מסנן ראפיד הכנס מבוססת מערכת 3D תרבות התמיינות תאי ערמונית ראשית

Summary

Here, we present a method for the establishment of a rapid in vitro system that supports the three dimensional culturing and subsequent luminal differentiation of primary prostate epithelial cells.

Abstract

תאים לתכנות מחדש מותנה (CRCs) לספק שיטת קיימא עבור תרבית תאים ראשונית ואת היכולת לפתח "biobanks חיים" הנרחב של שורות תאים שמקורם בחולה. עבור סוגים רבים של תאי אפיתל, שונות תלת ממדים (3D) גישות התרבות תואר התומכים מדינת בדיל השתפרה. בעוד CRCs לשמור מחויבות השושלת שלהם לרקמה שממנו הם מבודדים, הם לא מצליחים לבטא רבים של סמנים בידול הקשורים רקמות ממוצא כאשר גדל תחת נורמלי שני התנאים תרבות מימדי (2D). כדי לשפר את היישום של CRCs נגזרות החולות למחקר סרטן הערמונית, פורמט תרבות 3D הוגדר המאפשר בידול תא מהיר (2 שבועות סה"כ) לומינל בשני נורמלי גידולים שמקורם בתאי האפיתל ערמונית. בזאת, פורמט מבוסס כנס מסנן מתואר עבור culturing וההבחנה של שני CRCs ערמונית הנורמלי וממאירים. דהתיאור זנב של ההליכים הנדרשים לצורך איסוף תאים ועיבוד מכתים immunohistochemical ו immunofluorescent מסופקים. קולקטיבי בפורמט תרבות 3D תאר, בשילוב עם קווי CRC העיקריים, מספק בינוני חשוב גבוהה מערכת מודל תפוקה למחקר ערמונית מבוססת biospecimen.

Introduction

זיהוי והשימוש של טיפולים בסרטן שמותאם אנשים הם יעד מרכזי בחקר הסרטן. לאחרונה, גישות חדשות פותחו המאפשרות ביתר קל בהקמה בתרביות תאים ראשוניות, פוטנציאל לספק דרכים של שניהם זיהוי ובדיקת טיפולים אישית. לדוגמא, הערמונית מבוססת R-spondin גישת organoid ¹ מאפשרת תלת ממדי (3D) culturing של תאי סרטן הערמונית נורמלים גרורתי בתוך תאי מטריקס מסחריים (למשל, Matrigel), בעוד Reprogramming המותנה של תאים (CRC) שיטה ² שפותח ^{בג'ורג'טאון, 3} מנצל תנאי תרבות 2D סטנדרטיים יותר. באופן ספציפי, השילוב של מעכבי קינאז Rho (Y-27632) ותאי מזין פיברובלסטים murine J2 מוקרן להוביל culturing בלתי מוגדר של CRCs keratinocyte ^2. המתודולוגיה CRC היאמאוד חזק, עם שורות תאים ראשוניות הוקמו בהצלחה ומתוחזק ללא הגבלה זמן מהערמונית ורקמות אפיתל רגילות וממאירים רבים אחרות ^3. חשוב לציין, טכנולוגית CRC שלנו מוותר עבור זיהוי המהיר של הבסיס אטיולוגי עבור papillomatosis נשימתיים חוזר אצל חולה אשר נכשל מספר הטיפולים התרופתיים קודמים. בנוסף, באמצעות CRCs נורמלי הנגזרות הגידול, זיהוי מוצלח של ה- FDA אישר תרופה, vorinostat, נעשתה תוך שבועיים מיום ביופסיה רקמות הראשונית. החולה הונח על vorinostat, וכתוצאה מכך הטיפול המוצלח של המחלה שלהם ^4.

בלוטת הערמונית הנורמלית מורכבת הלומינל, הבזליים ותאי נוירואנדוקריניים הנדירים ^5. תאי לומינל מהווים את שכבת האפיתל העמודים של הבלוטה ולהביע לקולטן האנדרוגן (AR), כמו גם סמנים לומינל אחרים כגון cytokeratins 8 ו -18 ופרוהמדינה אנטיגן ספציפי (PSA) ^6. לעומת זאת, תאי הבזליים הם נקודות מתחת לשכבת לומינל ולהביע cytokeratin 5 ו p63, אבל רמות נמוכות של AR ^5. אנחנו ^{7, 8, 9} ואחרים ¹⁰ השתמשו בהצלחה CRCs הערמונית בחקירות רגישות לתרופה מכניסטית פרה-קליניים. עם זאת, כאשר גדל בתנאים בתרבית רקמה 2D רגיל, תאים אלה אינם לגמרי לעסוק AR איתות ^10. חשוב לציין, כאשר הניח תחת הקפסולה הכליות של עכברי immunodeficient, את CRCs שהעלה אדריכלות בלוטות נורמלית ערמונית ותפקוד מציין CRCs הערמונית לשמור שושלת מחויבותם כאשר הניח סביבת מתירנית. ההתפתחות של מסנן מערכת תרבית תאים להכניס המבוססת המתואר כאן מאפשרת המהירים (2 שבועות) במבחנת בידול של CRCs ערמונית כמו ב שמעידy הביטוי המוגבר של גני מטרת AR ו AR וכן הירידה ברמות של p63.

המחדיר המסנן הנמצא מכיל ממברנות פוליקרבונט (גודל נקבובי, 0.4 מיקרומטר) שיכול לתמוך culturing של בתאי יונקים. המערכת, שפותחה על, עושה שימוש CRCs ערמונית נורמלי וממאירים, 6 מנות תרבות היטב המחדירה המסנן. תרבית תאי תקשורת מותנית תאי J2 ¹¹ מושם בתקשורת ההבחנה קאמרית ערמונית התחתונה בתא העליון. הטכניקות המתוארות במסמך זה לתמוך התמיינות תאים luminal הערמונית בתוך פרק זמן 2 בשבוע, עולה בקנה אחד עם המטרות של רפואה אישית. זה היה גם הכרחי כדי לפתח מתודולוגיות המאפשרים פרופיל מולקולרי, גנטי ותאי המקיף של התרבויות. גישות לבידוד DNA, RNA וחלבון מתאי שוחרר מפני השטח המסנן פותחו יעיל לעיבוד מדגם חוזר מדויקת. פינהlly, המתודולוגיה הנדרשת להסרת המסנן כדי לאפשר הטמעה, חתך עבור H & E, immunohistochemical מכתים immunofluorescent, מתואר באופן מלא.

Protocol

1. הקמת תא 3D תרבות כנס מערכת

1. מניחים 2 מוסיף תרבית תאים פוליקרבונט אוריינטציה הפוכה (צד מסנן למעלה) מטה (איור 1 א) 6 גם צלחת.
2. למרוח שכבה דקה של ג'לטין 0.1% במים אל הצד התחתון של הכנס ולאפשר לו להתייבש (10-20 דקות) בתוך ארון בטיחות ביולוגית כדי לשמור על סטריליות.
3. חזור על שלב 1.2 פעמים נוספות עבור סכום כולל של 3 בקשות של ג'לטין 0.1% על ההכנסות.
   הערה: ציפוי ג'לטין יעזור דיפוזיה גבול בין התאים.
4. כדי לאסוף את CRCs העיקרי מתנאים תרבות סטנדרטי, להוסיף 5 מ"ל של PBS לשטוף את הבקבוק תרבות.
   1. Trypsinize את התאים באמצעות (1 מ"ל עבור T-25 ו -2 מ"ל עבור T-75) 0.25% טריפסין- EDTA במשך 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. לטפוח בעדינות את הצד של הבקבוק כדי לסייע פירוק התאים. ואז להמשיך לעצור את תגובת טריפסין ולאסוף את התאים על ידי הוספת 5 מיליליטר של DMEM המלא.
   2. לאסוף התאים בתוך שפופרת 15 מ"ל. צנטריפוגה הצינור ב 4 ° C ו 188 XG ולספור באמצעות דלפק תא אוטומטי או hemocytometer.
   3. Re- להשעות 600,000 CRCs ב 250 μL מותנה תקשורת (CM) ולהוסיף את כנס התרבות בכיוון הנכון (מסנן בצד למטה) (איור 1 ב). זה נקרא החדר הפנימי.
      הערה: CM הוא F-מדיה מותנית תאי J2 מוקרנים ומכיל 10 מיקרומטר Y-27632 כמתואר ^{7 בעבר, 8, 9, 11.}
5. החל 2 מ"ל של CM אל החדר החיצוני של 6 את הצלחת היטב לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה (עבור h 18 לפחות).
6. מוציאים בזהירות את CM על החדר הפנימי עם 1 מ"ל או 200 μL פיפטה ולאט לאט להוסיף מדיה בידול (DM) אל החדר הפנימי עם טפטפת 1 מ"ל עד מלא. היזהר שלא להפריע את שכבת התאים.

le "> 2. תחזוקה של תרבויות 3D

1. בדוק את התרבויות בכל יום. תאים בריאים להופיע כפי שמוצג באיור 2.
2. שנה את CM בתא החיצוני כל יום או כל יום אחר תלוי בחילוף החומרים של התאים.
3. כאשר התקשורת של משנה את צבעה החדר הפנימי (צהוב), להסיר בזהירות את התקשורת על החדר מסנן פנימי עם 1 מ"ל או 200 פיפטה μL.
4. לשאוב התקשורת בתא הצלחת היטב החיצוני 6 עם טיפ aspirating.
5. בעזרת פיפטה 1 מ"ל, להחיל DM טריים לאט אל החדר הפנימי עד מלא. היזהר שלא לגרד או אחר לסלק את שכבת התאים.
6. החלף את המדיה בתא החיצוני עם 2 מ"ל של CM טרי.
7. לשמור על התרבויות במשך 2 שבועות, ולאחר מכן להמשיך עיבוד עבור בידוד bimolecular הרצוי.
   הערה: כל שורה צלחת 6 היטב, בסך הכל שישה מוסיף (איור 1B), אמורה להתבצע לכל ניסוי לרכוש מספיק תאים עבור DNA, RNA או חלבון לניתוח.
8. התקשורת לשאוב בתא החיצוני ולשטוף עם 2 בופר פוספט מ"ל (PBS).
9. מוציאים בזהירות התקשורת מהאולם הפנימי עם 1 מ"ל או 200 פיפטה μL ולהוסיף 500 μL PBS. הימנע גירוד או אחר מטריד את התאים על הממברנה.
10. לשאוב PBS מן החדר החיצוני ובזהירות להסיר PBS מן החדר הפנימי עם 1 מ"ל או 200 פיפטה μL. לאחר PBS הוסר, להמשיך ישירות את היישום המתאים כמפורט להלן. אל תאפשר הממברנה להתייבש. התרבות יכולה להישמר בקצרה PBS עד היישום הוא מוכן להתחיל.

3. עיבוד מסנני גלולת בנקאות

1. הוספת 100 μL 0.25% טריפסין-EDTA לכל חדר פנימי דגירה במשך 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
2. בקצרה ובזהירות להתסיס / לגרד את התאים על פני השטח קרום עם טפטפת 200 μL תוך pipetting למעלה ולמטה (להימנע puncטיורינג הממברנה). דגירה של 1 דק 'על 37 מעלות צלזיוס.
3. הוסף 250 μL של CM אל החדר הפנימי הראשון ו פיפטה למעלה ולמטה בעדינות כדי לשטוף את המסנן.
4. העברת resuspended תאים לתא מסנן הסמוך המכיל אותם תנאי התקשורת וחזור pipetting למעלה ולמטה.
5. חזור על הליך זה עבור כל אחד מוסיף של מצב יחיד. אסוף ולהעביר התאים לצינור צנטריפוגות 1.5 מ"ל.
6. ולשטוף כל תא פנימי עם תוספת של 100-200 μL של CM לאסוף את כל תאים נותרים. הוסף הצינור צנטריפוגות 1.5 מ"ל בשלב 3.5.
7. ספין התאים ב 423 XG microcentrifuge בבית 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
8. לשאוב supernatant לשטוף את התא גלולה אחת עם 1000 μL PBS.
9. ספין שוב 423 XG microcentrifuge בבית 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
10. לשאוב PBS ולהקפיא ב -80 ° C לשימוש מאוחר יותר.

4. עיבוד מסנני בידוד RNA או DNA

1. הוספת 200 μL של כלורופורם פנול-thiocyanate guanidinium או מגיב מיצוי דומה החדר הפנימי בקצרה להתסיס את התאים על פני השטח קרום ידי pipetting למעלה ולמטה.
2. מדגירים מגיב החילוץ עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר עם יבש החדר החיצוני.
   1. כפי המסנן עלול לנתק מן הכנס, לשטוף את הממברנה המסנן משויך ידי pipetting פתרון החילוץ למעלה ולמטה. אסוף כמה שיותר מגיב המיצוי ככל האפשר על ידי הטיית 6 הצלחת היטב aspirating כל נוזל שיורים.
3. פעל על פי הפרוטוקול של היצרן עבור טיהור ושחזור של DNA, RNA או חלבון.

5. עיבוד מסנני בידוד חלבון

1. מניח את הכנס המסנן בצלחת 6 היטב על קרח. אל החדר הפנימי, להוסיף 10 μL של חיץ תמוגה חלבון בתוספת 1 פלואוריד נתרן מ"מ (NaF), 1 vanadate נתרן מ"מ (NAV), 100 מ"מ dithiothreitol (DTT) וכן 100 μL של קוקטייל אנטי-פרוטאז.
2. להתסיס / לגרד את התאים על פני השטח קרום עם טפטפת 20 μL תוך pipetting למעלה ולמטה. למנוע יצירת בועות במאגר תמוגה.
3. דגירת צלחת 6 היטב עם מוסיף מסנן על קרח למשך 10 דקות.
4. חזור נגררים ולאחר מכן לשטוף את המשטח הממברנה עם למאגר תמוגה.
5. אסוף את lysates מן 6 מוסיף ולהעביר צינור צנטריפוגות 1.5 מ"ל על הקרח.
6. יש לשטוף את הממברנה הראשון עם 10 μL נוסף של חיץ תמוגה ולהעביר את המסנן הבא.
7. חזור על שלב 5.6 עבור כל המוסיף, איסוף כל פתרון חיץ תמוגה שיורית ולהוסיף צינור מיליליטר 1.5 (שלב 5.5).
8. דגירה המדגם על הקרח עבור 5 דקות נוספות.
9. ספין במהירות המרבית (16,873 XG בצנטריפוגה בראש הטבלה) במשך 15 דקות ב 4 ° C..
10. supernatant lysate פיפטה לתוך צינור 1.5 מיליליטר טרי.
11. המשך אל הניתוח ריכוזי או STO חלבוןמחדש lysates ב -80 מעלות צלזיוס.

עיבוד 6. עבור H & E ו- מכתים חיסונית

1. הוספת 500 μL ו 1 מ"ל של 10% NBF (נייטרלי שנאגרו פורמלין) לתא הפנימיים והחיצוניים ולתת דגירה לילה ב 4 מעלות צלזיוס.
2. לשאוב NBF מהאולם החיצוני ולהוסיף 1 agarose hydroxyethyl מ"ל (HEA) ג'ל עיבוד כדי בצנטריפוגה מ"ל 1.5. לאט להמיס את agarose במיקרוגל באמצעות צריכת חשמל נמוכה וחזר s פולסים 10-20 עד agarose הוא נמס.
3. שמור את HEA באמבט 37 מעלות צלזיוס חם כדי למנוע התמצקות עד מוכן לשימוש.
4. הסר את NBF מן החדר הפנימי וליישם 25 μL של חימום מותך החדר הפנימי ולאפשר agarose כדי לחזק במשך 2-5 דקות.
5. 2 קצף היסטולוגיה רפידות רטובות NBF 10% ומקום כרית אחת קלטת הטבעה (ראה האיור 3D).
6. השתמש להב סכין מנתחים # 11 (בעל להב חדה מאוד, בסדר-מחודד) להבקיע את המסנן מהצד התחתון של הכנסקאמרי, חלקית משחרר אותו מאולם סוגר הפלסטיק.
7. מניחים כמות קטנה (100-200 μL) של NBF בצלחת פטרי לטבול את מסנן וחילצה חלקית (איור 3 א) NBF.
8. עם אזמל להב # 10, ללחוץ בעדינות כנגד באמצע המסנן, מבפנים של החדר להוסיף, כדי לסלק את המסנן מלא מהחבית להוסיף (איור 3). אם יש חלק כלשהו של המסנן שעדיין מחוברת חבית, לנתק אותו עם אזמל.
9. חותכים את המסנן HEA מצופה לשניים עם להב סכין המנתחים # 10 (איור 3 ג).
10. מניחים כל חצי של המסנן על כרית קצף קלטת היסטולוגיה מוכן בשלב 6.4 (איור 3D).
11. מוסיף את הספוג השני 10% NBF הספוג לקסטה, רבדה המסננת.
12. צמד לאטום את הקלטת, מקום NBF, דגירת הלילה.
13. מסנן תהליך לגושים פרפין עבור חתך והכתים כמושתואר לעיל ^12.

תוצאות

את כנס תרבית תאי המערכת המבוססת היא הליך יחסי פשוט ומהיר להפקת תרבויות 3D של CRCs הערמונית שתומך התמיינות תאי luminal. סכמטי של המערכת מוצג (איור 1 א) המדגיש את היישום של ציפוי ג'לטין על פני השטח התחתונים של להכניס המסנן. המחדיר הפוך רק עבור היישו?...

Discussion

שורות תאים ראשיות הן פלטפורמה חשובה המתפתחת במהירות לחקר הסרטן. מערכת תרבות 3D תרבות מבוססת כנס תומכת הבידול של CRCs ערמונית העיקרי בתוך פרק זמן של שבועות. השיטה המסננת CRC מייצגת שיטת תפוקה חדשה, בינונית למחקר ערמונית. מודלי העכבר PDX קיימים הם זמן רב ויקר מאוד, ורבי דגימו?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Corning Costar Snapwell Culture Inserts	Corning	3801
Millicell Cell Culture Inserts	Millipore	PIHP01250
Multiwell 6 Well	Falcon	353046
Gelatin 0.1% in water	Stemcell Technologies	7903
Sterile Saftey Scapel 10 Blade	Integra Miltex	4-510
Sterile Standard Scalpel 11 Blade	Integra Miltex	4411
RIPA Lysis and Extraction Buffer	Thermofisher Scientific	89900
Sodium Fluoride	Fishcer Scientific	S299-100
Sodium Vanadate	Fishcer Scientific	13721-39-6
Dithiothreitol	Sigma-Aldrich	3483123
Protease Inhibitor Cocktail (AEBSF, Aprotinin, Bestatin, E-64, Leupeptin and Pepstatin A)	Sigma-Aldrich	P8340
0.25% Trypsin-EDTA (1x)	Thermofisher Scientific	25200-056
DMEM	Thermofisher Scientific	11965-092
FBS	Sigma-Aldrich	F2442
Glutamine	Thermofisher Scientific	25030081
Penicillin Streptomycin	Thermofisher Scientific	15140-122
F-12 Nutrient Mix Media	Thermofisher Scientific	11765054
Y-27632 dihydrochloride Rock inhibitor	Enzo	ALX-270-333-M025
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H0888
EGF	Thermofisher Scientific	PHG0315
Insulin	Thermofisher Scientific	12585-014
Cholera Toxin	Sigma-Aldrich	C3012
Gentamicin	Thermofisher Scientific	15710-064
Fungizone	Fisher Scientific	BP264550
Trizol Reagent	Invitrogen	15596026
Histogel Specimen Processing Gel (hydroxyethyl agarose (HEA))	Thermo Scientific	HG-4000-012
Non-Adherent Dressing	Telfa	KDL2132Z
Cell Culture Dish	Sigma	SIAL0167
HISTOSETTE II Tissue Processing / Embedding Cassettes	Crystalgen	CG-M492