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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Cilium principale è di fondamentale importanza nella proliferazione delle cellule progenitrici neurali, la differenziazione neuronale e la funzione neuronale adulta. Qui, si descrive un metodo per studiare ciliogenesis e il traffico di segnalazione proteine ​​di cilia nelle cellule staminali / progenitrici neurali e neuroni differenziati utilizzando colture di neurosfere primarie.

Abstract

The primary cilium is fundamentally important for the proliferation of neural stem/progenitor cells and for neuronal differentiation during embryonic, postnatal, and adult life. In addition, most differentiated neurons possess primary cilia that house signaling receptors, such as G-protein-coupled receptors, and signaling molecules, such as adenylyl cyclases. The primary cilium determines the activity of multiple developmental pathways, including the sonic hedgehog pathway during embryonic neuronal development, and also functions in promoting compartmentalized subcellular signaling during adult neuronal function. Unsurprisingly, defects in primary cilium biogenesis and function have been linked to developmental anomalies of the brain, central obesity, and learning and memory deficits. Thus, it is imperative to study primary cilium biogenesis and ciliary trafficking in the context of neural stem/progenitor cells and differentiated neurons. However, culturing methods for primary neurons require considerable expertise and are not amenable to freeze-thaw cycles. In this protocol, we discuss culturing methods for mixed populations of neural stem/progenitor cells using primary neurospheres. The neurosphere-based culturing methods provide the combined benefits of studying primary neural stem/progenitor cells: amenability to multiple passages and freeze-thaw cycles, differentiation potential into neurons/glia, and transfectability. Importantly, we determined that neurosphere-derived neural stem/progenitor cells and differentiated neurons are ciliated in culture and localize signaling molecules relevant to ciliary function in these compartments. Utilizing these cultures, we further describe methods to study ciliogenesis and ciliary trafficking in neural stem/progenitor cells and differentiated neurons. These neurosphere-based methods allow us to study cilia-regulated cellular pathways, including G-protein-coupled receptor and sonic hedgehog signaling, in the context of neural stem/progenitor cells and differentiated neurons.

Introduzione

Cilio primario è un compartimento subcellulare dinamica microtubuli-based che funziona come antenna sensoriale nel coordinare percorsi di segnalazione cellulare, tra cui la via di Sonic Hedgehog (Shh) durante lo sviluppo embrionale neuronale 1, 2, e compartimentato segnalazione subcellulare nell'adulto funzione neuronale 3, 4 . Segnalazione componenti di queste vie, come il recettore Patched Shh 5; la via attivatore Smoothened (SMO) 6; e Gpr161 7, un recettore orfano accoppiato alla proteina G (GPCR) che regola negativamente il pathway Shh, localizzarsi a cilia in modo dinamico. GPCR Molteplici sono stati segnalati per localizzare alle ciglia nei neuroni nel cervello 7, 8, 9, 10 sup>, 11, 12, 13, 14, 15, 16. Difetti di cilia e vie di segnalazione cilia generata influenzano molteplici tessuti e sono noti collettivamente come ciliopatie 17, 18, 19. Lo spettro malattia ciliopathy frequentemente include difetti neurologico, quali difetti craniofacciali 20, 21, 22. Inoltre, ciglia primarie nei neuroni ipotalamici regolare percorsi sazietà centrali, e difetti provocare obesità centrale 23, mirroring obesità in ciliopatie sindromici come Bardet Biedel sindrome 24. Inoltre, recettore neuropeptide segnalazione in cilia regola centrAl sazietà Percorsi di 11, 14. Localizzazione ciliare ciclasi III (ACIII) e GPCR come recettore della somatostatina 3 in neuroni ippocampali provocare difetti di riconoscimento dell'oggetto nuovi e deficit di memoria 25, 26 e parallela una mancanza di integrità ciliare 27. Gli aspetti dello sviluppo di segnalazione cilia generati sono strettamente legate alla omeostasi tissutale; in particolare, cilia sono importanti per la progressione di medulloblastomas Shh-sottotipo derivanti da progenitori dei granuli nel cervelletto 28, 29. Così, cilia primarie svolgono un ruolo importante durante embrionale, postnatale e adulta sviluppo e la funzione neuronale.

Neurali cellule staminali (NSC) risiedono nella zona sottoventricolare (SVZ) del ventricolo laterale, la zona subgranulare del giro dentato dell'ippocampo, ezona ventricolare del terzo ventricolo nell'ipotalamo nei mammiferi 30, 31, 32. NSC sono multipotenti, possiedono la capacità di auto-rinnovamento, e sono importanti per lo sviluppo del cervello e la medicina rigenerativa 30. La maggior parte NSC nella SVZ sono quiescenti e possiedono un cilium primario solitaria che, in molti casi, si estende verso il ventricolo laterale 33. I segnali cilium primarie tramite la localizzazione dei vari recettori, inducendo risposte cellulari a valle, in particolare in relazione alla Shh, TGFp, e del recettore tirosina chinasi vie 2, 34, 35, 36. Poiché cilia primarie estendono nel ventricolo laterale, si ipotizza che cilia primaria rilevare citochine nel liquido cerebrospinale (CSF) per attivare NSC 37 . Studi recenti suggeriscono che la via di segnalazione Shh e ciglia primarie sono fondamentali per l'attivazione delle cellule staminali nella riparazione e rigenerazione di tessuti multipli, tra l'epitelio olfattivo, polmone, rene e 38, 39, 40, 41. Tuttavia, i meccanismi mediante i quali CSF comunica con NSC e se cilia primaria sono coinvolti non sono noti. NSC aderenti in coltura sono ciliato; localizzare componenti della via Shh, come Smo e Gpr161 in cilia; e sono Shh reattivo 42. Così, NSC possono servire come un importante sistema modello per studiare il percorso Shh, il traffico ciliare, e percorsi di differenziazione neuronale. Inoltre, i neuroni differenziati da NSC possono essere utilizzati anche per saggi traffico ciliare.

Neurosfere sono costituiti da gruppi di cellule fluttuanti derivanti dalla proliferazione di neural cellule staminali / progenitrici che crescono in presenza di fattori di crescita specifici e superfici non adesivo 43, 44. Neurosfere servono come importante in modelli di coltura in vitro per studiare le cellule staminali / progenitrici neurali nello sviluppo normale e malattie 31, 45, 46, 47. Qui, descriviamo un saggio neurosfere-based per la coltura di cellule progenitrici / staminali neurali e di differenziazione in neuroni / glia. Si sottolinea in particolare il traffico di segnalazione componenti cilia di staminali neurali / cellule progenitrici e neuroni differenziati (Figura 1). Al contrario di coltura neuroni primari, neurosfere primarie sono relativamente facili da coltura, sono suscettibili di passaggi multipli e congelare-disgelo, e possono differenziarsi in neuroni / glia. È importante sottolineare che abbiamo stabilito che neurale neurosfere di derivazionecellule staminali / progenitrici e neuroni dissociati sono Ciliated in coltura e localizzare molecole di segnalazione relativi alla funzione ciliare in questi compartimenti. i metodi di coltura neurosfere-based può servire come un sistema modello ideale per lo studio del traffico ciliogenesis e ciliare in NSC e neuroni differenziati.

Protocollo

1. Isolamento di neurosfere dal cervello di topo per adulti

  1. Euthanize un topo adulto (circa 2 mesi) per una dose eccessiva di isoflurano. Fare doppio verificare che il mouse ha smesso di respirare e sezionare immediatamente dopo la morte.
  2. Utilizzando le forbici, fare un'incisione mediana per aprire il cranio. Rimuovere il cervello.
  3. Mettere il cervello in PBS freddo in un piatto di 10 centimetri sul ghiaccio. Seguire tutta montaggio metodo dissezione avere la SVZ dal ventricolo laterale 48.
  4. Posizionare il ventricolo laterale in una provetta da 1,5 ml, aggiungere 500 ml di 0,05% tripsina-EDTA in PBS, e incubare la provetta per 15 minuti a 37 ° C in un bagno d'acqua.
  5. Dopo 15 minuti, aggiungere 500 ml di media arresto e pipettare delicatamente 20 - 30 volte con una punta ml 1. Evitare la formazione di bolle d'aria durante il pipettamento.
    NOTA: Questo passaggio è fondamentale per la sopravvivenza delle cellule.
  6. Spin giù le cellule a 500 xg per 8 minuti. Eliminare il surnatante, aggiungere 1 ml di PBS e risospendere tegli cellule pipettando gentilmente 5x con una punta mL 1.
  7. Spin down a 500 xg per 8 minuti. Eliminare il surnatante utilizzando un mL punta 1 e aggiungere 1 ml di terreno di base.
  8. (Facoltativo) Se si osservano detriti cellulari, passare le cellule attraverso una cella di 70 micron-filtro.
  9. Contare il numero di cellule con un emocitometro; in generale, circa 30.000 - 60.000 cellule / SVZ si ottengono.
  10. Piastra le cellule da una SVZ in 10 cm piatto con 10 ml di terreno di coltura e NSC a 37 ° C con 5% di CO 2.
  11. (Opzionale) Per evitare la fusione tra le sfere 49, mettere a 1000 cellule in un singolo pozzetto di una piastra da 6 pozzetti bassissimo legame che è preriempita con 1,5 ml di terreno di coltura e NSC a 37 ° C con 5% di CO 2.
    NOTA: Dopo 5-7 giorni, neurosfere possono essere osservati (Figura 2A). Il periodo di coltura può essere diverso con l'età del mouse o il background genetico.
  12. Aggiungere 2 ml di terreno NSC ogni 3-4 giorni per mantenere la cultura(Non rimuovere il supporto esistente).

2. Analisi della Capacità Differenziazione di neurosfere e Ciliogenesis Test

  1. Per analizzare la capacità di differenziazione, analizzare le neurosfere in condizioni aderenti in terreno di differenziazione.
  2. Sterilizzare 12 mm coprioggetto tondo in autoclave o con l'esposizione ai raggi UV prima dell'uso. Per una cultura di cellule aderenti, mettere un bicchiere coperchio tondo 12 millimetri sterilizzati in un pozzetto di una piastra da 24 pozzetti in condizioni asettiche.
  3. Rivestire il vetro di copertura per 10 s con 500 microlitri di 0,002% di poli-L-lisina (PLL). Aspirare la soluzione e asciugare per 10-15 min.
  4. Aggiungere 500 ml di soluzione di laminina (5 mg / mL). Incubare il vetro di copertura per 1 ora a 37 ° C.
  5. Aspirare il laminina e aggiungere 500 ml di mezzo di differenziazione o medio NSC (controllo indifferenziata).
  6. Per il saggio di differenziazione, prendere un 100-200 micron sfera con una punta di 200 microlitri sotto il microscopio. Inserisci5-10 neurospheres a ciascun pozzetto di una piastra da 24 pozzetti e coltura per 7-10 giorni in terreno di differenziamento.
  7. Per analizzare neurosfere indifferenziate, aggiungere 5-10 neurosfere a ciascun pozzetto di una piastra e coltura a 24 pozzetti per 1-2 giorni in media NSC. Neurosfere allegate diffondere e crescere come monostrato (Figura 2B).
  8. Dopo aver rimosso attentamente il mezzo, fissare le cellule con 4% paraformaldeide (PFA) in PBS per 15 minuti a RT, e poi lavare con PBS due volte per 5 minuti a temperatura ambiente. La piastra può essere conservato a 4 ° C per 1-2 mesi.
    NOTA: per visualizzare le cellule staminali / progenitrici neurali in media NSC e cellule differenziate in terreno di differenziamento, eseguire immunostaining contro Nestin (staminali neurali / marcatore di cellule progenitrici), β-tubulina III (TUJ1 monoclonale, marcatore neuronale), GFAP (fibrillare gliale Acidic Protein , marcatore astrociti), e O4 (marcatore oligodendrociti) (Figura 2B-e). Per analizzare le ciglia, eseguire immunostaining contro Arl13b (CI primariolia marker) e Gpr161 (GPCR ciliare) (Figura 3).
  9. Montare il vetro di copertura con soluzione di montaggio su un vetrino. Inclinare il vetrino per rimuovere la soluzione in eccesso.

3. Analisi di Ciliogenesis in Neurosfere

  1. Per analizzare cellule in neurosfere intatte mediante immunocolorazione, trasferimento 1 ml di terreno di coltura contenente più neurospheres ad una provetta da 1,5 ml e centrifugare a 500 xg per 8 min. Fissare le sfere con 4% (PFA) dopo aver rimosso il mezzo per 15 minuti e lavare con PBS. Spin down sfere a 500 xg per 8 minuti, rimuovere il surnatante e incubare le sfere O / N con 30% saccarosio a 4 ° C.
  2. Eliminare il surnatante utilizzando un mL punta 1 e aggiungere 500 ml di soluzione di ottobre con un taglio di 1 punta mL. Tagliare il bordo della punta di allargare l'apertura, come PTOM viscoso.
  3. Trasferire la soluzione contenente i Ottobre neurosfere in uno stampo di plastica monouso di congelamento (10 mm x 10 mm x 5 mm).
  4. Congelare il mvecchio in ghiaccio secco per almeno 15 min.
  5. (Opzionale) interrompere l'esperimento e memorizzare lo stampo in un congelatore C -80 ° fino a 1 anno.
  6. Tagliare le sezioni con un criostato; lo spessore delle sezioni deve essere di 15-30 um.
  7. Per visualizzare le ciglia primario in un neurosfere, eseguire immunostaining contro Arl13b (Figura 4).

4. Cultura e Passaggio di neurosfere e NSC aderenti

  1. Passage le neurosfere mentre la dimensione della sfera è tra 100-200 micron; quando le neurosfere sono troppo grandi (300 micron o superiore), non sono l'ideale per gli esperimenti.
  2. Trasferire le neurosfere in un tubo da 50 ml usando una punta mL 1 e centrifugare a 500 xg per 8 min.
  3. Scartare il surnatante mediante un aspiratore, aggiungere 500 ml di 0,05% tripsina-EDTA in PBS, e incubare per 5 min a 37 ° C. La quantità di tripsina varia a seconda del numero di sfere.
  4. Aggiungere 500 microlitri di media siero e delicatamente il tubot 20 volte con una punta mL 1.
  5. Spin down a 500 xg per 8 minuti. Eliminare il surnatante utilizzando un mL punta 1 e aggiungere 1 ml di terreno di base.
  6. (Opzionale) Se detriti cellulari o indissociate neurosfere si vedono passare le cellule attraverso una cella di 70 micron-filtro.
  7. Passaggio le cellule in 10 cm piatto ad una densità di 10.000 cellule / cm 2 in media NSC; le cellule saranno pronti per il prossimo passo, dopo una settimana.
  8. (Facoltativo) Per congelare le cellule, aggiungere il congelamento medio di generare 500.000 a 1.000.000 cellule / ml sospensione. Congelare le cellule utilizzando contenitori crio-congelamento; neurosfere indissociate possono anche essere congelati.
  9. Per la coltura aderente, dillute le cellule a 50.000 cellule / cm 2 sul PLL- e coprioggetto con media NSC e cultura laminina rivestite per 1-2 giorni.

5. La fame e analisi di Cilia

  1. Preparare mezzo inedia (Tabella 1).
  2. 1-2 giorni dopo l'iniziale plCORTEGGIAMENTO di cellule aderenti dopo la dissociazione, il cambiamento medio NSC in un pozzetto (controllo) e media fame in un altro pozzo (esperimento).
  3. Coltura le cellule aderenti per 24 h.
  4. Fissare le cellule con 4% PFA in PBS per 15 minuti a RT e lavare due volte con PBS per 5 minuti ciascuno a RT.
  5. (Opzionale) interrompere l'esperimento e memorizzare le piastre a 24 pozzetti con coprioggetto in PBS a 4 ° C per 1-2 mesi.
  6. Eseguire un protocollo di immunofluorescenza per la colorazione 7, 50.
  7. Montare i coprioggetti con soluzione di montaggio. Asciugare il vetrino O / N a temperatura ambiente al buio.
  8. Acquisire immagini su un microscopio composto all'ingrandimento necessario. Utilizzare un microscopio, una macchina fotografica, e gli obiettivi (40X / 1.3 olio e 63X / 1.4 olio), controllata utilizzando il software accompagnato. Prendere sufficienti z sezioni a 0,5-0,8 micron intervalli (Figura 5).
  9. Per l'analisi quantitativa della localizzazione in ciliarecellule aderenti, acquisiscono pile di immagini dal 3-8 campi consecutivi con cellule confluenti, cercando nel canale DAPI. Quantificare il numero di ciglia primarie utilizzando ImageJ / Figi. In genere, utilizzare la funzione "contatore cella" nel ImageJ Plugin> Analizzare finestra di dialogo per contare le cellule con cilia GPCR-positivi; proiezioni massime da pile di immagini possono essere esportati da ImageJ / Fiji.Use simile intensità dell'immagine ei parametri di contrasto per tutte le immagini dello stesso esperimento per il conteggio e scopi esportazione.

6. La trasfezione di neurosfere

  1. Aderire dissociato cellule di vetrini per 24 h. Utilizzare una densità cellulare tipicamente tra 75.000 e 150.000 cellule in 500 microlitri di NSC media in un singolo pozzetto di una piastra da 24 pozzetti.
  2. Mescolare 25 ml di mezzo di siero ridotto e 1,5 ml di reagente di trasfezione in un mL microtubo 0,5 vortex per 5 s.
  3. Aggiungere 2,5 mg di DNA plasmidico privo di endotossine ad un separato 0,5 ml microtube contenente 25 ml di mezzi di siero ridotto e mescolare nel vortex per 5 s.
  4. Aggiungere 1 ml di reagente di trasfezione al secondo DNA provetta contenente e mescolare nel vortex per 5 s.
  5. Aggiungere il composto dal tubo di DNA contenenti alla prima provetta e mescolare pipettando.
  6. Incubare la miscela per 10-15 minuti a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, aggiungere delicatamente la goccia a goccia mix trasfezione ai pozzetti in cima alla media NSC (500 pl / pozzetto).
  7. Cambiare il mezzo 24 h dopo la trasfezione per il controllo di media (media NSC) o medio fame (500 pl / pozzetto).
  8. Fissare le cellule cambiando il mezzo di 4% PFA dopo 24 he eseguire immunostaining; tipicamente, fino ad un'efficienza di transfezione 10% è ottenuto usando questo protocollo.

Risultati

Dopo la placcatura le cellule dalla SVZ in terreno NSC per una settimana, neurosfere galleggianti sono stati osservati (Figura 2A). Le dimensioni delle sfere variavano tra 50 e 200 um. Per esaminare se le sfere sono state derivate da cellule staminali / progenitrici neurali, le neurosfere furono piastrate su PLL- e coprioggetto in terreno NSC laminina rivestite per 2 giorni. Sono stati poi immunostained contro il marcatore staminali / progenitrici neurali delle cellule, ...

Discussione

Qui, descriviamo un metodo per generare e mantenere colture di neurosfere da SVZ topo adulto. Alcuni punti pertinenti riguardanti le culture sono i seguenti. In primo luogo, le dimensioni delle sfere sono tipicamente tra 50 - 200 um. Nella nostra esperienza, quando un neurosfere diventa più grande di 300 micron di diametro, il momento ottimale per passaging è stato mancato. Queste sfere più grandi contengono cellule morte nel nucleo. In secondo luogo, come neurosfere sono comunemente usati per studiare le cellule sta...

Divulgazioni

The authors declare no competing financial interests.

Riconoscimenti

Work in S.M.'s laboratory is funded by recruitment grants from CPRIT (R1220) and NIH (1R01GM113023-01).

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
12 mm round cover glassFisherbrand12-545-80 
24-well plateFalcon353047
4% paraformaldehyde (PFA)Affymetrix19943
50 mL tubeFalcon352098
95 mm x 15 mm petri dish, slippable lidFisherbrandFB0875714G10 cm dish
70 µm cell strainerFalcon352350
Alexa Fluor 488 Affinipure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson Immunoresearch711-545-152Donkey anti Rabbit, Alexa 488 secondary antibody
Arl13B, Clone N295B/66NeuromabAB_11000053
B-27 Supplement (50X), serum freeThermoFisher Scientific17504001B27
CentrifugeThermo scientificST 40R
Cryogenic vialCorning430488
DAPISigmaD9542-10MG
Deoxyribonuclease I from bovine pancreaseSigmaD5025-15KUDnase I
Dimethyl sulfoxideSigmaD8418-100MLDMSO
Disposable Vinyl Specimen MoldsSakura Tissue-Tek Cryomold456510 mm x 10 mm x 5 mm
Dulbecco's Phosphate-buffered Saline 10X, Modified, without calcium chloride and magnesium chloride, liquid, sterile-filtered, suitable for cell cultureSigmaD1408-500MLDPBS
Dumont #5 ForcepsFine science tools11254-20
Fetal Bovine Serum (FBS)SigmaF9026-500ML
Fluoromount-G solutionSouthern Biotech0100-01mounting solution
GFAPDAKOZ0334
Goat anti Mouse IgG1 Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugateThermoFisher ScientificA-21127Goat anti Mouse IgG1, Alexa 555 secondary antibody
Goat anti Mouse IgG2a Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugateThermoFisher ScientificA-21137Goat anti Mouse IgG2a, Alexa 555 secondary antibody
Gpr161home madeN/A
human bFGFSigmaF0291FGF
hemocytometerHausser Scientific0.100 mm deepimproved neubauer
IsothesiaHenry ScheinNDC 11695-0500-2Isofluorane
Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm Sarcoma basement membraneSigmaL2020Laminin
L-Glutamine (200 mM)SigmaG7513
Lipofectamine 3000 Transfection ReagentThermoFisher ScientificL3000
Mr. FrostyNalgene 5100-0036
N-2 supplement (100X)ThermoFisher Scientific17502001N2
Neurobasal mediumGibco21103-049
Normal Donkey SerumJackson ImmunoResearch017-000-121
OCT compoundSakura Tissue-Tek4583OCT
Penicillin-StreptomycinSigmaP4333-100ML
Poly-L-Lysine (PLL)SigmaP4707
Recombinant human EGF protein, CFR and D systems236-EG-200EGF
ScissorFine science tools14060-10
Superfrost plus microscope slideFisher scientific12-550-15slides
Triton X-100Bio-Rad161-0407
Trypsin-EDTA solution (10X)SigmaT4174-100Trypsin
COSTAR 6-Well Plate, With Lid Flat Bottom Ultra-Low Attachment Surface Polystyrene, SterileCorning3471ultra-low binding 6-well plate
β-tubulin IIICovanceMMS-435PTUJ1

Riferimenti

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