JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

وهدب الرئيسي هو أهمية أساسية في انتشار العصبية خلية سلفية، تمايز الخلايا العصبية، وظيفة الخلايا العصبية الكبار. هنا، نحن تصف طريقة لدراسة تكون الأهداب والاتجار يشير البروتينات إلى أهداب في الخلايا الجذعية / السلف العصبية والخلايا العصبية متباينة باستخدام الثقافات neurosphere الأولية.

Abstract

The primary cilium is fundamentally important for the proliferation of neural stem/progenitor cells and for neuronal differentiation during embryonic, postnatal, and adult life. In addition, most differentiated neurons possess primary cilia that house signaling receptors, such as G-protein-coupled receptors, and signaling molecules, such as adenylyl cyclases. The primary cilium determines the activity of multiple developmental pathways, including the sonic hedgehog pathway during embryonic neuronal development, and also functions in promoting compartmentalized subcellular signaling during adult neuronal function. Unsurprisingly, defects in primary cilium biogenesis and function have been linked to developmental anomalies of the brain, central obesity, and learning and memory deficits. Thus, it is imperative to study primary cilium biogenesis and ciliary trafficking in the context of neural stem/progenitor cells and differentiated neurons. However, culturing methods for primary neurons require considerable expertise and are not amenable to freeze-thaw cycles. In this protocol, we discuss culturing methods for mixed populations of neural stem/progenitor cells using primary neurospheres. The neurosphere-based culturing methods provide the combined benefits of studying primary neural stem/progenitor cells: amenability to multiple passages and freeze-thaw cycles, differentiation potential into neurons/glia, and transfectability. Importantly, we determined that neurosphere-derived neural stem/progenitor cells and differentiated neurons are ciliated in culture and localize signaling molecules relevant to ciliary function in these compartments. Utilizing these cultures, we further describe methods to study ciliogenesis and ciliary trafficking in neural stem/progenitor cells and differentiated neurons. These neurosphere-based methods allow us to study cilia-regulated cellular pathways, including G-protein-coupled receptor and sonic hedgehog signaling, in the context of neural stem/progenitor cells and differentiated neurons.

Introduction

وهدب الأساسي هو مقصورة التحت خلوية الحيوية القائمة على أنيبيب أن يعمل بمثابة الهوائي الحسي في تنسيق مسارات الإشارات الخلوية، بما في ذلك المسار سونيك القنفذ (صه) خلال تطوير الخلايا العصبية الجنينية 1 و 2 و إشارات التحت خلوية مجزأة في وظيفة الخلايا العصبية الكبار 3 و 4 . يشير مكونات هذه الممرات، مثل مستقبلات صه مرقع 5؛ المنشط مسار مملس (SMO) 6؛ وGpr161 7، ومستقبلات البروتين يقترن الأيتام G (GPCR) الذي ينظم سلبا على مسار صه، توطين لأهداب بطريقة ديناميكية. وقد تم الإبلاغ عن GPCRs متعددة لتوطين للأهداب الخلايا العصبية في الدماغ في 7 و 8 و 9 و 10 سوب>، 11، 12، 13، 14، 15، 16. عيوب في أهداب ومسارات إشارات ولدت أهداب تؤثر على أنسجة متعددة ومعروفة جماعيا باسم ciliopathies 17 و 18 و 19. في كثير من الأحيان يشمل الطيف مرض ciliopathy عيوب النمو العصبي، مثل تشوهات القحفي 20 و 21 و 22. وبالإضافة إلى ذلك، أهداب الأساسي في الخلايا العصبية المهاد تنظيم مسارات الشبع المركزية، والعيوب يؤدي إلى السمنة المركزية 23، وهو ما يعكس السمنة في ciliopathies المتلازمات مثل متلازمة بارديه Biedel 24. وبالإضافة إلى ذلك، مستقبلات نيوروبيبتيدي يشير في أهداب ينظم الطرد المركزيآل الشبع مسارات 11 و 14. توطين الهدبية انزيمات سيكلاز III (ACIII) وGPCRs مثل السوماتوستاتين مستقبلات 3 في الخلايا العصبية الحصين يؤدي إلى عيوب الاعتراف جوه جديدة والعجز في الذاكرة 25 و 26 و يوازي غياب النزاهة الهدبية 27. ترتبط الجوانب التنموية للإشارات ولدت أهداب ارتباطا وثيقا توازن الأنسجة. على وجه الخصوص، أهداب هامة لتطور ورم أرومي نخاعي صه-فرعي الناتجة عن الأسلاف الحبيبية في المخيخ 28 و 29. وهكذا، أهداب الأولية تلعب أدوارا هامة خلال الجنينية، وبعد الولادة، والكبار تطوير الخلايا العصبية وظيفة.

الخلايا الجذعية العصبية (NSCs) يقيمون في منطقة subventricular (SVZ) من البطين الجانبي، والمنطقة جزئي التحبب من التلفيف المسنن من الحصين، ومنطقة البطين من البطين الثالث في منطقة ما تحت المهاد في الثدييات 30 و 31 و 32. NSCs هي متعددة القدرات، وتمتلك القدرة على التجديد الذاتي، وهي مهمة لنمو المخ والطب التجديدي 30. معظم NSCs في SVZ هي هادئة وتمتلك هدب الأساسي الانفرادي أنه في كثير من الحالات، ويمتد إلى البطين الجانبي 33. إشارات هدب الأولية عن طريق توطين مختلف المستقبلات، يحفز الاستجابات الخلوية المصب، وخصوصا فيما يتعلق صه، TGFβ، ومستقبلات التيروزين كيناز مسارات 2، 34، 35، 36. منذ أهداب الأولية تمتد إلى البطين الجانبي، والافتراض بأن أهداب الابتدائي كشف السيتوكينات في السائل النخاعي (CSF) لتنشيط NSCs 37 . وتشير الدراسات الحديثة إلى أن إشارات الطريق صه وأهداب الأساسي حاسمة لتنشيط الخلايا الجذعية في إصلاح وتجديد الأنسجة متعددة، بما في ذلك الظهارة الشمية والرئة، والكلى 38 و 39 و 40 و 41. ومع ذلك، فإن الآليات التي CSF التواصل مع NSCs وما إذا أهداب الابتدائي تشارك ليست معروفة. ومهدبة NSCs ملتصقة في الثقافة؛ توطين مكونات مسار صه، مثل SMO وGpr161 في أهداب. وهي صه استجابة 42. وهكذا، يمكن NSCs بمثابة نظام المهم نموذج لدراسة مسار صه، والاتجار الهدبي، ومسارات التمايز العصبية. وبالإضافة إلى ذلك، الخلايا العصبية متباينة من NSCs يمكن أن تستخدم أيضا لفحوصات الاتجار الهدبية.

ويشكل Neurospheres من مجموعات من الخلايا التعويم الحر الناجمة عن انتشار neuraل الخلايا الجذعية / السلف التي تنمو في وجود عوامل نمو معينة والسطوح nonadhesive 43 و 44. Neurospheres بمثابة هاما في نماذج الثقافة المختبر لدراسة الخلايا الجذعية / السلف العصبية في التطور الطبيعي ومرض 31، 45، 46، 47. هنا، نحن تصف مقايسة على أساس neurosphere لزراعة الخلايا الجذعية العصبية / السلف والتمايز في الخلايا العصبية / الدبقية. ونحن نؤكد على وجه الخصوص الاتجار يشير إلى مكونات أهداب الجذعية العصبية / الخلايا الاولية والخلايا العصبية متباينة (الشكل 1). بدلا من زراعة الخلايا العصبية الأولية، neurospheres الأساسي من السهل نسبيا للثقافة، هي قابلة للفقرات متعددة ودورات ذوبان الجليد تجميد، ويمكن أن يخضع التمايز في الخلايا العصبية / الدبقية. الأهم من ذلك، توصلنا إلى أن العصبية المشتقة من neurosphereومهدبة الخلايا الجذعية / السلف والخلايا العصبية متباينة في الثقافة وتوطين الجزيئات مما يشير إلى وظيفة ذات الصلة الهدبية في هذه المقصورات. يمكن أن أساليب زراعة أساس Neurosphere-بمثابة نظام نموذجا مثاليا لدراسة تكون الأهداب والهدبية الاتجار NSCs والخلايا العصبية متباينة.

Protocol

1. عزل Neurospheres من الدماغ الكبار ماوس

  1. الموت ببطء الماوس الكبار (حوالي 2 أشهر من العمر) من خلال جرعة زائدة من الأيزوفلورين. انقر نقرا مزدوجا التحقق من أن الماوس توقف التنفس وتشريح فورا بعد الموت.
  2. باستخدام مقص، وجعل شق خط الوسط لفتح الجمجمة. إزالة الدماغ.
  3. وضع الدماغ في برنامج تلفزيوني الباردة في طبق 10 سم على الجليد. اتبع كامل جبل طريقة تشريح للحصول على SVZ من البطين الجانبي 48.
  4. وضع البطين الجانبي في أنبوب 1.5 مل، إضافة 500 ميكرولتر من 0.05٪ التربسين-EDTA في برنامج تلفزيوني، واحتضان الأنبوب لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية في حمام مائي.
  5. بعد 15 دقيقة، إضافة 500 ميكرولتر من وقف المتوسطة والماصة بلطف 20-30 مرات مع مل طرف 1. تجنب تشكيل فقاعات الهواء خلال pipetting ل.
    ملاحظة: هذه الخطوة هو أمر حاسم لبقاء الخلية.
  6. تدور أسفل الخلايا في 500 x ج لمدة 8 دقائق. تجاهل طاف، إضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني، و resuspend رانه الخلايا عن طريق pipetting بلطف 5X مع مل طرف 1.
  7. تدور باستمرار في 500 x ج لمدة 8 دقائق. تجاهل طاف باستخدام 1 مل طرف وإضافة 1 مل من المتوسط ​​القاعدية.
  8. (اختياري) إذا لوحظ الحطام الخلوي، لتمرير الخلايا من خلال 70 ميكرون خلية مصفاة.
  9. حساب عدد الخلايا مع عدادة الكريات. بشكل عام، حوالي 30،000 - يتم الحصول على 60000 خلية / SVZ.
  10. لوحة الخلايا من SVZ واحدة في صحن 10 سم مع 10 مل من NSC المتوسطة والثقافة في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2.
  11. (اختياري) لتجنب الانصهار بين المجالات 49، وطرح 1000 الخلايا في بئر واحدة من لوحة 6 جيدا منخفضة للغاية الملزم الذي مملوءة مسبقا مع 1.5 مل من NSC المتوسطة والثقافة في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2.
    ملاحظة: بعد 5-7 أيام، neurospheres يمكن ملاحظة (الشكل 2A). قد تختلف فترة زراعة مع سن الماوس أو الخلفية الوراثية.
  12. إضافة 2 مل من NSC المتوسطة كل 3-4 أيام للحفاظ على الثقافة(لا تقم بإزالة المتوسطة القائمة).

2. تحليل القدرات تمايز Neurospheres وتكون الأهداب الاختبارات

  1. لتحليل القدرة التمايز، وتحليل neurospheres في ظل ظروف ملتصقة في متوسطة التمايز.
  2. تعقيم 12 ملم coverslips جولة قبل التعقيم أو مع التعرض للأشعة فوق البنفسجية قبل استخدامها. لزراعة الخلايا الملتصقة، ووضع تعقيم 12 مم غطاء جولة زجاج في بئر من 24 لوحة جيدا تحت ظروف معقمة.
  3. معطف غطاء زجاجي لمدة 10 ق مع 500 ميكرولتر من 0.002٪ بولي-L-ليسين (PLL). نضح الحل وجففها لمدة 10-15 دقيقة.
  4. إضافة 500 ميكرولتر من محلول laminin (5 ميكروغرام / ميكرولتر). احتضان الزجاج غطاء لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية.
  5. نضح في laminin وإضافة 500 ميكرولتر من التمايز المتوسطة أو NSC المتوسطة (مراقبة غير متمايزة).
  6. للمقايسة التمايز، والتقاط 100 - ميكرون المجال 200 مع طرف 200 ميكرولتر تحت المجهر. إضافة5-10 neurospheres إلى كل بئر من 24 لوحة جيدا والثقافة لمدة 7-10 أيام في المتوسط ​​التمايز.
  7. لتحليل neurospheres غير متمايز، إضافة 5-10 neurospheres إلى كل بئر من 24 لوحة جيدا والثقافة لمدة 1-2 أيام في NSC المتوسطة. neurospheres المرفقة تنتشر وتنمو كما أحادي الطبقة (الشكل 2B).
  8. بعد إزالة بعناية متوسطة، إصلاح الخلايا مع بارافورمالدهيد 4٪ (PFA) في برنامج تلفزيوني لمدة 15 دقيقة في RT، ثم يغسل مع PBS مرتين لمدة 5 دقائق على RT. لوحة يمكن تخزينها في 4 درجة مئوية لمدة 1-2 أشهر.
    ملاحظة: لتصور الخلايا الجذعية / السلف العصبية في NSC المتوسطة وخلايا متباينة في المتوسط ​​التمايز، نفذ المناعية ضد Nestin (الجذعية العصبية / السلف علامة الخلية)، بيتا تويولين III (TUJ1 وحيدة النسيلة، علامة العصبية)، GFAP (الدبقية ييفي الحمضية البروتين ، علامة نجمية)، وO4 (دبقية قليلة التغصن علامة) (الشكل 2B-E). لتحليل أهداب، نفذ المناعية ضد Arl13b (CI الأساسيليا ماركر) وGpr161 (GPCR الهدبي) (الشكل 3).
  9. تركيب غطاء زجاجي مع تصاعد الحل على الزجاج الشرائح. إمالة الشريحة الزجاجية لإزالة حل الزائد.

3. تحليل تكون الأهداب في Neurospheres

  1. لتحليل الخلايا في neurospheres سليمة من قبل المناعية، ونقل 1 مل من المتوسط ​​زراعة تحتوي على neurospheres متعددة إلى أنبوب 1.5 مل وتدور باستمرار في 500 x ج لمدة 8 دقائق. إصلاح المجالات مع 4٪ (PFA) بعد إزالة متوسطة لمدة 15 دقيقة ويغسل مع برنامج تلفزيوني. تدور باستمرار المجالات في 500 x ج لمدة 8 دقائق، وإزالة طاف، واحتضان المجالات O / N مع 30٪ سكروز في 4 درجات مئوية.
  2. تجاهل طاف باستخدام 1 مل طرف وإضافة 500 ميكرولتر من محلول أكتوبر باستخدام قطع 1 مل طرف. قطع حافة الحافة لتوسيع الافتتاح، كما أكتوبر هو لزج.
  3. نقل الحل أكتوبر تحتوي على neurospheres إلى التخلص منها العفن تجميد البلاستيك (10 مم × 10 مم × 5 مم).
  4. تجميد مالعمر على الجليد الجاف لمدة 15 دقيقة على الأقل.
  5. (اختياري) وقف التجربة وتخزين القالب في الثلاجة -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 سنة.
  6. قطع المقاطع مع ناظم البرد. يجب أن يكون سمك أقسام 15-30 ميكرون.
  7. لتصور أهداب الابتدائي في neurosphere، نفذ المناعية ضد Arl13b (الشكل 4).

4. الثقافة ومرور Neurospheres وNSCs منتسب

  1. تمرير neurospheres في حين أن حجم المجال ما بين 100-200 ميكرون. عندما neurospheres هي كبيرة جدا (300 ميكرون أو أعلى)، فهي ليست مثالية لإجراء التجارب.
  2. نقل neurospheres في أنبوب 50 مل باستخدام 1 مل طرف وتدور باستمرار في 500 x ج لمدة 8 دقائق.
  3. تجاهل طاف باستخدام الشافطة، إضافة 500 ميكرولتر من 0.05٪ التربسين-EDTA في برنامج تلفزيوني، واحتضان لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية. كمية التربسين يختلف اعتمادا على عدد من المجالات.
  4. إضافة 500 ميليلتر من الدم المتوسطة وبلطف الأنابيبر 20 مرات مع مل طرف 1.
  5. تدور باستمرار في 500 x ج لمدة 8 دقائق. تجاهل طاف باستخدام 1 مل طرف وإضافة 1 مل من المتوسط ​​القاعدية.
  6. (اختياري) إذا رأيت الحطام الخلوي أو undissociated neurospheres، لتمرير الخلايا من خلال 70 ميكرون خلية مصفاة.
  7. مرور خلايا في طبق 10 سم في مناطق ذات كثافة من 10000 خلية / سم 2 في NSC المتوسطة. الخلايا ستكون جاهزة للمرور القادم بعد أسبوع.
  8. (اختياري) لتجميد الخلايا، إضافة تجميد المتوسطة لتوليد 500،000 إلى 1،000،000 خلية / مل تعليق. تجميد الخلايا باستخدام حاويات تجميد البرد. ويمكن أيضا neurospheres undissociated أن تجمد.
  9. للثقافة ملتصقة، dillute الخلايا الى 50،000 خلية / سم 2 على PLL- وcoverslips مع NSC المتوسطة، والثقافة Laminin المغلفة لمدة 1-2 أيام.

5. المجاعة وتحليل سيليا

  1. إعداد المتوسطة الجوع (الجدول 1).
  2. بعد 1-2 أيام من رر الأوليating من الخلايا الملتصقة بعد التفكك، وتغير لNSC المتوسطة في بئر واحدة (السيطرة) ومتوسطة المجاعة في آخر أيضا (التجربة).
  3. ثقافة الخلايا الملتصقة لمدة 24 ساعة.
  4. إصلاح الخلايا مع 4٪ PFA في برنامج تلفزيوني لمدة 15 دقيقة في RT ويغسل مرتين مع برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق كل في RT.
  5. (اختياري) وقف التجربة وتخزين 24 لوحات بشكل جيد مع coverslips في برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية لمدة 1-2 أشهر.
  6. إجراء بروتوكول المناعي عن تلطيخ 7، 50.
  7. جبل لل coverslips باستخدام محلول المتزايدة. تجفيف O الشريحة الزجاجية / N في RT في الظلام.
  8. الحصول على صور في المجهر المركب في التكبير اللازم. استخدام المجهر، وكاميرا، والأهداف (40X / 1.3 النفط و63X / 1.4 النفط)، التي تسيطر عليها باستخدام برنامج يرافقه. خذ كافية ض أقسام في 0،5-0،8 ميكرون فترات (الشكل 5).
  9. لتحليل كمي لتوطين الهدبية فيالخلايا الملتصقة، الحصول على رزمة من الصور 3-8 المجالات متتالية مع خلايا متكدسة من خلال النظر في قناة دابي. تحديد عدد أهداب أساسي باستخدام يماغيج / فيجي. عادة، استخدام أداة "مكافحة خلية" في يماغيج الإضافات> مربع الحوار إلى عدد الخلايا مع أهداب GPCR إيجابية تحليل. توقعات القصوى من رزمة من الصور كما يمكن تصديرها من يماغيج / Fiji.Use كثافة صورة مماثلة والمعلمات المقابل لجميع الصور من نفس التجربة لمدة العد وأغراض التصدير.

6. ترنسفكأيشن من Neurospheres

  1. تلتزم فصل الخلايا لcoverslips لمدة 24 ساعة. استخدام كثافة الخلايا عادة بين 75،000 و 150،000 الخلايا في 500 ميكرولتر من NSC المتوسطة في بئر واحدة من 24 لوحة جيدا.
  2. مزيج 25 ميكرولتر من انخفاض سيرم و 1.5 ميكرولتر من كاشف ترنسفكأيشن في مل microtube 0.5 قبل vortexing لمدة 5 ق.
  3. إضافة 2.5 ميكروغرام من الذيفان الداخلي خالية DNA البلازميد إلى منفصلة 0.5 مل microtubالبريد التي تحتوي على 25 ميكرولتر من خفض وسائل الاعلام المصل وتخلط قبل vortexing لمدة 5 ق.
  4. إضافة 1 ميكرولتر من كاشف ترنسفكأيشن إلى microtube يحتوي الثاني على DNA وتخلط قبل vortexing لمدة 5 ق.
  5. يضاف خليط من الأنبوب التي تحتوي على الحمض النووي للmicrotube الأول ومزيج من قبل pipetting.
  6. احتضان الخليط لمدة 10-15 دقيقة في RT. بعد الحضانة، إضافة بلطف قطرة قطرة مزيج ترنسفكأيشن إلى الآبار على أعلى من المتوسط ​​NSC (500 ميكرولتر / جيد).
  7. تغيير المتوسط ​​24 ساعة بعد ترنسفكأيشن للسيطرة المتوسطة (NSC المتوسطة) أو متوسطة المجاعة (500 ميكرولتر / جيد).
  8. إصلاح الخلايا عن طريق تغيير المتوسط ​​إلى 4٪ PFA بعد 24 ساعة وأداء المناعية. عادة، تصل إلى كفاءة ترنسفكأيشن 10٪ يتم الحصول عليها باستخدام هذا البروتوكول.

النتائج

بعد طلاء الخلايا من SVZ في NSC متوسطة لمدة أسبوع، لوحظت neurospheres العائمة (الشكل 2A). أحجام مجالات تتراوح بين 50 و 200 ميكرون. لفحص إذا كانت تستمد المجالات من الخلايا الجذعية / السلف العصبية، كانت مطلية من neurospheres على PLL- وcoverslips في NSC المتوسطة Laminin المغلف...

Discussion

هنا، نحن تصف طريقة لتوليد والحفاظ على الثقافات neurosphere من SVZ الماوس الكبار. هناك بعض النقاط ذات الصلة فيما يتعلق الثقافات هي على النحو التالي. أولا، أحجام المجالات وعادة ما تكون بين 50-200 ميكرون. في تجربتنا، وعندما يحصل على neurosphere أكبر من 300 ميكرون في القطر، وقد غاب عن الو?...

Disclosures

The authors declare no competing financial interests.

Acknowledgements

Work in S.M.'s laboratory is funded by recruitment grants from CPRIT (R1220) and NIH (1R01GM113023-01).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
12 mm round cover glassFisherbrand12-545-80 
24-well plateFalcon353047
4% paraformaldehyde (PFA)Affymetrix19943
50 mL tubeFalcon352098
95 mm x 15 mm petri dish, slippable lidFisherbrandFB0875714G10 cm dish
70 µm cell strainerFalcon352350
Alexa Fluor 488 Affinipure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson Immunoresearch711-545-152Donkey anti Rabbit, Alexa 488 secondary antibody
Arl13B, Clone N295B/66NeuromabAB_11000053
B-27 Supplement (50X), serum freeThermoFisher Scientific17504001B27
CentrifugeThermo scientificST 40R
Cryogenic vialCorning430488
DAPISigmaD9542-10MG
Deoxyribonuclease I from bovine pancreaseSigmaD5025-15KUDnase I
Dimethyl sulfoxideSigmaD8418-100MLDMSO
Disposable Vinyl Specimen MoldsSakura Tissue-Tek Cryomold456510 mm x 10 mm x 5 mm
Dulbecco's Phosphate-buffered Saline 10X, Modified, without calcium chloride and magnesium chloride, liquid, sterile-filtered, suitable for cell cultureSigmaD1408-500MLDPBS
Dumont #5 ForcepsFine science tools11254-20
Fetal Bovine Serum (FBS)SigmaF9026-500ML
Fluoromount-G solutionSouthern Biotech0100-01mounting solution
GFAPDAKOZ0334
Goat anti Mouse IgG1 Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugateThermoFisher ScientificA-21127Goat anti Mouse IgG1, Alexa 555 secondary antibody
Goat anti Mouse IgG2a Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugateThermoFisher ScientificA-21137Goat anti Mouse IgG2a, Alexa 555 secondary antibody
Gpr161home madeN/A
human bFGFSigmaF0291FGF
hemocytometerHausser Scientific0.100 mm deepimproved neubauer
IsothesiaHenry ScheinNDC 11695-0500-2Isofluorane
Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm Sarcoma basement membraneSigmaL2020Laminin
L-Glutamine (200 mM)SigmaG7513
Lipofectamine 3000 Transfection ReagentThermoFisher ScientificL3000
Mr. FrostyNalgene 5100-0036
N-2 supplement (100X)ThermoFisher Scientific17502001N2
Neurobasal mediumGibco21103-049
Normal Donkey SerumJackson ImmunoResearch017-000-121
OCT compoundSakura Tissue-Tek4583OCT
Penicillin-StreptomycinSigmaP4333-100ML
Poly-L-Lysine (PLL)SigmaP4707
Recombinant human EGF protein, CFR and D systems236-EG-200EGF
ScissorFine science tools14060-10
Superfrost plus microscope slideFisher scientific12-550-15slides
Triton X-100Bio-Rad161-0407
Trypsin-EDTA solution (10X)SigmaT4174-100Trypsin
COSTAR 6-Well Plate, With Lid Flat Bottom Ultra-Low Attachment Surface Polystyrene, SterileCorning3471ultra-low binding 6-well plate
β-tubulin IIICovanceMMS-435PTUJ1

References

  1. Mukhopadhyay, S., Rohatgi, R. G-protein-coupled receptors, Hedgehog signaling and primary cilia. Semin Cell Dev Biol. 33, 63-72 (2014).
  2. Goetz, S. C., Anderson, K. V. The primary cilium: a signalling centre during vertebrate development. Nat Rev Genet. 11, 331-344 (2010).
  3. Guemez-Gamboa, A., Coufal, N. G., Gleeson, J. G. Primary cilia in the developing and mature brain. Neuron. 82, 511-521 (2014).
  4. Louvi, A., Grove, E. A. Cilia in the CNS: the quiet organelle claims center stage. Neuron. 69, 1046-1060 (2011).
  5. Rohatgi, R., Milenkovic, L., Scott, M. P. Patched1 regulates hedgehog signaling at the primary cilium. Science. 317, 372-376 (2007).
  6. Corbit, K. C., et al. Vertebrate Smoothened functions at the primary cilium. Nature. 437, 1018-1021 (2005).
  7. Mukhopadhyay, S., et al. The ciliary G-protein-coupled receptor Gpr161 negatively regulates the Sonic hedgehog pathway via cAMP signaling. Cell. 152, 210-223 (2013).
  8. Hilgendorf, K. I., Johnson, C. T., Jackson, P. K. The primary cilium as a cellular receiver: organizing ciliary GPCR signaling. Curr Opin Cell Biol. 39, 84-92 (2016).
  9. Berbari, N. F., Johnson, A. D., Lewis, J. S., Askwith, C. C., Mykytyn, K. Identification of ciliary localization sequences within the third intracellular loop of G protein-coupled receptors. Mol Biol Cell. 19, 1540-1547 (2008).
  10. Berbari, N. F., Lewis, J. S., Bishop, G. A., Askwith, C. C., Mykytyn, K. Bardet-Biedl syndrome proteins are required for the localization of G protein-coupled receptors to primary cilia. Proc Natl Acad Sci USA. 105, 4242-4246 (2008).
  11. Loktev, A. V., Jackson, P. K. Neuropeptide Y family receptors traffic via the Bardet-Biedl syndrome pathway to signal in neuronal primary cilia. Cell Rep. 5, 1316-1329 (2013).
  12. Marley, A., Choy, R. W., von Zastrow, M. GPR88 reveals a discrete function of primary cilia as selective insulators of GPCR cross-talk. PLoS One. 8, e70857 (2013).
  13. Marley, A., von Zastrow, M. DISC1 regulates primary cilia that display specific dopamine receptors. PLoS One. 5, e10902 (2010).
  14. Omori, Y., et al. Identification of G Protein-Coupled Receptors (GPCRs) in Primary Cilia and Their Possible Involvement in Body Weight Control. PLoS One. 10, e0128422 (2015).
  15. Koemeter-Cox, A. I., et al. Primary cilia enhance kisspeptin receptor signaling on gonadotropin-releasing hormone neurons. Proc Natl Acad Sci USA. 111, 10335-10340 (2014).
  16. Brailov, I., et al. Localization of 5-HT(6) receptors at the plasma membrane of neuronal cilia in the rat brain. Brain Res. 872, 271-275 (2000).
  17. Hildebrandt, F. .. ,. ,. T. .. ,. &. a. m. p. ;. K. a. t. s. a. n. i. s. ,. N. .., Benzing, T., Katsanis, N. Ciliopathies. N Engl J Med. 364, 1533-1543 (2011).
  18. Waters, A. M., Beales, P. L. Ciliopathies: an expanding disease spectrum. Pediatr Nephrol. 26, 1039-1056 (2011).
  19. Badano, J. L., Mitsuma, N., Beales, P. L., Katsanis, N. The ciliopathies: an emerging class of human genetic disorders. Annu Rev Genomics Hum Genet. 7, 125-148 (2006).
  20. Novarino, G., Akizu, N., Gleeson, J. G. Modeling human disease in humans: the ciliopathies. Cell. 147, 70-79 (2011).
  21. Brugmann, S. A., Cordero, D. R., Helms, J. A. Craniofacial ciliopathies: A new classification for craniofacial disorders. Am J Med Genet A. 152A (12), 2995-3006 (2010).
  22. Valente, E. M., Rosti, R. O., Gibbs, E., Gleeson, J. G. Primary cilia in neurodevelopmental disorders. Nat Rev Neurol. 10, 27-36 (2014).
  23. Davenport, J. R., et al. Disruption of intraflagellar transport in adult mice leads to obesity and slow-onset cystic kidney disease. Curr Biol. 17, 1586-1594 (2007).
  24. Zaghloul, N. A., Katsanis, N. Mechanistic insights into Bardet-Biedl syndrome, a model ciliopathy. J Clin Invest. 119, 428-437 (2009).
  25. Einstein, E. B., et al. Somatostatin signaling in neuronal cilia is critical for object recognition memory. J Neurosci. 30, 4306-4314 (2010).
  26. Wang, Z., Phan, T., Storm, D. R. The type 3 adenylyl cyclase is required for novel object learning and extinction of contextual memory: role of cAMP signaling in primary cilia. J Neurosci. 31, 5557-5561 (2011).
  27. Berbari, N. F., et al. Hippocampal and cortical primary cilia are required for aversive memory in mice. PLoS One. 9, e106576 (2014).
  28. Han, Y. G., Alvarez-Buylla, A. Role of primary cilia in brain development and cancer. Curr Opin Neurobiol. 20, 58-67 (2010).
  29. Han, Y. G., et al. Dual and opposing roles of primary cilia in medulloblastoma development. Nat Med. 15, 1062-1065 (2009).
  30. Lim, D. A., Alvarez-Buylla, A. The Adult Ventricular-Subventricular Zone (V-SVZ) and Olfactory Bulb (OB) Neurogenesis. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 8, (2016).
  31. Shimada, I. S., LeComte, M. D., Granger, J. C., Quinlan, N. J., Spees, J. L. Self-renewal and differentiation of reactive astrocyte-derived neural stem/progenitor cells isolated from the cortical peri-infarct area after stroke. J Neurosci. 32, 7926-7940 (2012).
  32. Mich, J. K., et al. Prospective identification of functionally distinct stem cells and neurosphere-initiating cells in adult mouse forebrain. eLife. 3, e02669 (2014).
  33. Mirzadeh, Z., Merkle, F. T., Soriano-Navarro, M., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Neural stem cells confer unique pinwheel architecture to the ventricular surface in neurogenic regions of the adult brain. Cell stem cell. 3, 265-278 (2008).
  34. Pedersen, L. B., Mogensen, J. B., Christensen, S. T. Endocytic Control of Cellular Signaling at the Primary Cilium. Trends Biochem Sci. , (2016).
  35. Christensen, S. T., Clement, C. A., Satir, P., Pedersen, L. B. Primary cilia and coordination of receptor tyrosine kinase (RTK) signalling. J Pathol. 226, 172-184 (2012).
  36. Clement, C. A., et al. TGF-beta signaling is associated with endocytosis at the pocket region of the primary cilium. Cell reports. 3, 1806-1814 (2013).
  37. Taverna, E., Gotz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis: toward an understanding of the development and evolution of the neocortex. Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 465-502 (2014).
  38. Joiner, A. M., Green, W. W., McIntyre, J. C. Primary Cilia on Horizontal Basal Cells Regulate Regeneration of the Olfactory Epithelium. J Neurosci. 35, 13761-13772 (2015).
  39. Inaba, M., Buszczak, M., Yamashita, Y. M. Nanotubes mediate niche-stem-cell signalling in the Drosophila testis. Nature. 523, 329-332 (2015).
  40. Peng, T., et al. Hedgehog actively maintains adult lung quiescence and regulates repair and regeneration. Nature. 526, 578-582 (2015).
  41. Rauhauser, A. A., et al. Hedgehog signaling indirectly affects tubular cell survival after obstructive kidney injury. Am J Physiol: Renal Physiol. 309, F770-F778 (2015).
  42. Chavez, M., et al. Modulation of Ciliary Phosphoinositide Content Regulates Trafficking and Sonic Hedgehog Signaling Output. Dev Cell. 34, 338-350 (2015).
  43. Lobo, M. V., et al. Cellular characterization of epidermal growth factor-expanded free-floating neurospheres. J. Histochem. Cytochem. 51, 89-103 (2003).
  44. Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
  45. Pastrana, E., Silva-Vargas, V., Doetsch, F. Eyes wide open: a critical review of sphere-formation as an assay for stem cells. Cell stem cell. 8, 486-498 (2011).
  46. Nishino, J., Kim, I., Chada, K., Morrison, S. J. Hmga2 promotes neural stem cell self-renewal in young but not old mice by reducing p16Ink4a and p19Arf Expression. Cell. 135, 227-239 (2008).
  47. Shimada, I. S., Peterson, B. M., Spees, J. L. Isolation of locally derived stem/progenitor cells from the peri-infarct area that do not migrate from the lateral ventricle after cortical stroke. Stroke. 41, e552-e560 (2010).
  48. Mirzadeh, Z., Doetsch, F., Sawamoto, K., Wichterle, H., Alvarez-Buylla, A. The subventricular zone en-face: wholemount staining and ependymal flow. J Vis Exp. , (2010).
  49. Coles-Takabe, B. L., et al. Don't look: growing clonal versus nonclonal neural stem cell colonies. Stem Cells. 26, 2938-2944 (2008).
  50. Pal, K., et al. Smoothened determines beta-arrestin-mediated removal of the G protein-coupled receptor Gpr161 from the primary cilium. J Cell Biol. 212, 861-875 (2016).
  51. Caspary, T., Larkins, C. E., Anderson, K. V. The graded response to Sonic Hedgehog depends on cilia architecture. Dev Cell. 12, 767-778 (2007).
  52. Bangs, F. K., Schrode, N., Hadjantonakis, A. K., Anderson, K. V. Lineage specificity of primary cilia in the mouse embryo. Nat Cell Biol. 17, 113-122 (2015).
  53. Berbari, N. F., Bishop, G. A., Askwith, C. C., Lewis, J. S., Mykytyn, K. Hippocampal neurons possess primary cilia in culture. J Neurosci Res. 85, 1095-1100 (2007).
  54. Paridaen, J. T., Wilsch-Brauninger, M., Huttner, W. B. Asymmetric inheritance of centrosome-associated primary cilium membrane directs ciliogenesis after cell division. Cell. 155, 333-344 (2013).
  55. Kiprilov, E. N., et al. Human embryonic stem cells in culture possess primary cilia with hedgehog signaling machinery. J Cell Biol. 180, 897-904 (2008).
  56. Mukhopadhyay, S., et al. TULP3 bridges the IFT-A complex and membrane phosphoinositides to promote trafficking of G protein-coupled receptors into primary cilia. Genes Dev. 24, 2180-2193 (2010).
  57. Ishikawa, H., Marshall, W. F. Efficient live fluorescence imaging of intraflagellar transport in mammalian primary cilia. Methods Cell Biol. 127, 189-201 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

122 neurospheres G Gpr161

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved