Un sistema de cultivo en 3D basado en Insertar rápido de filtro para la próstata primario Diferenciación Celular

Resumen

Here, we present a method for the establishment of a rapid in vitro system that supports the three dimensional culturing and subsequent luminal differentiation of primary prostate epithelial cells.

Resumen

Las células reprogramadas condicionalmente (CRC) proporcionan un método sostenible para el cultivo celular primario y la capacidad de desarrollar extensos bancos de datos genéticos "vivos" de las líneas celulares derivadas del paciente. Para muchos tipos de células epiteliales, varios tres enfoques (3D) de cultivo dimensionales se han descrito que apoyan un estado diferenciado mejorado. Mientras CRCs conservan su compromiso de linaje en el tejido de la que son aislados, no logran expresar muchos de los marcadores de diferenciación asociados al tejido de origen cuando se cultivan bajo dos condiciones dimensional (2D) de cultivo normales. Para mejorar la aplicación de CRC pacientes derivados de la investigación del cáncer de próstata, un formato 3D cultura se ha definido que permite una diferenciación celular rápida (2 semanas en total) luminal tanto en las células epiteliales normales de la próstata y derivados del tumor. En este documento, un formato basado en inserto de filtro se describe para el cultivo y la diferenciación de los dos CRCs normales y malignos de próstata. Una dese proporcionan cola Descripción de los procedimientos requeridos para la recolección de células y procesamiento para la tinción inmunohistoquímica y de inmunofluorescencia. En conjunto el formato de la cultura 3D descrito, combinado con las líneas primarias de CRC, proporciona un medio importante para resaltar sistema de modelo de rendimiento para la investigación de próstata basada en muestras biológicas.

Introducción

La identificación y el uso de terapias contra el cáncer que se personalizan a los individuos son un objetivo principal en la investigación del cáncer. Recientemente, nuevos enfoques han sido desarrollados que permiten una mayor facilidad en el establecimiento de cultivos de células primarias, proporcionando potencialmente formas tanto de identificar y probar terapias personalizadas. Por ejemplo, la próstata basado en la R-espondina enfoque organoide ¹ permite para el cultivo en tres dimensiones (3D) de las células normales y metastásicas de cáncer de próstata en una matriz extracelular comercial (por ejemplo, Matrigel), mientras que el Condicionalmente reprogramación de células método (CRC) desarrollado en Georgetown ^{2, 3} utiliza más condiciones de cultivo 2D estándar. Específicamente, la combinación de un inhibidor de la cinasa Rho (Y-27632) y células alimentadoras de fibroblastos murinos J2 irradiados conducen al cultivo indefinido de CRCs de queratinocitos ^2. La metodología es CRCextremadamente robusto, con líneas de células primarias establecidas y mantenidas indefinidamente de la próstata y muchos otros tejidos epiteliales normales y malignos ³ con éxito. Es importante destacar que, nuestra tecnología CRC permitió la rápida identificación de la base etiológica de la papilomatosis respiratoria recurrente en un paciente que había fallado un número de tratamientos con fármacos anteriores. Además, el uso de los CRC normales y derivados del tumor, la identificación con éxito de un fármaco aprobado por la FDA, vorinostat, se hizo dos semanas después de la biopsia de tejido inicial. El paciente fue colocado en vorinostat, lo que resulta en el éxito del tratamiento de la enfermedad ^4.

La glándula de la próstata normal se compone de luminal, basal y las células neuroendocrinas raros ^5. células luminales forman la capa epitelial columnar de la glándula y expresan el receptor de andrógenos (AR), así como otros marcadores luminales tales como citoqueratinas 8 y 18 y proantígeno específico de estado (PSA) ^6. Por el contrario, las células basales se localizan debajo de la capa luminal y expresan citoqueratina 5 y p63, pero los niveles bajos de la AR ^5. Nos ^{7, 8, 9} y otros ¹⁰ han utilizado con éxito los CRC de próstata en las investigaciones mecanicistas sensibilidad a los fármacos preclínicos. Sin embargo, cuando se cultivan bajo condiciones estándar de cultivo de tejidos 2D, estas células no totalmente acoplan AR señalización ^10. Es importante destacar que, cuando se coloca debajo de la cápsula renal de ratones inmunodeficientes, los CRC recuperó próstata arquitectura y la función glandular normal, lo que indica que CRCs de próstata conservan su compromiso de linaje cuando se coloca en un ambiente permisivo. El desarrollo del sistema de cultivo celular a base de inserto de filtro aquí descrito permite la rápida (2 semanas) la diferenciación in vitro de CRC de la próstata como lo demuestra by el aumento de la expresión de los genes diana Ar y Ar, así como disminución de los niveles de p63.

Los elementos filtrantes utilizados contienen membranas de policarbonato (tamaño de poro, 0,4 micras) que pueden apoyar el cultivo de células de mamíferos. El sistema, como se desarrolló, hace uso de CRCs de próstata normales y malignas, placas de cultivo de 6 pocillos y los insertos de filtro. Medios de cultivo celular acondicionado por células J2 ¹¹ se coloca en los medios de cámara y de próstata diferenciadores de fondo en la cámara superior. Las técnicas descritas en el presente documento apoyan la diferenciación de células de próstata luminal a menos de 2 semanas de duración, en consonancia con los objetivos de la medicina personalizada. También era imperativo desarrollar las metodologías que permitan el perfilado molecular, genética y celular completa de las culturas. Enfoques para el aislamiento de ADN, ARN y proteínas a partir de células liberadas de la superficie del filtro se han desarrollado y simplificado para el procesamiento de muestras exacta repetición. Finally, la metodología necesaria para retirar el filtro para permitir la incrustación, el corte y para H & E, inmunohistoquímica y tinción de inmunofluorescencia, se describe completamente.

Protocolo

1. Establecimiento de la célula 3D Sistema de cultivo Insertar

1. Coloque 2 policarbonato insertos de cultivo celular en una orientación invertida (lado del filtro hacia arriba) en una placa de 6 pocillos (Figura 1A).
2. Aplicar una capa delgada de 0,1% de gelatina en agua a la parte inferior de la pieza de inserción y dejar secar (10-20 min) en una cabina de seguridad biológica para mantener la esterilidad.
3. Repita el paso 1.2 dos veces más para un total de 3 aplicaciones de gelatina al 0,1% en los insertos.
   NOTA: El recubrimiento de gelatina ayudará a la difusión límite entre las cámaras.
4. Para recoger los CRC primarias de condiciones de cultivo estándar, añadir 5 ml de PBS para lavar el frasco de cultivo.
   1. Tripsinizar las células utilizando (1 ml para un T-25 y 2 ml de una T-75) 0,25% de tripsina-EDTA durante 5 min a 37 ° C. Golpear suavemente el lateral del matraz para ayudar a desalojar las células. A continuación, proceder para detener la reacción tripsina y recoger las células mediante la adición de 5 ml de DMEM completo.
   2. Recoger las células en un tubo de 15 ml. Centrifugar el tubo a 4 ° C y 188 xg y contar utilizando un contador de células automatizado o un hemocitómetro.
   3. Vuelva a suspender 600.000 CRC en 250 l de medios (CM) acondicionado y añadir a la inserción de cultivo orientada correctamente (lado del filtro hacia abajo) (Figura 1B). Esto se conoce como la cámara interior.
      Nota: CM es F-medio condicionado por células J2 irradiados y contiene 10 micras Y-27632 como se describió previamente ^{7, 8, 9, 11.}
5. Aplicar 2 ml de CM a la cámara exterior de la placa de 6 pocillos y se incuba a 37 ° C durante la noche (durante al menos 18 h).
6. Retire cuidadosamente la CM en la cámara interior con un 1 ml o pipeta 200 l y se añade lentamente medio de diferenciación (DM) a la cámara interior con una pipeta de 1 ml hasta completa. Tenga cuidado de no perturbar la capa de células.

Le "> 2. Mantenimiento de las Culturas 3D

1. Compruebe las culturas cada día. Las células sanas aparecen como se muestra en la Figura 2.
2. Cambiar el CM en la cámara exterior cada día o cada dos días dependiendo de la metabolismo de las células.
3. Cuando los medios de comunicación de la cámara cambia de color interior (amarillo), retire con cuidado los medios de comunicación en la cámara de filtro interior con un 1 ml o 200 l pipeta.
4. Aspirar los medios de comunicación en el pozo cámara de placa exterior 6 con una punta de aspiración.
5. Usando una pipeta de 1 ml, aplicar lentamente MS nueva a la cámara interior hasta que se llene. Tenga cuidado de no raspar o de otro modo desalojar a la capa de células.
6. Vuelva a colocar los medios de comunicación en la cámara exterior con 2 ml de CM fresco.
7. Mantener los cultivos durante 2 semanas, y luego proceder a la transformación para el aislamiento bimolecular deseada.
   NOTA: Cada fila de la placa de 6 pocillos, un total de seis inserciones (Figura 1B), debe ser procesado por experimento para adquirir suficientes células para DNA, ARN o proteína para el análisis.
8. Aspirar los medios de comunicación en la cámara exterior y enjuague con 2 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS).
9. Retirar con cuidado los medios de comunicación de la cámara interior con un 1 ml o 200 l pipeta y añadir 500 l de PBS. Evitar raspando o de otra manera perturbar las células de la membrana.
10. Aspirar PBS de la cámara exterior y con cuidado eliminar PBS de la cámara interior con un 1 ml o 200 l pipeta. Una vez que el PBS se ha eliminado, proceder directamente a la aplicación correspondiente se detalla a continuación. No permita que la membrana se seque. El cultivo puede mantenerse brevemente en el PBS hasta que la aplicación está listo para comenzar.

3. Tratamiento de los filtros para Pellet Banca

1. Añadir 100 ml 0,25% de tripsina-EDTA a cada cámara interior y se incuba durante 5 min a 37 ° C.
2. Brevemente y cuidadosamente agitan / raspan las células de la superficie de la membrana con una pipeta de 200 l mientras pipeteando arriba y abajo (evitar puncturing la membrana). Incubar durante 1 min a 37 ° C.
3. Añadir 250 l de CM a la primera cámara interior y la pipeta hacia arriba y abajo con suavidad para enjuagar el filtro.
4. Transferencia de células resuspendidas a la cámara de filtro adyacente que contiene las mismas condiciones de los medios y repetir pipeteando arriba y abajo.
5. Repita este procedimiento para cada una de las inserciones de una sola condición. Recoger y transferir las células a un tubo de centrífuga de 1,5 ml.
6. Enjuague cada cámara interior con un 100-200 l adicional de CM para recoger cualquier resto de las células. Añadir al tubo de centrífuga de 1,5 ml en el paso 3.5.
7. Girar las células a 423 xg en una microcentrífuga a 4 ° C durante 5 min.
8. Aspirar el sobrenadante y se lava el sedimento celular una vez con 1000 l de PBS.
9. Girar de nuevo a 423 xg en una microcentrífuga a 4 ° C durante 5 min.
10. Aspirar el PBS y se congelan a -80 ° C para su uso posterior.

4. Tratamiento de los filtros para el ARN o ADN Aislamiento

1. Añadir 200 l de tiocianato de guanidinio-fenol-cloroformo o reactivo de extracción similar a la cámara interior y agitar brevemente las células en la superficie de la membrana pipeteando arriba y abajo.
2. Incubar en el reactivo de extracción de 5 min a temperatura ambiente con el exterior seco cámara.
   1. A medida que el filtro puede disociar de la pieza de inserción, lavar la membrana del filtro disociado pipeteando la solución de extracción arriba y abajo. Recoger la mayor cantidad de reactivo de extracción como sea posible por la inclinación de la placa de 6 pocillos y aspirar cualquier líquido residual.
3. Siga el protocolo del fabricante para la purificación y la recuperación de ADN, ARN o proteína.

5. Tratamiento de los filtros para el aislamiento de proteínas

1. Coloque el inserto de filtro en la placa de 6 pocillos en hielo. Para la cámara interior, añadir 10 l de tampón de lisis de proteína suplementado con fluoruro de 1 mM de sodio (NaF), 1 mM de vanadato de sodio (NAV), dithiothre 100 mMitol (TDT) y 100 l de cóctel anti-proteasa.
2. Agitar / raspar las células de la superficie de la membrana con una pipeta de 20 l mientras pipeteando arriba y abajo. Evitar la generación de burbujas en el tampón de lisis.
3. Incubar la placa de 6 pocillos con insertos de filtro en hielo durante 10 min.
4. Repetir el raspado y, a continuación enjuagar la superficie de la membrana con el tampón de lisis.
5. Recoge los lisados ​​de las inserciones 6 y transferir a un tubo de centrífuga de 1,5 ml en hielo.
6. Enjuague la primera membrana con un 10 l adicionales de tampón de lisis y la transferencia al siguiente filtro.
7. Repita el paso 5.6 para todas las inserciones, recogiendo cualquier solución tampón de lisis residual y añadir al tubo de 1,5 ml (paso 5.5).
8. Incubar la muestra en hielo durante 5 min más.
9. Giro a la máxima velocidad (16.873 xg en una centrífuga de mesa) durante 15 min a 4 ° C.
10. Pipeta lisado sobrenadante a un tubo nuevo de 1,5 ml.
11. Procederá al análisis de la concentración de proteína o store lisados ​​a -80 ° C.

6. Proceso de H & E y Inmuno-tinción

1. Añadir 500 l y 1 ml de 10% NBF (formalina tamponada neutra) a la cámara interior y exterior y dejar incubar durante la noche a 4 ° C.
2. Aspirar el MNB de la cámara exterior y se añade 1 ml de agarosa de hidroxietilo (HEA) procesar gel a una centrífuga de 1,5 ml. fundir la agarosa lentamente en un horno de microondas usando baja potencia y repetida 10-20 s pulsos hasta que se derrita la agarosa.
3. Mantenga la HEA en un baño caliente de 37 ° C para evitar la solidificación hasta que esté listo para su uso.
4. Retire el NBF de la cámara interior y aplicar 25 l de HEA fundido a la cámara interior y permitir que la agarosa solidifique durante 2-5 min.
5. Húmedos almohadillas de espuma de histología 2 en NBF al 10% y coloca una almohadilla en un casete de incrustación (ver Figura 3D).
6. Utilizar un bisturí # 11 de la hoja (que tienen una pala de punta fina muy afilada) para anotar el filtro desde el lado inferior del insertocámara, liberando parcialmente de la cámara de inserción de plástico.
7. Coloque una pequeña cantidad (100-200 l) de NBF en una placa de Petri y sumergir el filtro parcialmente desalojado en el NBF (Figura 3A).
8. Con un escalpelo cuchilla # 10, presionar suavemente contra el medio del filtro, desde el interior de la cámara de inserción, para desalojar totalmente el filtro de la barrica de inserción (Figura 3B). Si hay alguna parte del filtro que todavía está unido al barril, cortar con el bisturí.
9. Cortar el filtro recubierto de HEA en un medio con el # 10 bisturí de hoja (Figura 3C).
10. Coloque cada medio del filtro sobre la almohadilla de espuma en el casete de histología preparado en la etapa 6.4 (Figura 3D).
11. Añadir el segundo NBF esponja empapada 10% a la casete, intercalando el filtro.
12. Snap sellar el casete, lugar en NBF, e incubar durante la noche.
13. filtros de proceso en bloques de parafina para el seccionamiento y tinción comodescrito previamente ^12.

Resultados

El sistema basado en el cultivo de células de inserción es un procedimiento relativamente simple y rápido para la producción de los cultivos 3D de CRCs de próstata que apoya la diferenciación de células luminal. Un esquema del sistema se muestra (Figura 1A) poner de relieve la aplicación del recubrimiento de gelatina a la superficie inferior del inserto de filtro. Los insertos solamente se vuelcan para la aplicación de la gelatina. En la Figura 1B

Discusión

líneas de células primarias son una plataforma importante y rápido desarrollo de la investigación del cáncer. El sistema de cultivo basado en 3d inserción de cultivo apoya la diferenciación de los CRC próstata primarios dentro de un plazo de dos semanas. El método del filtro CRC representa un nuevo método, el rendimiento medio para la investigación de próstata. modelos PDX ratón existentes consumen tiempo y son extremadamente caros, y muchas de las muestras de PDX no pueden crecer en cultivo, lo que limita ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Corning Costar Snapwell Culture Inserts	Corning	3801
Millicell Cell Culture Inserts	Millipore	PIHP01250
Multiwell 6 Well	Falcon	353046
Gelatin 0.1% in water	Stemcell Technologies	7903
Sterile Saftey Scapel 10 Blade	Integra Miltex	4-510
Sterile Standard Scalpel 11 Blade	Integra Miltex	4411
RIPA Lysis and Extraction Buffer	Thermofisher Scientific	89900
Sodium Fluoride	Fishcer Scientific	S299-100
Sodium Vanadate	Fishcer Scientific	13721-39-6
Dithiothreitol	Sigma-Aldrich	3483123
Protease Inhibitor Cocktail (AEBSF, Aprotinin, Bestatin, E-64, Leupeptin and Pepstatin A)	Sigma-Aldrich	P8340
0.25% Trypsin-EDTA (1x)	Thermofisher Scientific	25200-056
DMEM	Thermofisher Scientific	11965-092
FBS	Sigma-Aldrich	F2442
Glutamine	Thermofisher Scientific	25030081
Penicillin Streptomycin	Thermofisher Scientific	15140-122
F-12 Nutrient Mix Media	Thermofisher Scientific	11765054
Y-27632 dihydrochloride Rock inhibitor	Enzo	ALX-270-333-M025
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H0888
EGF	Thermofisher Scientific	PHG0315
Insulin	Thermofisher Scientific	12585-014
Cholera Toxin	Sigma-Aldrich	C3012
Gentamicin	Thermofisher Scientific	15710-064
Fungizone	Fisher Scientific	BP264550
Trizol Reagent	Invitrogen	15596026
Histogel Specimen Processing Gel (hydroxyethyl agarose (HEA))	Thermo Scientific	HG-4000-012
Non-Adherent Dressing	Telfa	KDL2132Z
Cell Culture Dish	Sigma	SIAL0167
HISTOSETTE II Tissue Processing / Embedding Cassettes	Crystalgen	CG-M492