Un système de culture 3D basé sur Insérer Filtre rapide pour Prostate primaire Différenciation Cellulaire

Résumé

Here, we present a method for the establishment of a rapid in vitro system that supports the three dimensional culturing and subsequent luminal differentiation of primary prostate epithelial cells.

Résumé

cellules conditionnellement reprogrammées (CRC) fournissent une méthode durable pour la culture cellulaire primaire et la capacité de développer de vastes "biobanques de vie» des patients provenant des lignées cellulaires. Pour de nombreux types de cellules épithéliales, diverses approches en trois dimensions (3D) de la culture ont été décrits qui soutiennent une amélioration de l'état différencié. Alors que CRCs conservent leur engagement lignée du tissu à partir duquel ils sont isolés, ils ne parviennent pas à exprimer un grand nombre de marqueurs de différenciation associés au tissu d'origine lorsqu'elles sont cultivées dans deux conditions (2D) de la culture tridimensionnelle normale. Afin d'améliorer l'application des CRCs patient dérivées pour la recherche sur le cancer de la prostate, un format de culture 3D a été défini qui permet une différenciation rapide (2 semaines au total) luminale des cellules dans les cellules épithéliales prostatiques normales et tumorales dérivées. Ici, un format à base d'insert de filtre est décrit pour la culture et la différenciation des deux CRCs de la prostate normales et malignes. A deDescription queue des procédures requises pour la collecte des cellules et le traitement pour la coloration immunohistochimique et immunofluorescence sont fournis. Collectivement, le format de la culture 3D est décrit, combiné avec les lignes primaires CRC, fournit un moyen important pour High- système modèle débit pour la recherche de la prostate sur la base des échantillons biologiques.

Introduction

L'identification et l'utilisation des thérapies du cancer qui sont personnalisés aux personnes sont un objectif primordial dans la recherche sur le cancer. Récemment, de nouvelles approches ont été développées qui permettent une plus grande facilité dans la mise en place de cultures de cellules primaires, ce qui pourrait fournir des moyens à la fois identifier et tester des thérapies personnalisées. Par exemple, la prostate à base de R-spondine approche organoïde ¹ permet en trois dimensions (3D) la culture des cellules cancéreuses de la prostate normales et métastatiques dans une matrice extracellulaire commercial (par exemple, le Matrigel), tandis que la méthode conditionnellement reprogrammant des cellules (CRC) développé à Georgetown ^{2, 3} utilise plus des conditions de culture 2D standard. Plus précisément, la combinaison d'un inhibiteur de la Rho kinase (Y-27632) et de cellules irradiées J2 nourricières de fibroblastes de souris conduit à la mise en culture indéfinie CRCs de kératinocytes ^2. La méthodologie CRC estextrêmement robuste, avec des lignées cellulaires primaires avec succès établies et maintenues indéfiniment de la prostate et d'autres tissus épithéliaux normaux et malins ^3. Surtout, notre technologie CRC a permis l'identification rapide de la base étiologique de papillomatose respiratoire récurrente chez un patient qui avait échoué un certain nombre de traitements médicamenteux précédents. En outre, en utilisant CRCs normales et tumorales dérivées, l'identification réussie d'un médicament approuvé par la FDA, le vorinostat, a été faite dans les deux semaines de la biopsie initiale du tissu. Le patient a été placé sur le vorinostat, ce qui entraîne le traitement réussi de la maladie ^4.

La glande prostatique normale est constituée d'luminale, la base et les rares cellules neuroendocrines ^5. luminale des cellules forment la couche épithéliale de la glande et expriment le récepteur d'androgène (AR), ainsi que d'autres marqueurs tels que luminal cytokératines 8 et 18 et proantigène spécifique de l' état (PSA) ^6. A l' inverse, les cellules basales sont localisés sous la couche luminale et expriment la cytokératine 5 et p63, mais de faibles niveaux de l'AR ^5. Nous ^{7, 8, 9} et ¹⁰ autres ont utilisé avec succès CRC de la prostate dans précliniques mécanistes enquêtes de sensibilité aux médicaments. Toutefois, lorsqu'elles sont cultivées dans des conditions de culture tissulaire standard 2D, ces cellules ne parviennent pas à engager pleinement un EA de signalisation ^10. Il est important, lorsqu'il est placé sous la capsule rénale de souris immunodéficientes, le CRC a repris l'architecture glandulaire de la prostate normale et la fonction indiquant que les CRC de la prostate conservent leur engagement de lignage lorsqu'il est placé dans un environnement permissif. La mise au point du système de culture de cellules à base d'insert de filtre décrit ici permet aux rapides (2 semaines) la différenciation in vitro de CRCs de la prostate comme le montre by l'augmentation de l'expression des gènes cibles et AR AR ainsi qu'une diminution des niveaux de p63.

Les éléments filtrants utilisés contiennent des membranes de polycarbonate (taille des pores 0,4 um) qui peuvent supporter la culture de cellules de mammifères. Le système, tel que développé, utilise des CRCs de la prostate normales et malignes, des boîtes de culture de 6 puits et les éléments filtrants. Milieux de culture cellulaire conditionnés par des cellules J2 ¹¹ est placé dans les médias de fond la chambre et de la prostate différenciation dans la chambre supérieure. Les techniques décrites ici soutiennent la différenciation des cellules de la prostate luminale dans un délai de 2 semaines, compatible avec les objectifs de la médecine personnalisée. Il était également impératif de développer des méthodes qui permettent le profilage moléculaire, génétique et cellulaire complète des cultures. Approches pour isoler l'ADN, l'ARN et des protéines à partir de cellules libérées de la surface du filtre ont été développés et rationalisé pour la répétition exacte de traitement des échantillons. Finally, la méthodologie nécessaire pour retirer le filtre pour permettre l'incorporation, sectionner et pour H & E, immunohistochimique et immunofluorescence, est entièrement décrite.

Protocole

1. Mise en place de la Cellule 3D Culture Système d'insertion

1. Placer les inserts 2 en polycarbonate de culture cellulaire dans une orientation inversée (côté filtre vers le haut) vers le bas dans une plaque de 6 puits (figure 1A).
2. Appliquer une fine couche de gélatine à 0,1% dans de l'eau à la face inférieure de l'insert et laisser sécher (10 à 20 min) dans une enceinte de sécurité biologique pour maintenir la stérilité.
3. Répétez l'étape 1.2 deux fois de plus pour un total de 3 applications de gélatine à 0,1% sur les inserts.
   NOTE: Le revêtement de gélatine va aider à limiter la diffusion entre les chambres.
4. Pour recueillir les CRC primaires des conditions de culture standard, ajouter 5 ml de PBS pour laver le flacon de culture.
   1. Trypsiniser les cellules en utilisant 1 ml (pour un T-25 et de 2 ml pour un T-75) 0,25% de trypsine-EDTA pendant 5 min à 37 ° C. Tapoter doucement le côté du flacon pour aider à déloger les cellules. Ensuite, passez à arrêter la réaction de la trypsine et de recueillir les cellules en ajoutant 5 ml de DMEM complet.
   2. Collecte les cellules dans un tube de 15 ml. Centrifuger le tube à 4 ° C et 188 xg et compter l'aide d'un compteur de cellules automatisé ou un hémocytomètre.
   3. Re-suspendre 600.000 CRC dans 250 pi médias (CM) conditionnés et ajouter à la orientée correctement (côté filtre vers le bas) culture insert (figure 1B). Ceci est désigné comme la chambre intérieure.
      Note: CM-F milieux conditionnés par des cellules irradiées J2 et contient 10 um Y-27632 comme décrit précédemment ^{7, 8, 9, 11.}
5. Appliquer 2 ml de CM à la chambre extérieure de la plaque 6 puits et incuber à 37 ° C pendant la nuit (pendant au moins 18 h).
6. Retirez délicatement le CM sur la chambre intérieure avec un mL 1 ou 200 pi pipette et ajouter lentement les médias de différenciation (DM) à la chambre intérieure avec une pipette 1 mL jusqu'au complet. Faites attention à ne pas perturber la couche cellulaire.

le "> 2. Entretien des cultures 3D

1. Vérifiez les cultures tous les jours. Les cellules saines apparaissent comme représenté sur la figure 2.
2. Changer le CM dans la chambre extérieure tous les jours ou tous les deux jours suivant le métabolisme des cellules.
3. Lorsque les médias de l'intérieur de couleur (jaune) change de chambre, retirer délicatement les médias sur la chambre de filtre interne avec un mL 1 ou 200 pi pipette.
4. Aspirer les médias dans la chambre extérieure 6 plaque bien avec une pointe d'aspiration.
5. En utilisant une pipette de 1 mL, appliquer lentement DM frais à la chambre intérieure jusqu'au complet. Veillez à ne pas gratter ou autrement déloger la couche cellulaire.
6. Remplacez le support dans la chambre extérieure avec 2 ml de CM frais.
7. Maintenir les cultures pendant 2 semaines, et ensuite procéder à un traitement pour l'isolement bimoléculaire souhaité.
   NOTE: Chaque ligne de la plaque 6 puits, un total de six inserts (figure 1B), doit être traité par expérience pour acquérir suffisamment de cellules pour DNUn ARN ou d'une protéine pour l'analyse.
8. Aspirer le milieu dans la chambre extérieure et rincer avec 2 ml du tampon phosphate salin (PBS).
9. Retirez délicatement les médias de la chambre intérieure avec un mL 1 ou 200 pi pipette et ajouter 500 ul de PBS. Évitez de raclage ou autrement perturber les cellules sur la membrane.
10. Aspirer PBS à partir de la chambre extérieure et retirez le PBS de la chambre intérieure avec un 1 ml ou 200 ul pipette. Une fois que le PBS a été retiré, passez directement à l'application appropriée détaillé ci-dessous. Ne pas laisser la membrane sécher. La culture peut être maintenue brièvement dans le PBS jusqu'à ce que l'application est prête à commencer.

3. Traitement des Filtres pour Pellet Banking

1. Ajouter 100 ul de 0,25% de trypsine-EDTA à chaque chambre intérieure et incuber pendant 5 minutes à 37 ° C.
2. En bref et soigneusement agiter / racler les cellules sur la surface de la membrane avec une pipette de 200 pi pendant pipetage vers le haut et vers le bas (pour éviter puncturation la membrane). Incuber pendant 1 min à 37 ° C.
3. Ajouter 250 ul de CM à la première chambre intérieure et la pipette de haut en bas doucement pour rincer le filtre.
4. Le transfert des cellules remises en suspension dans la chambre de filtre adjacente qui contient les mêmes conditions de presse et répéter pipetage vers le haut et vers le bas.
5. Répétez cette procédure pour chacun des inserts d'une seule condition. Collecter et transférer les cellules dans un tube de centrifugeuse de 1,5 ml.
6. Rincer chaque chambre intérieure avec un 100-200 ul supplémentaire de CM pour recueillir toutes les cellules restantes. Ajouter au tube de 1,5 ml centrifugeuse à l'étape 3.5.
7. Faire tourner les cellules à 423 x g dans une microcentrifugeuse à 4 ° C pendant 5 min.
8. Aspirer le surnageant et laver le culot cellulaire une fois avec 1000 ul de PBS.
9. Spin à nouveau à 423 xg dans une microcentrifugeuse à 4 ° C pendant 5 min.
10. Aspirer PBS et congélation à -80 ° C pour une utilisation ultérieure.

4. Traitement des filtres à ARN ou ADN Isolation

1. Ajouter 200 pi de thiocyanate de guanidinium-phénol-chloroforme ou le réactif d'extraction similaire à la chambre intérieure et agiter brièvement les cellules à la surface de la membrane par pipetage vers le haut et vers le bas.
2. Incuber dans le réactif d'extraction pendant 5 min à température ambiante avec la chambre extérieure sèche.
   1. Comme le filtre peut se dissocier de l'insert, laver la membrane filtrante dissociées par pipetage de la solution d'extraction vers le haut et vers le bas. Recueillir autant du réactif d'extraction possible en inclinant la plaque à 6 puits et aspirer tout liquide résiduel.
3. Suivre le protocole du fabricant pour la purification et la récupération de l'ADN, l'ARN ou une protéine.

5. Traitement des Filtres pour Protein Isolation

1. Placer la cartouche filtrante dans la plaque à 6 puits sur de la glace. À la chambre intérieure, ajouter 10 ul de tampon de lyse protéine supplémenté avec 1 mM de fluorure de sodium (NaF), 1 mM de vanadate de sodium (NaV), 100 mM dithiothreitol (DTT) et 100 ul d'un cocktail anti-protéase.
2. Agiter / gratter les cellules sur la surface de la membrane avec une pipette 20 ul pendant le pipetage vers le haut et vers le bas. Éviter de générer des bulles dans le tampon de lyse.
3. Incuber la plaque à 6 puits avec des inserts de filtre sur la glace pendant 10 min.
4. Répéter le grattage, puis rincer la surface de la membrane avec le tampon de lyse.
5. Ramassez les lysats des 6 inserts et transfert à un tube de 1,5 ml centrifugeuse sur la glace.
6. Rincer la première membrane avec un 10 pi supplémentaires de tampon de lyse et le transfert à l'autre filtre.
7. Répétez l'étape 5.6 pour tous les inserts, collecte toute solution résiduelle de tampon de lyse et ajouter au tube de 1,5 ml (étape 5.5).
8. Incuber l'échantillon sur de la glace pendant 5 minutes supplémentaires.
9. Spin à la vitesse maximale (16873 xg dans une centrifugeuse de table) pendant 15 min à 4 ° C.
10. Pipette lysat surnageant dans un nouveau tube de 1,5 ml.
11. Procéder à l'analyse de la concentration en protéine ou store lysats à -80 ° C.

6. Traitement pour H & E et Immuno-coloration

1. Ajouter 500 ul et 1 ml de 10% FBN (neutre de formol tamponné) à la chambre intérieure et extérieure et laisser incuber une nuit à 4 ° C.
2. Aspirer le FBN de la chambre extérieure et ajouter 1 mL hydroxyéthyl agarose (HEA) traitement du gel à une centrifugeuse de 1,5 ml. Faire fondre lentement l'agarose dans un micro-ondes en utilisant une faible puissance et répété 10-20 de les impulsions jusqu'à ce que l'agarose soit fondu.
3. Gardez le HEA dans un bain chaud à 37 ° C pour empêcher la solidification jusqu'à utilisation.
4. Retirez la FBN de la chambre intérieure et appliquer 25 ul de HEA fondu à la chambre intérieure et permettre à l'agarose à solidifier pendant 2-5 min.
5. Wet pads histologiques 2 de mousse à 10% FBN et placer un tampon dans une cassette incorporation (voir la figure 3D).
6. Utilisez une lame scalpel n ° 11 (qui a une lame très forte, pointe fine) pour marquer le filtre du côté inférieur de l'insertchambre, en libérant partiellement de la chambre d'insertion en plastique.
7. Placer une petite quantité (100-200 pi) de FBN dans une boîte de Pétri et immerger le filtre partiellement délogé dans la FBN (figure 3A).
8. Avec une lame scalpel # 10, appuyez doucement contre le milieu du filtre, de l'intérieur de la chambre d'insertion, pour déloger complètement le filtre de l'insert canon (figure 3B). S'il y a une partie du filtre qui est toujours fixée au canon, rompre avec le scalpel.
9. Couper le filtre HEA revêtu en deux avec la lame de scalpel n ° 10 (figure 3C).
10. Placer chaque moitié du filtre sur le tampon de mousse dans la cassette d'histologie préparé à l' étape 6.4 (figure 3D).
11. Ajouter la seconde 10% FBN éponge imbibée de la cassette, intercalant le filtre.
12. Snap sceller la cassette, dans FBN, et incuber pendant la nuit.
13. les filtres de processus dans des blocs de paraffine pour sectionner et coloration comme¹² décrit précédemment.

Résultats

Le système basé sur insert de culture cellulaire est une procédure relativement simple et rapide pour produire des cultures 3D de la prostate CRCs qui soutient la différenciation des cellules luminale. Un schéma du système est représenté (figure 1A) mettant en évidence l'application de la couche de gélatine sur la surface inférieure de la cartouche filtrante. Les inserts ne sont renversées pour l'application de la gélatine. Dans la figure 1B<...

Discussion

lignées de cellules primaires sont une plate-forme importante et en développement rapide pour la recherche sur le cancer. Le système de culture 3D basé insert de culture soutient la différenciation des CRC primaires de la prostate dans un délai de deux semaines. La méthode du filtre CRC représente une nouvelle méthode, de débit moyen pour la recherche de la prostate. modèles PDX de souris existantes sont longues et extrêmement coûteux, et beaucoup d'échantillons PDX ne peuvent pas être cultivées en c...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Corning Costar Snapwell Culture Inserts	Corning	3801
Millicell Cell Culture Inserts	Millipore	PIHP01250
Multiwell 6 Well	Falcon	353046
Gelatin 0.1% in water	Stemcell Technologies	7903
Sterile Saftey Scapel 10 Blade	Integra Miltex	4-510
Sterile Standard Scalpel 11 Blade	Integra Miltex	4411
RIPA Lysis and Extraction Buffer	Thermofisher Scientific	89900
Sodium Fluoride	Fishcer Scientific	S299-100
Sodium Vanadate	Fishcer Scientific	13721-39-6
Dithiothreitol	Sigma-Aldrich	3483123
Protease Inhibitor Cocktail (AEBSF, Aprotinin, Bestatin, E-64, Leupeptin and Pepstatin A)	Sigma-Aldrich	P8340
0.25% Trypsin-EDTA (1x)	Thermofisher Scientific	25200-056
DMEM	Thermofisher Scientific	11965-092
FBS	Sigma-Aldrich	F2442
Glutamine	Thermofisher Scientific	25030081
Penicillin Streptomycin	Thermofisher Scientific	15140-122
F-12 Nutrient Mix Media	Thermofisher Scientific	11765054
Y-27632 dihydrochloride Rock inhibitor	Enzo	ALX-270-333-M025
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H0888
EGF	Thermofisher Scientific	PHG0315
Insulin	Thermofisher Scientific	12585-014
Cholera Toxin	Sigma-Aldrich	C3012
Gentamicin	Thermofisher Scientific	15710-064
Fungizone	Fisher Scientific	BP264550
Trizol Reagent	Invitrogen	15596026
Histogel Specimen Processing Gel (hydroxyethyl agarose (HEA))	Thermo Scientific	HG-4000-012
Non-Adherent Dressing	Telfa	KDL2132Z
Cell Culture Dish	Sigma	SIAL0167
HISTOSETTE II Tissue Processing / Embedding Cassettes	Crystalgen	CG-M492