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요약

일차 섬모 신경 전구 세포의 증식, 신경 세포 분화, 성인 신경 기능에 근본적으로 중요하다. 여기서 우리는 ciliogenesis 및 기본 neurosphere 문화를 사용하여 신경 줄기 / 전구 세포 및 분화 된 신경 세포의 섬모에 신호 단백질의 인신 매매를 연구하는 방법을 설명합니다.

초록

The primary cilium is fundamentally important for the proliferation of neural stem/progenitor cells and for neuronal differentiation during embryonic, postnatal, and adult life. In addition, most differentiated neurons possess primary cilia that house signaling receptors, such as G-protein-coupled receptors, and signaling molecules, such as adenylyl cyclases. The primary cilium determines the activity of multiple developmental pathways, including the sonic hedgehog pathway during embryonic neuronal development, and also functions in promoting compartmentalized subcellular signaling during adult neuronal function. Unsurprisingly, defects in primary cilium biogenesis and function have been linked to developmental anomalies of the brain, central obesity, and learning and memory deficits. Thus, it is imperative to study primary cilium biogenesis and ciliary trafficking in the context of neural stem/progenitor cells and differentiated neurons. However, culturing methods for primary neurons require considerable expertise and are not amenable to freeze-thaw cycles. In this protocol, we discuss culturing methods for mixed populations of neural stem/progenitor cells using primary neurospheres. The neurosphere-based culturing methods provide the combined benefits of studying primary neural stem/progenitor cells: amenability to multiple passages and freeze-thaw cycles, differentiation potential into neurons/glia, and transfectability. Importantly, we determined that neurosphere-derived neural stem/progenitor cells and differentiated neurons are ciliated in culture and localize signaling molecules relevant to ciliary function in these compartments. Utilizing these cultures, we further describe methods to study ciliogenesis and ciliary trafficking in neural stem/progenitor cells and differentiated neurons. These neurosphere-based methods allow us to study cilia-regulated cellular pathways, including G-protein-coupled receptor and sonic hedgehog signaling, in the context of neural stem/progenitor cells and differentiated neurons.

서문

일차 섬모는 미세 소관 기반의 동적 세포 내 구획하다는 태아 신경원 발달 (1, 2) 동안 소닉 헤지 호그 (쉬) 경로를 비롯한 세포 신호 전달 경로를 조정 감각 안테나, 성인 신경 기능 3 실형 세포 내 시그널링 4로서 기능 . 예 5 패치 (patch) 쉬 수용체 이들 경로의 구성 요소를 시그널링; 통로 활성제 평활화 (SMO) 6; 및 Gpr161 7 부정적인 쉬 경로를 조절 고아 G 단백질 연결 수용체 (GPCR)가 동적 방식으로 속눈썹에 지역화. 다수의 GPCR은 10 뇌 7, 8, 9에서 신경 세포의 섬모에 지역화보고되었다 SUP> 11, 12, 13, 14, 15, 16. 섬모 및 섬모 생성 신호 전달 경로의 여러 결함이 조직에 영향을 총칭 ciliopathies 17, 18, 19로 알려져있다. ciliopathy 질환 스펙트럼 흔히 안면 이상 20, 21, 22 등의 신경 발달 결함을 포함한다. 또한, 시상 하부 뉴런의 일차 섬모 중앙 포만 경로를 조정하고 결함 등 Bardet Biedel 증후군 24 syndromic ciliopathies 비만 미러링 복부 비만 23 초래한다. 또한, 시그널링 섬모 신경 펩타이드 수용체를 조절 CENTR알 물림 14, 11 경로. 예컨대 해마 뉴런 소마토스타틴 수용체 3과 아데 닐 레이트 사이 클라 III (ACIII)의 GPCR과의 섬모 제이션은 새로운 물체 인식 결함 25, 26 기억력 결핍의 결과와 모양체 (27)의 완전성이 부족 평행. 섬모 생성 시그널링 발달 측면 밀접 조직 항상성에 연결된다; 특히, 섬모는 소뇌 (28), (29)에서 과립 전구 세포에서 발생하는 쉬 - 서브 타입 medulloblastomas의 진행에 중요하다. 따라서, 차 섬모는 배아, 출생, 성인 신경 개발 및 기능 중에 중요한 역할을한다.

신경줄 기세포 (NSCs의)의 뇌실 영역 측뇌실의 (SVZ), 해마의 치아 이랑 (dentate gyrus)의 subgranular 영역 및 상주포유류 30, 31, 32 시상 하부에서의 제 3 뇌실 심실 영역. 관한 지표는 다 능성 있습니다 자기 갱신 능력을 소유하고, 두뇌 발달 및 재생 의학 (30)에 대한 중요하다. SVZ에서 대부분 관한 지표가 대기하고, 많은 경우에, 측면 뇌실 (33)에게 확장하는 고독한 차 섬모를 가지고있다. 특히 쉬, TGFβ 및 수용체 티로신 키나제 경로 2, 34, 35, 36에 대하여 하류 세포 반응을 유도하는 다양한 수용체의 위치 파악을 통해 일차 섬모 신호. 일차 섬모가 측뇌실 내로 연장하기 때문에,이 일차 섬모는 뇌척수액 (CSF) 37 NSCs을 활성화하는 사이토 카인이 검출되는 것으로 가정 까지. 최근의 연구는 쉬 신호 전달 경로 및 기본 섬모는 후각 상피 세포, 폐, 신장 38, 39, 40, 41 등의 여러 조직의 수리에 줄기 세포의 활성화 및 재생을위한 중요한 것이 좋습니다. 그러나, CSF 의해 NSCs의 메커니즘과 통신 일차 섬모 여부를 알 수없는 관여한다. 문화 자기편 관한 지표는 섬모된다 이러한 섬모의 SMO 및 Gpr161로 쉬 경로 구성 요소를 로컬 화; 42 반응 쉬입니다. 따라서 관한 지표는 쉬 경로를 연구하는 중요한 모델 시스템, 섬모 인신 매매 및 신경 세포 분화 경로 역할을 할 수 있습니다. 또한, NSCs의 차별화 된 신경 세포는 섬모 인신 매매 분석에 사용할 수 있습니다.

neurosphere를이 neura의 확산에서 발생하는 자유 부동 세포의 클러스터로 구성되어있다특정 성장 인자와 비 접착면 (43), (44)의 존재하에 성장 L 줄기 / 선조 세포. neurosphere를 정상적인 개발 및 질병 31, 45, 46, 47에서 신경 줄기 / 전구 세포를 연구하기 위해 체외 배양 모델에서 중요한 역할을한다. 여기서, 우리는 신경 줄기 / 선조 세포를 배양 및 신경 / 신경교로의 분화를위한 neurosphere 기반 분석법을 설명한다. 우리는 특히 신경 줄기 / 전구 세포 및 분화 된 신경 세포 (그림 1)의 섬모 구성 요소를 신호의 인신 매매를 강조한다. 차 신경 세포를 배양 반대로, 차 neurosphere를은 문화에 상대적으로 쉽게 여러 구절 의무가 있고 사이클 해동의 동결 및 신경 / 교세포로 분화를받을 수 있습니다. 중요한 것은, 우리는 neurosphere 파생 신경을 결정줄기 / 선조 세포 및 분화 된 신경 세포 배양에서 섬모하고 이들 구획 섬모 기능에 중요한 신호 분자 지역화. Neurosphere 기반의 배양 방법은 NSCs의 차별화 된 신경 세포에서 ciliogenesis 및 섬모 인신 매매를 연구하기위한 이상적인 모델 시스템 역할을 할 수 있습니다.

프로토콜

성인 마우스 뇌에서 neurosphere를 1. 분리

  1. 이소 플루 란의 과다 복용으로 (약 2 개월) 성인 마우스를 안락사. 마우스가 호흡을 중단하고 사망 직후 해부 것을 다시 확인.
  2. 가위를 사용하여 두개골을 열 수있는 중간 선 절개를합니다. 뇌를 제거합니다.
  3. 얼음에 10cm 접시에 차가운 PBS의 뇌를 놓습니다. 측뇌실 48에서 SVZ를 얻기 위해 전체 마운트 박리 방법을 따른다.
  4. 1.5 ㎖의 튜브에 측뇌실 배치 PBS에 0.05 % 트립신 EDTA 500 μL를 추가하고, 수욕에서 37 ℃에서 15 분 동안 튜브를 배양한다.
  5. 15 분 후, 정지 배지 500 μL를 추가 부드럽게 피펫 20 - 1 mL의 팁 30 회. 피펫 팅하는 동안 공기 방울을 형성하지 마십시오.
    참고 :이 단계는 세포 생존에 중요합니다.
  6. 8 분 동안 500 XG에서 세포를 스핀 다운. 상등액을 버리고 PBS 1 mL를 넣어 재현 탁의 t완만 한 ML 팁 배를 피펫 팅 그 세포.
  7. 8 분 동안 500에서 스핀 다운 XG. 1 mL의 팁을 사용하여 상층 액을 제거하고 기본 배지 1 ㎖를 추가한다.
  8. (선택) 세포 파편이 관찰되면 70 μm의 세포 여과기를 통해 셀을 통과한다.
  9. 혈구와 세포의 수를 계산; 일반적으로, 약 30,000 - 60,000 세포 / SVZ를 얻을 수있다.
  10. 5 % CO 2, 37 ℃에서 NSC 배지 및 배양 10 ㎖와 10cm 접시에 한 SVZ에서 세포 접시.
  11. 구체 (49) 사이의 융합을 피하기 위해 (선택), 5 % CO 2, 37 ℃에서 NSC 매체 문화 1.5 mL로 채워져있다 초저 결합 6- 웰 플레이트의 한 웰에 1,000 세포를 넣어.
    주 5 ~ 7 일 후, neurosphere를 (그림 2A)을 관찰 할 수있다. 배양 기간은 마우스의 연령, 유전 적 배경과 다를 수 있습니다.
  12. 문화를 유지하기 위해 3-4 일마다 NSC 매체의 2 ML을 추가합니다(기존 매체를 제거하지 마십시오).

neurosphere를하고 Ciliogenesis 테스트의 차별화 용량 2. 분석

  1. 분화 능력을 분석하는 분화 배지에서 부착 조건 neurosphere를 분석한다.
  2. 오토 클레이브에 의해 또는 사용 전에 UV 노출을 12mm 원형 커버 슬립을 소독. 점착성 세포 배양 무균 조건 하에서 24 웰 플레이트의 웰에 멸균 12mm 원형 유리 커버를 넣어.
  3. 코트 0.002 % 폴리 -L- 리신 (PLL) 500 μL와 10 초 동안 커버 유리. 용액을 흡인하고 10-15 분 동안 건조시킨다.
  4. 라미닌 용액 (5 ㎍ / μL)의 500 μL를 추가합니다. 37 ° C에서 1 시간 동안 커버 유리를 인큐베이션.
  5. 라미닌을 대기음 분화 배지 또는 NSC 매체 (미분화 대조군)의 500 μL를 추가한다.
  6. 현미경으로 200 μL 팁 200 μm의 구형 - 분화 분석를 들어, 100을 선택하십시오. 더하다분화 배지 7-10 일 동안 24 웰 플레이트의 배양 웰에 각각 neurosphere를 5-10.
  7. 미분화 neurosphere를 분석 NSC 매체 1-2 일 동안 24 웰 플레이트의 각 웰 배양 5-10 neurosphere를 추가한다. 첨부 neurosphere를 확산 및 단층 (그림 2B)로 성장한다.
  8. 신중 배지를 제거한 후, RT에서 15 분 동안 PBS 중의 4 % 파라 포름 알데히드로 세포를 고정하고 RT에서 5 분 동안 PBS로 2 회 세척 하였다. 플레이트 1-2 개월 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다.
    참고 : (신경 줄기 / 전구 세포 마커) 네 스틴에 대한 면역 염색을 수행 NSC 매체에서 신경 줄기 / 전구 세포 분화 배지에서 분화 된 세포를 시각화하기 위해, β-tubulin의 III (TUJ1 단일 클론, 신경 세포 마커), GFAP (폐해 섬유 성 산성 단백질 , 성상 세포 마커) 및 O4 (희소 돌기 아교 세포 마커) (도 2B-E). (Arl13b에 대한 주요 CI를 면역 염색을 수행 섬모를 분석하려면리아 마커)과 Gpr161 (섬모 GPCR) (도 3).
  9. 슬라이드 글라스 위에 용액을 장착하여 커버 유리를 탑재. 여분의 용액을 제거하기 위해 슬라이드 글라스를 기울입니다.

neurosphere를에 Ciliogenesis 3. 분석

  1. 면역 neurosphere를 그대로하여 세포를 분석하기 위해, 배양 배지 1 mL의 전송은 1.5 ㎖의 튜브에 복수 neurosphere를 함유하고 8 분 동안 500에서 스핀 다운 XG. 15 분 동안 배지를 제거한 후, 4 % (PFA)와 구를 고정하고 PBS로 세척한다. 8 분 동안 500 XG 분야에서 스핀 다운 상등액을 제거하고, 4 ° C에서 30 %의 자당과 분야 O / N을 배양한다.
  2. 1 mL의 팁을 사용하여 상층 액을 제거하고 1 mL의 절삭 팁을 사용하여 간섭 단층 용액 500 μL를 추가한다. OCT를 점성이기 때문에, 개구부를 넓게 선단 가장자리를 잘라.
  3. 일회용 플라스틱 제빙 몰드 (10mm X 10mm X 5mm)로 neurosphere를 함유 OCT의 용액을 전송.
  4. M 개의 동결적어도 15 분 동안 드라이 아이스에 세.
  5. (선택 사항) 실험을 중지하고 최대 1 년 동안 -80 ° C의 냉동고에서 금형을 저장합니다.
  6. 저온 유지 장치 (cryostat)을 가진 부분을 잘라; 부분의 두께는 15 내지 30 μm의이어야한다.
  7. neurosphere에서 일차 섬모를 시각화하기 Arl13b에 대한 면역 염색 (도 4)을 수행한다.

4. 문화 neurosphere를하고 자기편 관한 지표의 통과

  1. 항로 neurosphere를 구 크기는 100 ~ 200 μm의 사이에있는 동안; neurosphere를가 (300 μm의 이상) 너무 큰 경우, 그들은 실험에 적합하지 않습니다.
  2. 1 mL의 팁을 사용하여 50 ㎖ 튜브에 neurosphere를 전송하고 8 분 동안 500에서 스핀 다운 XG.
  3. 흡인기를 사용하여 상청액을 버리고 PBS에 0.05 % 트립신 EDTA 500 μL를 추가하고, 37 ℃에서 5 분 동안 배양한다. 트립신의 양은 구체의 개수에 따라 변한다.
  4. 부드럽게 혈청 매체와 파이프의 500 μL를 추가1 mL의 팁과 t는 20 회.
  5. 8 분 동안 500에서 스핀 다운 XG. 1 mL의 팁을 사용하여 상층 액을 제거하고 기본 배지 1 ㎖를 추가한다.
  6. (선택 사항) 또는 해리되지 않은 세포 파편이 neurosphere를 보이면, 70 μm의 세포 여과기를 통해 셀을 통과한다.
  7. 통로 NSC 배지에서 10,000 세포 / ㎠의 밀도로 10 cm 접시에 세포; 세포는 일주일 후 다음 통과를 위해 준비가 될 것입니다.
  8. (선택) 500,000 내지 1,000,000 세포 / ㎖ 현탁액을 생성하기 위해 매체를 추가 동결 세포를 동결. 극저온 냉동 컨테이너를 사용하여 세포를 고정; 해리되지 않은 neurosphere를도 고정 할 수 있습니다.
  9. 부착 성 배양에 50,000 세포 / PLL- 및 상 cm 2 세포를 1-2 일 동안 dillute NSC 매체로 커버 슬립하고, 배양을 라미닌 코팅.

5. 기아와 섬모의 분석

  1. 기아 배지 (표 1)을 준비한다.
  2. 1-2일 초기 PL 후또 다른 하나 개의 해리도 (제어) 및 기아 배지에서 NSC 매체, 변화도 (실험) 후 부착 세포의 ating.
  3. 문화 24 시간 동안 자기편 세포.
  4. RT에서 15 분 동안 PBS 중의 4 % PFA로 세포를 고정시키고 RT에서 5 분마다 PBS로 두 번 세척 하였다.
  5. (선택 사항) 실험을 중지 1-2 개월 동안 4 ° C에서 PBS에서 커버 슬립으로 24 웰 플레이트를 저장합니다.
  6. 7 (50)에 대한 면역 염색 프로토콜을 수행한다.
  7. 장착 솔루션을 사용하여 커버 슬립을 마운트합니다. 어둠 속에서 실온에서 슬라이드 글라스 O / N을 건조.
  8. 필요한 배율에서 복합 현미경 이미지 획득. 첨부 된 소프트웨어를 사용하여 제어 현미경, 카메라, 및 목표 (40X / 1.3 오일 및 63X / 1.4 오일)를 사용합니다. 0.5-0.8 ㎛의 간격 (도 5)에서 충분한 Z 섹션을 가지고.
  9. 섬모 현지화의 정량 분석에 대한부착 세포는 DAPI 채널로보고 합류 세포와 3-8 연속 필드에서 이미지의 스택을 획득. ImageJ에 / 피지를 사용하여 차 섬모의 수를 정량화. 일반적으로>는 ImageJ에 플러그인에서 "셀 카운터"도구를 사용 GPCR 양성 섬모를 가진 세포를 계산하는 대화 상자를 분석; 이미지 스택에서 최대 돌기 계산 수출 상업적 동일한 실험에서 모든 이미지 ImageJ에 / Fiji.Use 유사한 이미지 세기 및 콘트라스트 파라미터로부터도 내보낼 수있다.

6. neurosphere를 형질

  1. 부착합니다 24 시간 동안 커버 슬립에 세포를 분해. 24- 웰 플레이트 중 하나의 웰에 500 μL NSC 매체 전형적 75,000 내지 150,000 세포 세포 밀도를 사용한다.
  2. 5 초 동안 볼 텍싱하여 0.5 ㎖의 마이크로 튜브에 혈청 감소 배지 25 μL와 형질 감염 시약 150 μL를 섞는다.
  3. 별도의 0.5 mL의 microtub에 독소가없는 플라스미드 DNA 2.5 μg의 추가감소 혈청 미디어의 25 μL를 포함, 5 초 동안 볼 텍싱에 의해 혼합 전자.
  4. 제 모세관 함유 DNA로 형질 전환 시약 1 μL를 첨가하고 5 초 동안 볼 텍싱하여 혼합한다.
  5. 제 마이크로 튜브에 DNA 함유 튜브에서 혼합물을 첨가하고 피펫 팅하여 혼합한다.
  6. RT에서 10 내지 15 분 동안 혼합물을 인큐베이션. 배양 후, 부드럽게 NSC 매체의 상부 (500 μL / 웰)의 웰에 형질 믹스 적가.
  7. 매체 (NSC 매체) 기아 배지 (500 μL / 웰)을 제어하기 위해 매체 (24) 시간 후 형질 변경.
  8. 24 시간 후 4 % PFA로 매체를 변경하여 세포를 고정 및 면역 염색을 수행; 통상적으로, 10 %의 형질 도입 효율을이 프로토콜을 이용하여 얻어진다.

결과

일주일 NSC 매체에 SVZ에서 세포 도금 후 부동 neurosphere를는 (도 2A)를 관찰 하였다. 구체의 크기는 50 ~ 200㎛ 사이에서 변화. 구체는 신경 줄기 / 전구 세포에서 파생 된 경우 검사하려면 neurosphere를가 PLL-과에 도금 된 2 일 동안 NSC 매체의 커버 슬립을 라미닌 코팅. 그들은 다음 신경 줄기 / 전구 세포 마커, 네 스틴에 대한 면역 염색되었다. 이틀은 구체가 커버 슬립...

토론

여기, 우리는 생성하고 성인 마우스 SVZ에서 neurosphere 문화를 유지하는 방법을 설명합니다. 다음과 같이 문화에 관한 몇 가지 관련 사항입니다. 200 μm의 - 먼저, 구의 크기는 일반적으로 50 사이이다. neurosphere 직경보다 큰 300 μm의를 가져 우리의 경험에서, 계대을위한 최적의 시간이 누락되었습니다. 이 큰 분야는 핵심에있는 죽은 세포가 포함되어 있습니다. neurosphere를 일반적으로 신경 줄기 / 전구 ...

공개

The authors declare no competing financial interests.

감사의 말

Work in S.M.'s laboratory is funded by recruitment grants from CPRIT (R1220) and NIH (1R01GM113023-01).

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
12 mm round cover glassFisherbrand12-545-80 
24-well plateFalcon353047
4% paraformaldehyde (PFA)Affymetrix19943
50 mL tubeFalcon352098
95 mm x 15 mm petri dish, slippable lidFisherbrandFB0875714G10 cm dish
70 µm cell strainerFalcon352350
Alexa Fluor 488 Affinipure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson Immunoresearch711-545-152Donkey anti Rabbit, Alexa 488 secondary antibody
Arl13B, Clone N295B/66NeuromabAB_11000053
B-27 Supplement (50X), serum freeThermoFisher Scientific17504001B27
CentrifugeThermo scientificST 40R
Cryogenic vialCorning430488
DAPISigmaD9542-10MG
Deoxyribonuclease I from bovine pancreaseSigmaD5025-15KUDnase I
Dimethyl sulfoxideSigmaD8418-100MLDMSO
Disposable Vinyl Specimen MoldsSakura Tissue-Tek Cryomold456510 mm x 10 mm x 5 mm
Dulbecco's Phosphate-buffered Saline 10X, Modified, without calcium chloride and magnesium chloride, liquid, sterile-filtered, suitable for cell cultureSigmaD1408-500MLDPBS
Dumont #5 ForcepsFine science tools11254-20
Fetal Bovine Serum (FBS)SigmaF9026-500ML
Fluoromount-G solutionSouthern Biotech0100-01mounting solution
GFAPDAKOZ0334
Goat anti Mouse IgG1 Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugateThermoFisher ScientificA-21127Goat anti Mouse IgG1, Alexa 555 secondary antibody
Goat anti Mouse IgG2a Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugateThermoFisher ScientificA-21137Goat anti Mouse IgG2a, Alexa 555 secondary antibody
Gpr161home madeN/A
human bFGFSigmaF0291FGF
hemocytometerHausser Scientific0.100 mm deepimproved neubauer
IsothesiaHenry ScheinNDC 11695-0500-2Isofluorane
Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm Sarcoma basement membraneSigmaL2020Laminin
L-Glutamine (200 mM)SigmaG7513
Lipofectamine 3000 Transfection ReagentThermoFisher ScientificL3000
Mr. FrostyNalgene 5100-0036
N-2 supplement (100X)ThermoFisher Scientific17502001N2
Neurobasal mediumGibco21103-049
Normal Donkey SerumJackson ImmunoResearch017-000-121
OCT compoundSakura Tissue-Tek4583OCT
Penicillin-StreptomycinSigmaP4333-100ML
Poly-L-Lysine (PLL)SigmaP4707
Recombinant human EGF protein, CFR and D systems236-EG-200EGF
ScissorFine science tools14060-10
Superfrost plus microscope slideFisher scientific12-550-15slides
Triton X-100Bio-Rad161-0407
Trypsin-EDTA solution (10X)SigmaT4174-100Trypsin
COSTAR 6-Well Plate, With Lid Flat Bottom Ultra-Low Attachment Surface Polystyrene, SterileCorning3471ultra-low binding 6-well plate
β-tubulin IIICovanceMMS-435PTUJ1

참고문헌

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