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Resumen

El cilio primario es fundamentalmente importante en la proliferación neuronal de células progenitoras, la diferenciación neuronal, y la función neuronal adulto. A continuación, describimos un método para estudiar ciliogenesis y el tráfico de proteínas de señalización a los cilios en las células madre / progenitoras neuronales y neuronas diferenciadas utilizando cultivos de neuroesferas primarias.

Resumen

The primary cilium is fundamentally important for the proliferation of neural stem/progenitor cells and for neuronal differentiation during embryonic, postnatal, and adult life. In addition, most differentiated neurons possess primary cilia that house signaling receptors, such as G-protein-coupled receptors, and signaling molecules, such as adenylyl cyclases. The primary cilium determines the activity of multiple developmental pathways, including the sonic hedgehog pathway during embryonic neuronal development, and also functions in promoting compartmentalized subcellular signaling during adult neuronal function. Unsurprisingly, defects in primary cilium biogenesis and function have been linked to developmental anomalies of the brain, central obesity, and learning and memory deficits. Thus, it is imperative to study primary cilium biogenesis and ciliary trafficking in the context of neural stem/progenitor cells and differentiated neurons. However, culturing methods for primary neurons require considerable expertise and are not amenable to freeze-thaw cycles. In this protocol, we discuss culturing methods for mixed populations of neural stem/progenitor cells using primary neurospheres. The neurosphere-based culturing methods provide the combined benefits of studying primary neural stem/progenitor cells: amenability to multiple passages and freeze-thaw cycles, differentiation potential into neurons/glia, and transfectability. Importantly, we determined that neurosphere-derived neural stem/progenitor cells and differentiated neurons are ciliated in culture and localize signaling molecules relevant to ciliary function in these compartments. Utilizing these cultures, we further describe methods to study ciliogenesis and ciliary trafficking in neural stem/progenitor cells and differentiated neurons. These neurosphere-based methods allow us to study cilia-regulated cellular pathways, including G-protein-coupled receptor and sonic hedgehog signaling, in the context of neural stem/progenitor cells and differentiated neurons.

Introducción

El cilio primario es un compartimento subcelular dinámica basada en microtúbulos que funciona como una antena sensorial en la coordinación de vías de señalización celulares, incluyendo la vía de Sonic Hedgehog (Shh) durante el desarrollo neuronal embrionario 1, 2, y la señalización subcelular compartimentada en la función neuronal adulto 3, 4 . Señalización de componentes de estas vías, tales como el receptor de Shh Patched 5; el activador vía de Smoothened (Smo) 6; y Gpr161 7, un receptor acoplado a proteína G huérfano (GPCR) que regula negativamente la vía de Shh, localizar a los cilios de una manera dinámica. Múltiples GPCRs se han reportado para localizar a los cilios en las neuronas en el cerebro 7, 8, 9, 10 sup>, 11, 12, 13, 14, 15, 16. Los defectos en los cilios y vías de señalización generada cilios-afectan a múltiples tejidos y se conocen colectivamente como ciliopatías 17, 18, 19. El espectro de la enfermedad ciliopathy incluye con frecuencia defectos del neurodesarrollo, tales como anomalías craneofaciales 20, 21, 22. Además, los cilios primarios en las neuronas hipotalámicas regular las vías centrales de saciedad, y los defectos resultan en obesidad central 23, lo que refleja la obesidad en ciliopatías sindrómicas como el síndrome de Bardet Biedel 24. Además, el neuropéptido señalización en cilios receptor regula central saciedad vías de 11, 14. Localización ciliar de adenilil ciclasa III (ACIII) y GPCRs, tales como receptores de somatostatina 3 en las neuronas del hipocampo como resultado nuevas defectos reconocimiento de objetos y los déficits de memoria 25, 26 y es paralelo a una falta de integridad ciliar 27. Los aspectos de desarrollo de la señalización generada cilios-están estrechamente ligados a la homeostasis del tejido; en particular, los cilios son importantes para la progresión de los meduloblastomas Shh subtipo que surgen a partir de progenitores granulares en el cerebelo 28, 29. Por lo tanto, los cilios primarios juegan un papel importante durante embrionario, postnatal y adulto el desarrollo neuronal y función.

Las células madre neurales (NSC) residen en la zona subventricular (SVZ) del ventrículo lateral, la zona subgranular del giro dentado del hipocampo, y lazona ventricular del tercer ventrículo en el hipotálamo en mamíferos 30, 31, 32. NSC son multipotentes, poseen la capacidad de auto-renovación, y son importantes para el desarrollo del cerebro y la medicina regenerativa 30. La mayoría de NSC en la SVZ son quiescentes y poseen un cilio primario solitario que, en muchos casos, se extiende hacia fuera al ventrículo lateral 33. Las señales cilio primario a través de la localización de diversos receptores, la inducción de respuestas celulares aguas abajo, particularmente en relación con Shh, TGF, y las vías de tirosina quinasa del receptor 2, 34, 35, 36. Desde cilios primarios se extienden en el ventrículo lateral, se plantea la hipótesis de que los cilios primarios detectar citoquinas en el líquido cefalorraquídeo (CSF) para activar NSCs 37 . Estudios recientes sugieren que la vía de señalización de Shh y cilios primarios son críticos para la activación de las células madre en la reparación y la regeneración de múltiples tejidos, incluyendo el epitelio olfativo, pulmón, y riñón 38, 39, 40, 41. Sin embargo, los mecanismos por los que CSF se comunica con NSCs y si los cilios primarios están implicados no son conocidos. NSCs adherentes en cultivo se ciliadas; localizar componentes de la vía de Shh, tales como Smo y Gpr161 en cilios; y son Shh sensible 42. Por lo tanto, NSCs pueden servir como un importante sistema modelo para estudiar la vía de Shh, el tráfico ciliar y vías de diferenciación neuronales. Además, las neuronas diferenciadas de NSCs también se pueden utilizar para ensayos de tráfico ciliar.

Neurospheres están constituidos por agrupaciones de células que flotan libremente que surgen de la proliferación de neuracélulas madre / progenitoras l que crecen en presencia de factores de crecimiento específicos y superficies no adhesivas 43, 44. Neurospheres sirven como importante en los modelos de cultivo in vitro para estudiar las células madre / progenitoras neurales en el desarrollo normal y la enfermedad de 31, 45, 46, 47. A continuación, describimos un ensayo basado en neurosphere para cultivar células neurales madre / progenitoras y para la diferenciación en neuronas / glia. En particular hincapié en el tráfico de señalización componentes a cilios de tallo neural / células progenitoras y las neuronas diferenciadas (Figura 1). A diferencia de cultivo de neuronas primarias, neuroesferas primarias son relativamente fáciles de cultura, son susceptibles de múltiples pases y ciclos hielo-deshielo, y pueden someterse a la diferenciación en neuronas / glia. Es importante destacar que, determinamos que neural neurosphere derivadoscélulas madre / progenitoras y neuronas diferenciadas se ciliadas en la cultura y localizar moléculas relevantes para la función ciliar en estos compartimentos de señalización. métodos de cultivo basados ​​en Neurosphere pueden servir como un sistema de modelo ideal para el estudio ciliogenesis y ciliar trata de NSCs y neuronas diferenciadas.

Protocolo

1. Aislamiento de neuroesferas del cerebro de ratón adulto

  1. La eutanasia a un ratón adulto (alrededor de 2 meses de edad) por una sobredosis de isoflurano. Vuelva a comprobar que el ratón ha dejado de respirar y diseccionar inmediatamente después de la muerte.
  2. Con unas tijeras, hacer una incisión en la línea media para abrir el cráneo. Retire el cerebro.
  3. Coloque el cerebro en PBS frío en un plato de 10 cm en hielo. Siga todo el montaje el método de disección para obtener la SVZ desde el ventrículo lateral 48.
  4. Coloque el ventrículo lateral en un tubo de 1,5 ml, añadir 500 l de 0,05% de tripsina-EDTA en PBS, y se incuba el tubo durante 15 min a 37 ° C en un baño de agua.
  5. Después de 15 min, añadir 500 l de medio de frenado y pipetear suavemente 20 - 30 veces con una punta de 1 mL. Evitar la formación de burbujas de aire durante el pipeteado.
    NOTA: Este paso es fundamental para la supervivencia celular.
  6. Centrifugar las células a 500 xg durante 8 min. Descartar el sobrenadante, se añade 1 ml de PBS, y resuspender tél células pipeteando con suavidad 5x con una punta de 1 ml.
  7. Centrifugar a 500 xg durante 8 min. Descartar el sobrenadante usando una punta de 1 ml y añadir 1 ml de medio basal.
  8. (Opcional) Si se observan restos celulares, pasar las células a través de una célula colador de 70 m.
  9. Contar el número de células con un hemocitómetro; En general, aproximadamente 30.000 - se obtienen 60.000 células / SVZ.
  10. Placa de las células de un SVZ en una placa de 10 cm con 10 ml de medio y la cultura NSC a 37 ° C con 5% de CO2.
  11. (Opcional) Para evitar la fusión entre las esferas 49, poner 1.000 células en un único pocillo de una placa de ultra-bajo de unión de 6 pocillos que se llena previamente con 1,5 ml de medio y la cultura NSC a 37 ° C con 5% de CO2.
    NOTA: Después de 5-7 días, las neuroesferas se pueden observar (Figura 2A). El período de cultivo puede variar con la edad de ratón o los antecedentes genéticos.
  12. Añadir 2 ml de medio NSC cada 34 días para mantener la cultura(No retire el medio existente).

2. Análisis de la capacidad de diferenciación de las Pruebas de neuroesferas y ciliogenesis

  1. Para analizar la capacidad de diferenciación, analizar las neuroesferas en condiciones adherentes en medio de diferenciación.
  2. Esterilizar 12 mm cubreobjetos redondos por tratamiento en autoclave o con la exposición UV antes de su uso. Para un cultivo de células adherentes, poner una cubierta de vidrio redonda esterilizado 12 mm en un pocillo de una placa de 24 pocillos bajo condiciones asépticas.
  3. Escudo de la cubierta de vidrio durante 10 s con 500 l de 0,002% de poli-L-lisina (PLL). Aspirar la solución y se seca durante 10-15 min.
  4. Añadir 500 l de solución de laminina (5 g /? L). Incubar la cubierta de vidrio durante 1 h a 37 ° C.
  5. Aspirar el laminina y añadir 500 l de medio de diferenciación o medio NSC (control no diferenciado).
  6. Para el ensayo de diferenciación, recoger un 100 - esfera m 200 con una punta de 200 l bajo el microscopio. Añadir5-10 neuroesferas a cada pocillo de una placa de 24 pocillos y la cultura durante 7-10 días en medio de diferenciación.
  7. Para analizar neuroesferas indiferenciadas, añadir 5-10 neuroesferas a cada pocillo de una placa y cultivo de 24 pocillos durante 1-2 días en medio NSC. Neuroesferas adjuntos propagan y crecen como una monocapa (Figura 2B).
  8. Después de retirar cuidadosamente el medio, fijar las células con paraformaldehído al 4% (PFA) en PBS durante 15 min a TA, y luego lavar con PBS dos veces durante 5 min a RT. La placa puede almacenarse a 4 ° C durante 1-2 meses.
    NOTA: Para visualizar las células madre / progenitoras neurales en medio NSC y células diferenciadas en medio de diferenciación, lleve a cabo la inmunotinción contra Nestin (tallo neural / marcador de células progenitoras), β-tubulina III (monoclonal Tuj1, marcador neuronal), GFAP (proteína glial fibrilar ácida , marcador de astrocitos), y O4 (marcador de oligodendrocitos) (Figura 2B-e). Para el análisis de los cilios, lleve a cabo la inmunotinción contra Arl13b (ci primarialia marker) y Gpr161 (GPCR ciliar) (Figura 3).
  9. Montar la cubierta de vidrio con una solución de montaje en un portaobjetos de vidrio. Incline el portaobjetos de vidrio para eliminar el exceso de solución.

3. Análisis de ciliogenesis en Neurospheres

  1. Para analizar las células en neuroesferas intactas por inmunotinción, la transferencia de 1 ml de medio de cultivo que contiene múltiples neuroesferas a un tubo de 1,5 ml y centrifugar a 500 xg durante 8 min. Fijar las esferas con 4% (PFA) después de retirar el medio durante 15 minutos y lavar con PBS. Centrifugar esferas a 500 xg durante 8 min, eliminar el sobrenadante, y se incuba las esferas O / N con 30% de sacarosa a 4 ° C.
  2. Descartar el sobrenadante usando una punta de 1 ml y añadir 500 l de solución de octubre usando una punta de corte 1 mL. Corte el borde de la punta para ensanchar la abertura, como OCT es viscoso.
  3. Transferir la solución octubre que contiene las neuroesferas en un molde de plástico de congelación desechable (10 mm x 10 mm x 5 mm).
  4. Congelar la mviejo en hielo seco durante al menos 15 min.
  5. (Opcional) detener el experimento y almacenar el molde en un congelador a -80 ° durante hasta 1 año.
  6. Cortar las secciones con un criostato; el espesor de las secciones debe ser de 15-30 m.
  7. Para visualizar los cilios primaria en un neurosphere, lleve a cabo la inmunotinción contra Arl13b (Figura 4).

4. Cultura y aprobación de neuroesferas y NSC adherentes

  1. Passage las neuroesferas mientras que el tamaño de la esfera es de entre 100-200 micras; cuando las neuroesferas son demasiado grandes (300 micras o superior), no son ideales para los experimentos.
  2. Transferencia de las neuroesferas en un tubo de 50 ml con una punta de 1 ml y centrifugar a 500 xg durante 8 min.
  3. Descartar el sobrenadante utilizando un aspirador, añadir 500 l de 0,05% de tripsina-EDTA en PBS, y se incuba durante 5 min a 37 ° C. La cantidad de tripsina varía en función del número de esferas.
  4. Añadir 500 l de medio de suero y suavemente tuberíaT 20 veces con una punta de 1 ml.
  5. Centrifugar a 500 xg durante 8 min. Descartar el sobrenadante usando una punta de 1 ml y añadir 1 ml de medio basal.
  6. (Opcional) Si se observan residuos celulares o no disociadas neuroesferas, pasar las células a través de una célula colador de 70 m.
  7. Passage las células en una placa de 10 cm a una densidad de 10.000 células / cm2 en medio NSC; las células estarán listos para el siguiente paso después de una semana.
  8. (Opcional) Para congelar las células, añadir medio de congelación para generar 500.000 a 1.000.000 células / ml de suspensión. Congelar las células utilizando recipientes crio-congelación; neuroesferas disociadas También se pueden congelar.
  9. Para el cultivo adherente, dillute las células a 50.000 células / cm 2 en PLL- y cubreobjetos con medio de NSC, y la cultura recubiertas con laminina durante 1-2 días.

5. El hambre y el análisis de los cilios

  1. Preparar medio de inanición (Tabla 1).
  2. 1-2 días después de la pl inicialating de células adherentes después de la disociación, el cambio de medio NSC en un pocillo (control) y medio de inanición en otro pozo (experimento).
  3. Cultivar las células adherentes durante 24 h.
  4. Fijar las células con PFA al 4% en PBS durante 15 min a TA y se lava dos veces con PBS durante 5 min cada uno a TA.
  5. (Opcional) detener el experimento y almacenar las placas de 24 pocillos con cubreobjetos en PBS a 4 ° C durante 1-2 meses.
  6. Realizar un protocolo de inmunofluorescencia para la tinción de 7, 50.
  7. Montar el cubreobjetos utilizando solución de montaje. Secar el portaobjetos de vidrio O / N a temperatura ambiente en la oscuridad.
  8. Adquirir imágenes en un microscopio compuesto en la ampliación necesaria. Utilizar un microscopio, una cámara y objetivos (40X / 63X 1.3 de petróleo y / 1.4 aceite), controlado mediante el software acompañado. Tome suficientes secciones Z en 0,5-0,8 m intervalos (Figura 5).
  9. Para el análisis cuantitativo de la localización ciliar enlas células adherentes, adquieren pilas de imágenes de 3-8 campos consecutivos con células confluentes mirando en el canal de DAPI. Cuantificar el número de cilios primarios usando ImageJ / Fiji. Típicamente, utilice la herramienta "contador de células" en el ImageJ Plugins> cuadro de diálogo para contar las células con cilios GPCR-positivo Analizar; proyecciones máximas de pilas de imágenes también se pueden exportar desde ImageJ / Fiji.Use intensidad de la imagen similar y parámetros de contraste para todas las imágenes desde el mismo experimento para contar y propósitos de exportación.

6. La transfección de neuroesferas

  1. Adherir disociarse células para cubreobjetos durante 24 h. Utilice una densidad celular típicamente entre 75.000 y 150.000 células en 500 l de medio NSC en un solo pocillo de una placa de 24 pocillos.
  2. Mezclar 25 l de medio de suero reducido y 1,5 l de reactivo de transfección en un microtubo ml 0,5 por agitación durante 5 s.
  3. Añadir 2,5 g de ADN plasmídico sin endotoxina a un separado 0,5 ml microtube que contiene 25 l de medio de suero reducido y mezclar mediante agitación durante 5 s.
  4. Añadir 1 l de reactivo de transfección a la segunda ADN microtubo que contiene y mezclar mediante agitación durante 5 s.
  5. Añadir la mezcla del tubo que contiene ADN a la primera microtubo y se mezcla mediante pipeteo.
  6. Incubar la mezcla durante 10-15 min a TA. Después de la incubación, añadir gota a gota suavemente la mezcla de transfección a los pocillos en la parte superior del medio de NSC (500! L / pocillo).
  7. Cambiar el medio 24 h post-transfección para controlar medio (medio NSC) o medio de inanición (500! L / pocillo).
  8. Fijar las células cambiando el medio a 4% PFA después de 24 h y llevar a cabo la inmunotinción; típicamente, hasta una eficiencia de transfección del 10% se obtiene usando este protocolo.

Resultados

Después de sembrar las células de la SVZ en medio NSC durante una semana, neuroesferas flotantes se observaron (Figura 2A). Los tamaños de las esferas variaron entre 50 y 200! M. Para examinar si las esferas se derivan de las células madre / progenitoras neurales, las neuroesferas se sembraron en PLL- y cubreobjetos en medio NSC recubiertas con laminina durante 2 días. Luego fueron inmunoti~neron contra el marcador / célula progenitora madre neurales, nestina. Se n...

Discusión

A continuación, se describe un método para generar y mantener los cultivos de neuroesferas de SVZ ratón adulto. Unos pocos puntos pertinentes con respecto a los cultivos son las siguientes. En primer lugar, los tamaños de las esferas son típicamente entre 50 - 200 micras. En nuestra experiencia, cuando un neurosphere se hace más grande de 300 m de diámetro, el momento óptimo para los pases se ha perdido. Estas esferas grandes contienen las células muertas en el núcleo. En segundo lugar, como neuroesferas se ut...

Divulgaciones

The authors declare no competing financial interests.

Agradecimientos

Work in S.M.'s laboratory is funded by recruitment grants from CPRIT (R1220) and NIH (1R01GM113023-01).

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
12 mm round cover glassFisherbrand12-545-80 
24-well plateFalcon353047
4% paraformaldehyde (PFA)Affymetrix19943
50 mL tubeFalcon352098
95 mm x 15 mm petri dish, slippable lidFisherbrandFB0875714G10 cm dish
70 µm cell strainerFalcon352350
Alexa Fluor 488 Affinipure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson Immunoresearch711-545-152Donkey anti Rabbit, Alexa 488 secondary antibody
Arl13B, Clone N295B/66NeuromabAB_11000053
B-27 Supplement (50X), serum freeThermoFisher Scientific17504001B27
CentrifugeThermo scientificST 40R
Cryogenic vialCorning430488
DAPISigmaD9542-10MG
Deoxyribonuclease I from bovine pancreaseSigmaD5025-15KUDnase I
Dimethyl sulfoxideSigmaD8418-100MLDMSO
Disposable Vinyl Specimen MoldsSakura Tissue-Tek Cryomold456510 mm x 10 mm x 5 mm
Dulbecco's Phosphate-buffered Saline 10X, Modified, without calcium chloride and magnesium chloride, liquid, sterile-filtered, suitable for cell cultureSigmaD1408-500MLDPBS
Dumont #5 ForcepsFine science tools11254-20
Fetal Bovine Serum (FBS)SigmaF9026-500ML
Fluoromount-G solutionSouthern Biotech0100-01mounting solution
GFAPDAKOZ0334
Goat anti Mouse IgG1 Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugateThermoFisher ScientificA-21127Goat anti Mouse IgG1, Alexa 555 secondary antibody
Goat anti Mouse IgG2a Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugateThermoFisher ScientificA-21137Goat anti Mouse IgG2a, Alexa 555 secondary antibody
Gpr161home madeN/A
human bFGFSigmaF0291FGF
hemocytometerHausser Scientific0.100 mm deepimproved neubauer
IsothesiaHenry ScheinNDC 11695-0500-2Isofluorane
Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm Sarcoma basement membraneSigmaL2020Laminin
L-Glutamine (200 mM)SigmaG7513
Lipofectamine 3000 Transfection ReagentThermoFisher ScientificL3000
Mr. FrostyNalgene 5100-0036
N-2 supplement (100X)ThermoFisher Scientific17502001N2
Neurobasal mediumGibco21103-049
Normal Donkey SerumJackson ImmunoResearch017-000-121
OCT compoundSakura Tissue-Tek4583OCT
Penicillin-StreptomycinSigmaP4333-100ML
Poly-L-Lysine (PLL)SigmaP4707
Recombinant human EGF protein, CFR and D systems236-EG-200EGF
ScissorFine science tools14060-10
Superfrost plus microscope slideFisher scientific12-550-15slides
Triton X-100Bio-Rad161-0407
Trypsin-EDTA solution (10X)SigmaT4174-100Trypsin
COSTAR 6-Well Plate, With Lid Flat Bottom Ultra-Low Attachment Surface Polystyrene, SterileCorning3471ultra-low binding 6-well plate
β-tubulin IIICovanceMMS-435PTUJ1

Referencias

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