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Resumo

O cílio primário é fundamentalmente importante na proliferação de células progenitoras neurais, a diferenciação neuronal, e função neuronal adulta. Aqui, descrevemos um método para estudar ciliogênese e o tráfico de proteínas de sinalização para os cílios em células estaminais / progenitoras neuronais e neurónios diferenciados utilizando culturas primárias de neuroesferas.

Resumo

The primary cilium is fundamentally important for the proliferation of neural stem/progenitor cells and for neuronal differentiation during embryonic, postnatal, and adult life. In addition, most differentiated neurons possess primary cilia that house signaling receptors, such as G-protein-coupled receptors, and signaling molecules, such as adenylyl cyclases. The primary cilium determines the activity of multiple developmental pathways, including the sonic hedgehog pathway during embryonic neuronal development, and also functions in promoting compartmentalized subcellular signaling during adult neuronal function. Unsurprisingly, defects in primary cilium biogenesis and function have been linked to developmental anomalies of the brain, central obesity, and learning and memory deficits. Thus, it is imperative to study primary cilium biogenesis and ciliary trafficking in the context of neural stem/progenitor cells and differentiated neurons. However, culturing methods for primary neurons require considerable expertise and are not amenable to freeze-thaw cycles. In this protocol, we discuss culturing methods for mixed populations of neural stem/progenitor cells using primary neurospheres. The neurosphere-based culturing methods provide the combined benefits of studying primary neural stem/progenitor cells: amenability to multiple passages and freeze-thaw cycles, differentiation potential into neurons/glia, and transfectability. Importantly, we determined that neurosphere-derived neural stem/progenitor cells and differentiated neurons are ciliated in culture and localize signaling molecules relevant to ciliary function in these compartments. Utilizing these cultures, we further describe methods to study ciliogenesis and ciliary trafficking in neural stem/progenitor cells and differentiated neurons. These neurosphere-based methods allow us to study cilia-regulated cellular pathways, including G-protein-coupled receptor and sonic hedgehog signaling, in the context of neural stem/progenitor cells and differentiated neurons.

Introdução

O cílio primário é um compartimento subcelular dinâmico baseado em microtúbulos que funciona como uma antena sensorial na coordenação de vias de sinalização celular, incluindo a via de Hedgehog Sonic (Shh), durante o desenvolvimento neuronal embrionário 1, 2, e sinalização subcelular compartimentada em adulto função neuronal 3, 4 . Sinalização componentes destas vias, tais como o receptor de Shh Patched 5; o activador via de Smoothened (Smo) 6; e Gpr161 7, um receptor órfão de Proteína G-acoplada (GPCR) que regula negativamente a via de Shh, localizar aos cílios de uma forma dinâmica. Várias GPCRs têm sido relatados para localizar aos cílios em neurónios no cérebro 7, 8, 9, 10 sup>, 11, 12, 13, 14, 15, 16. Defeitos no cílios e vias de sinalização gerada-cílios afectar vários tecidos e são conhecidos colectivamente como ciliopathies 17, 18, 19. O espectro da doença ciliopathy inclui frequentemente defeitos do neurodesenvolvimento, tais como anomalias craniofaciais 20, 21, 22. Além disso, cílios em neurónios hipotalâmicos regulam vias centrais de saciedade, e defeitos resultam em obesidade central 23, o espelhamento da obesidade em ciliopathies sindrómicas tais como síndrome de Bardet Biedel 24. Além disso, o receptor neuropéptido de sinalização em cílios regula central saciedade vias 11, 14. Localização ciliar de adenililciclase III (ACIII) e os GPCRs, tais como o receptor de somatostatina 3 em neurónios do hipocampo resultar em defeitos de reconhecimento de objecto novos e défices de memória 25, 26 e paralelo a falta de integridade ciliar 27. Os aspectos do desenvolvimento da sinalização gerada-cílios estão intimamente ligados a homeostase do tecido; em particular, os cílios são importantes para a progressão de meduloblastomas Shh para o subtipo que derivam de progenitores granulares do cerebelo em 28, 29. Assim, cílios desempenham papéis importantes durante embrionário, pós-natal, e desenvolvimento neuronal adulto e função.

As células estaminais neurais (NSCs) residem na zona subventricular (SVZ) do ventrículo lateral, na zona subgranular do giro dentado do hipocampo, e azona ventricular do terceiro ventrículo no hipotálamo em mamíferos 30, 31, 32. NSCs são multipotentes, possuem a capacidade de auto-renovação, e são importantes para o desenvolvimento do cérebro e da medicina regenerativa 30. A maioria dos NSC no SVZ são quiescentes e possuem um cílio primário solitário que, em muitos casos, se estende para fora para o ventrículo lateral 33. Os sinais cílio primários através da localização de vários receptores, a indução de respostas celulares a jusante, particularmente em relação a Shh, TGFp, e receptor de tirosina-quinase vias 2, 34, 35, 36. Uma vez que os cílios se estender para o ventrículo lateral,-se a hipótese de que cílios detectar citoquinas no fluido cerebrospinal (CSF) para activar as NSC 37 . Estudos recentes sugerem que a via de sinalização de Shh e cílios são críticos para a activação de células estaminais na reparação e regeneração de vários tecidos, incluindo o epitélio olfactivo, pulmão, rim e 38, 39, 40, 41. No entanto, os mecanismos através dos quais comunica com CSF NSC e se cílios estão envolvidos não são conhecidos. NSC aderentes em cultura são ciliado; localizar os componentes da via, tais como Shh, Smo e Gpr161 em cílios; e são Shh responsivo 42. Assim, NSC pode servir como um importante sistema modelo para o estudo da via de Shh, tráfico ciliar, e vias de diferenciação neuronal. Além disso, a partir de neurónios diferenciados NSC também podem ser utilizadas para ensaios de tráfico ciliar.

As neuroesferas são constituídos por aglomerados de células flutuantes resultantes da proliferação de neural células estaminais / progenitoras que crescem na presença de factores de crescimento específicos e superfícies não adesivos 43, 44. As neuroesferas servir como importante em modelos de cultura in vitro para estudar as células estaminais / progenitoras neurais em desenvolvimento normal e doença 31, 45, 46, 47. Aqui, descrevemos um ensaio baseado em neuroesfera para a cultura de células estaminais / progenitoras neuronais e para a diferenciação em neurónios / glia. Nós particularmente enfatizar o tráfico de sinalização componentes aos cílios de estaminal neuronal / células progenitoras e neurónios diferenciados (Figura 1). Em oposição a cultura de neurónios primários, neuroesferas primárias são relativamente fáceis de cultura, são passíveis de várias passagens e congelamento-descongelamento ciclos, e pode ser submetida a diferenciação em neurónios / glia. Importante, determinou-se que neural derivada-neuroesferaas células estaminais / progenitoras e neurónios diferenciados são ciliadas em cultura e localizar moléculas de sinalização importantes para a função ciliar nestes compartimentos. métodos de cultivo baseadas em Neurosphere pode servir como um sistema modelo ideal para estudar ciliogênese e ciliar tráfico de NSC e neurônios diferenciados.

Protocolo

1. Isolamento de neuroesferas a partir do cérebro do rato adulto

  1. Euthanize um rato adulto (cerca de 2 meses de idade) por uma overdose de isoflurano. Verifique que o rato parou de respirar e dissecar imediatamente após a morte.
  2. Com uma tesoura, faça uma incisão na linha média para abrir o crânio. Remover o cérebro.
  3. Coloque o cérebro em PBS frio num prato de 10 centímetros em gelo. Siga todo-mount o método de dissecação para obter o SVZ do ventrículo lateral 48.
  4. Coloque o ventrículo lateral para um tubo de 1,5 mL, adicionar 500 mL de 0,05% de tripsina-EDTA em PBS, e incubar o tubo durante 15 minutos a 37 ° C em um banho de água.
  5. Após 15 min, adicionar 500 mL de meio de parar e suavemente pipetar 20 - 30 vezes com um ml de uma ponta. Evitar a formação de bolhas de ar durante a pipetagem.
    NOTA: Este passo é fundamental para a sobrevivência da célula.
  6. Girar as células a 500 xg durante 8 minutos. Rejeitar o sobrenadante, adicionar 1 ml de PBS, e ressuspender tele células pipetando suavemente 5x com uma ponta de 1 mL.
  7. Girar a 500 xg durante 8 minutos. Descartar o sobrenadante utilizando uma ponta 1 mL e adicionar 1 ml de meio basal.
  8. (Opcional) Se os restos celulares são observados, passar as células através de um coador de células-70? M.
  9. Contar o número de células com um hemocitómetro; em geral, cerca de 30.000 - são obtidos 60.000 células / SVZ.
  10. Placa as células a partir de uma SVZ num prato de 10 cm, com 10 mL de NSC meio e cultura a 37 ° C com 5% de CO 2.
  11. (Opcional) Para evitar a fusão entre as esferas 49, colocar 1.000 células num único poço de uma placa de ligação de ultra-low-6 poços que é previamente enchido com 1,5 mL de NSC meio e cultura a 37 ° C com 5% de CO 2.
    NOTA: Depois de 5-7 dias, neuroesferas pode ser observado (Figura 2A). O perdo de cultivo pode variar com a idade de rato ou o fundo genético.
  12. Adicionar 2 mL de meio de NSC cada 3-4 dias para manter a cultura(Não remova o meio existente).

2. Análise da capacidade de diferenciação de testes neurospheres e ciliogênese

  1. Para analisar a capacidade de diferenciação, analisar as neuroesferas sob condições aderentes em meio de diferenciação.
  2. Esterilizar 12 mm lamelas redondos por autoclavagem ou com exposição a UV, antes da utilização. Para uma cultura de células aderentes, colocar uma tampa 12 milímetros de vidro redondo esterilizadas em um poço de uma placa de 24 poços sob condições assépticas.
  3. Revestir a tampa de vidro durante 10 segundos com 500 mL de 0,002% de poli-L-lisina (PLL). Aspirar a solução e secá-la durante 10-15 min.
  4. Adicionar 500 uL de solução de laminina (5 ug / mL). Incubar a tampa de vidro, durante 1 h a 37 ° C.
  5. Aspirar a laminina e adicionar 500 mL de meio de diferenciação ou meio de NSC (controlo indiferenciado).
  6. Para o ensaio de diferenciação, escolher-se um de 100 - 200? M esfera com uma ponta de 200 mL sob o microscópio. Adicionar5-10 neuroesferas para cada poço de uma placa de 24 poços e cultura durante 7-10 dias em meio de diferenciao.
  7. Para analisar neuroesferas indiferenciadas, adicionar 5-10 neuroesferas a cada poço de uma placa de 24 poços e a cultura durante 1-2 dias em meio NSC. Neuroesferas ligados espalhar e crescer como uma monocamada (Figura 2B).
  8. Depois de retirar cuidadosamente a forma, fixar as células com paraformaldeído a 4% (PFA) em PBS durante 15 min à temperatura ambiente, e, em seguida, lava-se com PBS duas vezes durante 5 min à TA. A placa pode ser armazenada a 4 ° C durante 1-2 meses.
    NOTA: Para visualizar as células estaminais / progenitoras neurais em meio NSC e células diferenciadas em meio de diferenciação, realizar imunocoloração contra nestina (estaminal neuronal / marcador de células progenitoras), β-tubulina III (monoclonal TUJ1, marcador neuronal), GFAP (proteína glial fibrilar ácida , marcador de astrócitos), e O4 (marcador de oligodendrócitos) (Figura 2B-e). Para analisar os cílios, realizar imunocoloração contra Arl13b (ci primárialia marker) e Gpr161 (GPCR ciliar) (Figura 3).
  9. Montar o vidro de cobertura com uma solução a montagem em uma lâmina de vidro. Inclinar a lâmina de vidro para remover o excesso de solução.

3. Análise da ciliogênese em neuroesferas

  1. Para analisar as células em neuroesferas intactas por imunocoloração, transferência 1 mL de meio de cultura contendo múltiplos neuroesferas para um tubo de 1,5 ml e girar a 500 xg durante 8 minutos. Fixar as esferas com 4% (PFA) após a remoção do meio durante 15 minutos e lavar com PBS. Girar as esferas a 500 xg durante 8 minutos, remover o sobrenadante, e incuba-se as esferas de O / N com 30% de sacarose a 4 ° C.
  2. Descartar o sobrenadante utilizando uma ponta 1 ml e adicionar 500 uL de solução de outubro utilizando uma ponta de corte de 1 mL. Cortar a extremidade da ponta para alargar a abertura, como OCT é viscosa.
  3. Transferir a solução de outubro contendo as neuroesferas num molde de plástico descartável de congelação (10 mm x 10 mm x 5 mm).
  4. Congelar a midade em gelo seco durante pelo menos 15 min.
  5. (Opcional) Parar a experiência e armazenar o molde num congelador de -80 ° C durante até 1 ano.
  6. Corte as secções com um criostato; a espessura das secções deve ser de 15-30 | im.
  7. Para visualizar o cílios num neuroesfera, realizar imunocoloração contra Arl13b (Figura 4).

4. Cultura e Passagem de neuroesferas e NSC aderentes

  1. Passagem as neuroesferas enquanto o tamanho da esfera situa-se entre 100-200? M; quando as neuroesferas são muito grandes (300 mm ou acima), eles não são ideais para experimentos.
  2. Transferir as neuroesferas num tubo de 50 mL utilizando uma ponta 1 mL e girar a 500 xg durante 8 minutos.
  3. Descartar o sobrenadante utilizando um aspirador, adicionar 500 mL de 0,05% de tripsina-EDTA em PBS, e incubar durante 5 min a 37 ° C. A quantidade de tripsina varia dependendo do número de esferas.
  4. Adicionar 500 uL de meio com soro e suavemente tubot 20 vezes com um ml de uma ponta.
  5. Girar a 500 xg durante 8 minutos. Descartar o sobrenadante utilizando uma ponta 1 mL e adicionar 1 ml de meio basal.
  6. (Opcional) Se os restos celulares ou sem dissociar neuroesferas são vistas, passar as células através de um coador de células-70? M.
  7. Passagem as células em um prato de 10 centímetros a uma densidade de 10.000 células / cm2 em meio de NSC; as células estará pronto para a próxima passagem depois de uma semana.
  8. (Opcional) Para congelar as células, adicionar meio de congelação para gerar 500.000 a 1.000.000 de células / mL de suspensão. Congelar as células utilizando recipientes de congelamento de crio; neurospheres sem dissociar também pode ser congelado.
  9. Para a cultura aderente, dillute as células a 50.000 células / cm2 em PLL- e lamelas com meio de cultura e NSC, Laminina-revestidos durante 1-2 dias.

5. A fome e Análise de Cilia

  1. Prepare meio de privação (Tabela 1).
  2. 1-2 dias após o pl inicialating de células aderentes após dissociação, mudança para meio NSC em um poço (controlo) e em meio de privação outro poço (experimento).
  3. Cultura das células aderentes para 24 h.
  4. Fixar as células com PFA a 4% em PBS durante 15 min à temperatura ambiente e lava-se duas vezes com PBS durante 5 minutos cada à temperatura ambiente.
  5. (Opcional) Parar a experiência e armazenar as placas de 24 cavidades com lamelas em PBS a 4 ° C durante 1-2 meses.
  6. Executar um protocolo para a coloração de imunofluorescência 7, 50.
  7. Montar as lamelas utilizando solução de montagem. Seca-se a lâmina de vidro O / N à temperatura ambiente no escuro.
  8. Adquirir imagens de um microscópio composto na ampliação necessário. Usar um microscópio, uma câmara e objectivos (40X / 1,3 óleo e 63X / 1,4 óleo), controlada usando o software acompanhada. Tome-z secções suficientes no 0,5-0,8? M intervalos (Figura 5).
  9. Para a análise quantitativa de localização em ciliarcélulas aderentes, pilhas de adquirir imagens de 3-8 campos consecutivos com células confluentes por olhando para dentro do canal DAPI. Quantificar o número de cílios utilizando o ImageJ / Fiji. Normalmente, use o "Contador de células" ferramenta no ImageJ Plugins> caixa de diálogo para contar as células com cílios GPCR positivo Analisar; projecções máximas de pilhas de imagens também podem ser exportadas a partir de ImageJ / Fiji.Use semelhante intensidade da imagem e parâmetros de contraste para todas as imagens da mesma experiência para fins de exportação e contagem.

6. Transfecção de neuroesferas

  1. Aderem dissociado células para lamelas durante 24 h. Usar uma densidade celular tipicamente entre 75.000 e 150.000 células em meio de 500 mL de NSC num único poço de uma placa de 24 poços.
  2. Misturar 25? L de meio de soro reduzido e 1,5 mL de reagente de transfecção em um mL microtubo de 0,5 em vortex durante 5 segundos.
  3. Adicionar 2,5 ug de ADN de plasmídeo isento de endotoxina a um 0,5 mL microtub separadoe contendo 25 uL de meio de soro reduzido e misturar em vortex durante 5 segundos.
  4. Adicionar 1 mL de reagente de transfecção para o segundo ADN microtubo contendo e misturar em vortex durante 5 segundos.
  5. Adicionar a mistura a partir do tubo que contém ADN para o primeiro microtubo e misturar por pipetagem.
  6. Incubar a mistura durante 10-15 minutos à temperatura ambiente. Após a incubação, adicionar gota a gota cuidadosamente a mistura de transfecção às cavidades no topo do meio de NSC (500 / po).
  7. Mudar a forma 24 h pós-transfecção para controlar o meio (meio NSC) ou meio de fome (500 / po).
  8. Fixar as células, alterando a forma de PFA a 4% após 24 h e executar imunocoloração; tipicamente, até uma eficiência de transfecção de 10% é obtido usando este protocolo.

Resultados

Depois de plaqueamento das células a partir do SVZ em meio NSC durante uma semana, neuroesferas flutuantes foram observados (Figura 2A). Os tamanhos das esferas variou entre 50 e 200 um. Para examinar se as esferas foram derivados a partir de células estaminais / progenitoras neurais, as neuroesferas foram plaqueadas em lamelas e PLL- em meio NSC Laminina-revestido durante 2 dias. Eles foram então imunocoradas em relação ao marcador / células progenitoras estaminai...

Discussão

Aqui, descrevemos um método para gerar e manter culturas de neuroesferas de SVZ adulto mouse. Alguns pontos pertinentes sobre as culturas são as seguintes. Em primeiro lugar, as dimensões das esferas estão tipicamente entre 50-200? M. Em nossa experiência, quando um neurosphere fica maior do que 300 mm de diâmetro, o tempo ideal para passaging foi perdida. Estas esferas maiores contêm células mortas no núcleo. Em segundo lugar, como neuroesferas são comumente usados ​​para estudar as células estaminais / ...

Divulgações

The authors declare no competing financial interests.

Agradecimentos

Work in S.M.'s laboratory is funded by recruitment grants from CPRIT (R1220) and NIH (1R01GM113023-01).

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
12 mm round cover glassFisherbrand12-545-80 
24-well plateFalcon353047
4% paraformaldehyde (PFA)Affymetrix19943
50 mL tubeFalcon352098
95 mm x 15 mm petri dish, slippable lidFisherbrandFB0875714G10 cm dish
70 µm cell strainerFalcon352350
Alexa Fluor 488 Affinipure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson Immunoresearch711-545-152Donkey anti Rabbit, Alexa 488 secondary antibody
Arl13B, Clone N295B/66NeuromabAB_11000053
B-27 Supplement (50X), serum freeThermoFisher Scientific17504001B27
CentrifugeThermo scientificST 40R
Cryogenic vialCorning430488
DAPISigmaD9542-10MG
Deoxyribonuclease I from bovine pancreaseSigmaD5025-15KUDnase I
Dimethyl sulfoxideSigmaD8418-100MLDMSO
Disposable Vinyl Specimen MoldsSakura Tissue-Tek Cryomold456510 mm x 10 mm x 5 mm
Dulbecco's Phosphate-buffered Saline 10X, Modified, without calcium chloride and magnesium chloride, liquid, sterile-filtered, suitable for cell cultureSigmaD1408-500MLDPBS
Dumont #5 ForcepsFine science tools11254-20
Fetal Bovine Serum (FBS)SigmaF9026-500ML
Fluoromount-G solutionSouthern Biotech0100-01mounting solution
GFAPDAKOZ0334
Goat anti Mouse IgG1 Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugateThermoFisher ScientificA-21127Goat anti Mouse IgG1, Alexa 555 secondary antibody
Goat anti Mouse IgG2a Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugateThermoFisher ScientificA-21137Goat anti Mouse IgG2a, Alexa 555 secondary antibody
Gpr161home madeN/A
human bFGFSigmaF0291FGF
hemocytometerHausser Scientific0.100 mm deepimproved neubauer
IsothesiaHenry ScheinNDC 11695-0500-2Isofluorane
Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm Sarcoma basement membraneSigmaL2020Laminin
L-Glutamine (200 mM)SigmaG7513
Lipofectamine 3000 Transfection ReagentThermoFisher ScientificL3000
Mr. FrostyNalgene 5100-0036
N-2 supplement (100X)ThermoFisher Scientific17502001N2
Neurobasal mediumGibco21103-049
Normal Donkey SerumJackson ImmunoResearch017-000-121
OCT compoundSakura Tissue-Tek4583OCT
Penicillin-StreptomycinSigmaP4333-100ML
Poly-L-Lysine (PLL)SigmaP4707
Recombinant human EGF protein, CFR and D systems236-EG-200EGF
ScissorFine science tools14060-10
Superfrost plus microscope slideFisher scientific12-550-15slides
Triton X-100Bio-Rad161-0407
Trypsin-EDTA solution (10X)SigmaT4174-100Trypsin
COSTAR 6-Well Plate, With Lid Flat Bottom Ultra-Low Attachment Surface Polystyrene, SterileCorning3471ultra-low binding 6-well plate
β-tubulin IIICovanceMMS-435PTUJ1

Referências

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