). Questo è indicato come la camera interna.
      Nota: CM è F-mezzi condizionati dalle cellule irradiate J2 e contiene 10 micron Y-27632 come precedentemente descritto ^{7, 8, 9, 11.}
5. Applicare 2 ml di CM alla camera esterna del 6 pozzetti e incubare a 37 ° C per una notte (per almeno 18 h).
6. Rimuovere accuratamente il CM sulla camera interna con un 1 mL o 200 microlitri pipetta e aggiungere lentamente supporti differenziamento (DM) alla camera interna con una mL pipetta 1 fino completa. Fare attenzione a non disturbare lo strato di cellule.

Le "> 2. Manutenzione delle Culture 3D

1. Controllare le culture ogni giorno. Le cellule sane appaiono come mostrato in Figura 2.
2. Modificare il CM nella camera esterna ogni giorno o ogni altro giorno a seconda del metabolismo delle cellule.
3. Quando i media del interiore cambia colore da camera (giallo), rimuovere con attenzione i media sulla camera di filtro interno con un 1 mL o 200 microlitri pipetta.
4. Aspirare il supporto nel esterna 6 ben camera di piatto con una punta di aspirazione.
5. Usando una pipetta 1 ml, applicare lentamente DM fresco alla camera interna fino al completo. Fare attenzione a non graffiare o altrimenti rimuovere lo strato di cellule.
6. Sostituire i media nella camera esterna con 2 ml di CM fresco.
7. Mantenere le culture per 2 settimane, e quindi procedere al trattamento per l'isolamento bimolecular desiderato.
   NOTA: Ogni riga nella piastra 6 bene, un totale di sei inserti (Figura 1B), dovrebbe essere processato per esperimento per acquisire abbastanza cellule per DNA, RNA o proteine ​​per l'analisi.
8. mezzi Aspirare nella camera esterna e risciacquare con 2 ml di tampone fosfato salino (PBS).
9. Rimuovere con attenzione dei media dalla camera interna con un 1 mL o 200 microlitri pipetta e aggiungere 500 microlitri di PBS. Evitare di raschiare o comunque disturbare le cellule sulla membrana.
10. Aspirare PBS dalla camera esterna e trasferire PBS dalla camera interna con un 1 mL o 200 microlitri pipetta. Una volta che il PBS è stato rimosso, procedere direttamente alla applicazione appropriata descritto di seguito. Non lasciare che la membrana si asciughi. La coltura può essere mantenuto brevemente in PBS finché l'applicazione è pronto per iniziare.

3. L'elaborazione dei Filtri per Pellet Banking

1. Aggiungere 100 microlitri 0,25% tripsina-EDTA per ogni camera interna e incubare per 5 min a 37 ° C.
2. In breve e con attenzione agitano / raschiare le cellule sulla superficie della membrana con una pipetta 200 microlitri mentre pipettando su e giù (evitare puncturing la membrana). Incubare per 1 min a 37 ° C.
3. Aggiungere 250 ml di CM alla prima camera interna e pipetta su e giù delicatamente per lavare il filtro.
4. Trasferimento risospesa celle alla camera del filtro adiacente che contiene le stesse condizioni di media e ripetere pipettando su e giù.
5. Ripetere questa procedura per ciascuno di detti inserti di un'unica condizione. Raccogliere e trasferire le cellule in una provetta da 1,5 centrifuga.
6. Lavare ogni camera interna con un ulteriore 100-200 ml di CM per raccogliere tutte le cellule rimanenti. Aggiungere alla provetta da 1,5 mL centrifuga nel passaggio 3.5.
7. Spin le cellule a 423 xg in una microcentrifuga a 4 ° C per 5 min.
8. Aspirare il surnatante e lavare il pellet di cellule una volta con 1000 ml di PBS.
9. Spin nuovo a 423 xg in una microcentrifuga a 4 ° C per 5 min.
10. Aspirare PBS e congelamento a -80 ° C per un uso successivo.

4. L'elaborazione dei Filtri per RNA o DNA Isolation

1. Aggiungere 200 microlitri di guanidinio tiocianato-fenolo-cloroformio o reagente simile estrazione alla camera interna e agitare brevemente le cellule sulla superficie della membrana pipettando su e giù.
2. Incubare nel reagente di estrazione per 5 min a temperatura ambiente con la camera esterna asciutta.
   1. Poiché il filtro può dissociarsi dal dell'inserto, lavare la membrana del filtro dissociato pipettando la soluzione di estrazione su e giù. Raccogliere quanto più del reagente di estrazione possibile inclinando la piastra ben 6 ed aspirando il liquido residuo.
3. Seguire il protocollo del produttore per la purificazione e il recupero di DNA, RNA o proteine.

5. L'elaborazione dei Filtri per l'isolamento delle proteine

1. Posizionare la cartuccia del filtro nella piastra 6 bene su ghiaccio. Per la camera interna, aggiungere 10 ml di tampone proteine ​​lisi integrato con 1 fluoruro di sodio mM (NaF), 1 mM di sodio vanadato (NAV), 100 mM dithiothreitol (DTT) e 100 ml di cocktail di anti-proteasi.
2. Agitare / raschiare le cellule sulla superficie della membrana con una pipetta 20 ml mentre pipettando su e giù. Evitare di generare bolle nel tampone di lisi.
3. Incubare la piastra 6 bene con cartucce filtranti in ghiaccio per 10 min.
4. Ripetere raschiatura e quindi risciacquare la superficie della membrana con il tampone di lisi.
5. Raccogliere i lisati dai 6 inserti e trasferire in una provetta da 1,5 ml centrifuga sul ghiaccio.
6. Risciacquare la prima membrana con altri 10 ml di tampone di lisi e trasferimento al filtro successivo.
7. Ripetere il passaggio 5.6 per tutti gli inserti, la raccolta di qualsiasi soluzione tampone di lisi residuo e aggiungere al 1,5 ml di tubo (passo 5,5).
8. Incubare il campione in ghiaccio per un ulteriore 5 min.
9. Spin alla massima velocità (16.873 xg in una centrifuga da tavolo) per 15 min a 4 ° C.
10. Pipetta lisato surnatante in una nuova provetta da 1,5 ml.
11. Procedere all'analisi di concentrazione di proteine ​​o store lisati a -80 ° C.

6. elaborazione per H & E e Immuno-colorazione

1. Aggiungere 500 microlitri e 1 ml di 10% NBF (formalina neutra tamponata) alla camera interna ed esterna e lasciate incubare una notte a 4 ° C.
2. Aspirare il NBF dalla camera esterna e aggiungere 1 ml di agarosio idrossietil (HEA) l'elaborazione di gel per un mL centrifuga 1.5. Lentamente sciogliere l'agarosio in un forno a microonde con bassa potenza e ripetuto 10-20 s impulsi fino a quando l'agarosio è sciolto.
3. Tenere il HEA in un bagno caldo a 37 ° C per evitare la solidificazione fino al momento dell'uso.
4. Rimuovere il NBF dalla camera interna e applicare 25 ml di HEA fusa alla camera interna e consentire l'agarosio solidificare per 2-5 min.
5. Wet 2 schiuma pastiglie istologia a 10% NBF e mettere un pad in una cassetta embedding (vedi Figura 3D).
6. Utilizzare un # 11 bisturi (che ha una lama a punta fine molto forte) di segnare il filtro dal lato inferiore dell'insertocamera, parzialmente svincolandola dalla camera inserto in plastica.
7. Mettere una piccola quantità (100-200 ml) di NBF in una capsula di Petri e immergere il filtro parzialmente sloggiato nel NBF (Figura 3A).
8. Con # 10 bisturi, premere delicatamente contro il centro del filtro, dall'interno della camera di inserto, per rimuovere completamente il filtro dal inserto barilotto (Figura 3B). Se non vi è alcuna parte del filtro che è ancora attaccato alla canna, tagliare con il bisturi.
9. Tagliare il filtro HEA rivestita a metà con il # 10 bisturi lama (Figura 3C).
10. Disporre ciascuna metà del filtro sul tappetino in gomma nella cassetta istologia preparato al punto 6.4 (Figura 3D).
11. Aggiungere il secondo il 10% NBF spugna imbevuta alla cassetta, sandwich il filtro.
12. Snap sigillare la cassetta, posto in NBF, e incubare durante la notte.
13. filtri di processo in blocchi di paraffina per il sezionamento e la colorazione comedescritto in precedenza ^12.

Risultati

Il sistema basato su inserto coltura cellulare è una procedura relativamente semplice e rapida per la produzione di colture 3D di CRC prostata che supporta la differenziazione delle cellule del lume. Uno schema del sistema è mostrato (Figura 1A) evidenziando l'applicazione del rivestimento di gelatina alla superficie inferiore della cartuccia filtrante. Gli inserti sono ribaltati solo per l'applicazione della gelatina. Nella Figura 1B i filtri ...

Discussione

linee cellulari primarie sono una piattaforma importante e in rapido sviluppo per la ricerca sul cancro. Il sistema di coltura 3D basato su inserto cultura sostiene la differenziazione della prostata CRC primari entro un lasso di tempo di due settimane. Il metodo del filtro CRC rappresenta un nuovo metodo di media produttività per la ricerca della prostata. Esistenti modelli del mouse PDX sono in termini di tempo ed estremamente costoso, e molti dei campioni PDX non possono essere coltivate in cultura, limitando la spe...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Corning Costar Snapwell Culture Inserts	Corning	3801
Millicell Cell Culture Inserts	Millipore	PIHP01250
Multiwell 6 Well	Falcon	353046
Gelatin 0.1% in water	Stemcell Technologies	7903
Sterile Saftey Scapel 10 Blade	Integra Miltex	4-510
Sterile Standard Scalpel 11 Blade	Integra Miltex	4411
RIPA Lysis and Extraction Buffer	Thermofisher Scientific	89900
Sodium Fluoride	Fishcer Scientific	S299-100
Sodium Vanadate	Fishcer Scientific	13721-39-6
Dithiothreitol	Sigma-Aldrich	3483123
Protease Inhibitor Cocktail (AEBSF, Aprotinin, Bestatin, E-64, Leupeptin and Pepstatin A)	Sigma-Aldrich	P8340
0.25% Trypsin-EDTA (1x)	Thermofisher Scientific	25200-056
DMEM	Thermofisher Scientific	11965-092
FBS	Sigma-Aldrich	F2442
Glutamine	Thermofisher Scientific	25030081
Penicillin Streptomycin	Thermofisher Scientific	15140-122
F-12 Nutrient Mix Media	Thermofisher Scientific	11765054
Y-27632 dihydrochloride Rock inhibitor	Enzo	ALX-270-333-M025
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H0888
EGF	Thermofisher Scientific	PHG0315
Insulin	Thermofisher Scientific	12585-014
Cholera Toxin	Sigma-Aldrich	C3012
Gentamicin	Thermofisher Scientific	15710-064
Fungizone	Fisher Scientific	BP264550
Trizol Reagent	Invitrogen	15596026
Histogel Specimen Processing Gel (hydroxyethyl agarose (HEA))	Thermo Scientific	HG-4000-012
Non-Adherent Dressing	Telfa	KDL2132Z
Cell Culture Dish	Sigma	SIAL0167
HISTOSETTE II Tissue Processing / Embedding Cassettes	Crystalgen	CG-M492