الخلايا العصبية التصوير داخل أقسام الدماغ سميكة باستخدام أسلوب جولجي كوكس

Summary

نقدم بروتوكول باستخدام طريقة تلوين جولجي كوكس في أقسام الدماغ سميكة، من أجل رؤية الخلايا العصبية مع أشجار شجيري طويلة الواردة في عينات الأنسجة واحدة. يتم عرض نوعين مختلفين من هذا البروتوكول أيضا التي تنطوي على الكريزيل البنفسجي counterstaining، وتجميد العقول غير المجهزة لتخزين على المدى الطويل.

Abstract

وقد استخدمت طريقة جولجي كوكس من تلطيخ الخلايا العصبية لأكثر من مائتي عام لتعزيز فهمنا للمورفولوجيا الخلايا العصبية داخل الدماغ العينات النسيجية. في حين أنه من الأفضل من الناحية العملية لإعداد أقسام الدماغ في أكبر سمك ممكن، من أجل زيادة احتمال تحديد الخلايا العصبية الملون التي ترد بشكل كامل داخل الأقسام واحدة، وهذا النهج هو محدود من منظور تقني من العمل لمسافات عالية ، تكبير أهداف المجهر. ونحن هنا التقرير بروتوكول لصبغ الخلايا العصبية باستخدام طريقة جولجي كوكس في أقسام مخ الفأر أن يتم قطع في 500 سمك ميكرون، وتصور الخلايا العصبية في جميع أنحاء عمق هذه المقاطع باستخدام المجهر تستقيم مزودة عالية الدقة 30X 1.05 NA سيليكون هدف النفط الغمر يحتوي على مسافة العمل 800 ميكرون. نحن أيضا الإبلاغ عن الخيارين مفيدة من هذا البروتوكول التي يمكن استخدامها لمباين سطحشنت أقسام الدماغ مع نيسل وصمة عار الكريزيل البنفسجي، أو لتجميد العقول كلها للتخزين طويل الأجل قبل باجتزاء والتجهيز النهائي. بروتوكول الرئيسي ومشتقاته اثنين تنتج أقسام الدماغ سميكة الملون، في جميع أنحاء الذي الكاملة أشجار الخلايا العصبية شجيري والعمود الفقري تغصناته يمكن تصور موثوق وكميا.

Introduction

التصور من الخلايا العصبية الفردية داخل عينات الأنسجة يسمح للفي الموقع تحليل الخصائص المورفولوجية الخلايا العصبية، التي تقدمت بشكل كبير من فهمنا للدماغ وكيف يمكن أن يتأثر بها المرض الذاتية أو العوامل البيئية الخارجية. طريقة تلوين جولجي كوكس هو، وسيلة فعالة من حيث التكلفة بسيطة نسبيا من تلطيخ عينة عشوائية من الخلايا العصبية في الدماغ. أول من وضعه جولجي ¹ وتعديلها من قبل كوكس ² في 1800s، ومزيد من الصقل الباحثون هذه التقنية على مر السنين لإنتاج واضحة، والخلايا العصبية الملون بشكل جيد والتي يمكن استخدامها لتصور وتحديد كلا مورفولوجيا الشجرة شجيري وكثافة العمود الفقري ^{3، 4، 5، 6، 7، 8، 9}.

وهناك اعتبار تقني رئيسي لتصور الخلايا العصبية الملون داخل أقسام الدماغ هو الحد الأقصى للسمك شريحة، والذي يحد من مسافة العمل من الأهداف المتاحة عالية التكبير / عالية الدقة المجهر. الأهداف النفط الغمر المشتركة في 60 - 100X مجموعة توفر قرار ممتاز، ولكن تقتصر مسافات عملهم التي عادة ما لا يزيد عن 200 ميكرون. أقسام الدماغ قطع في ميكرون مجموعة 200 قد تكون كافية لتصور أنواع الخلايا العصبية معينة التي يمكن الواردة في هذا شريحة سمك، على سبيل المثال العصبونات الهرمية في طبقات عميقة من القشرة المخية ^{10، 11، 12،} الخلايا العصبية الهرمية في المنطقة CA1 من الحصين ^{13 و 14،} والخلايا الحبيبية في التلفيف المسنن من الحصين ^(15). الخلايا العصبية مع أطول نسبياأشجار الجذعية، مثل الخلايا العصبية الهرمية داخل الطبقات العميقة من القشرة الدماغية التي فأرة الحاسوب يمكن أن تمتد أكثر من 800 ميكرون من خلايا الجسم ^16، وتوفير تحديا أكبر لأنه لن تحتاج إلى مقطوع في زاوية مثالية العقول لاحتواء شجرة تغصناته كامل في حدود 200 ميكرون شرائح. قد لا يكون هذا ممكنا إذا كان التغصنات أو أي من فروعها تمتد في اتجاه منقاري أو الذيلية. في حين أنه من الممكن معالجة هذا القيد عن طريق تتبع الخلايا العصبية عبر عدة أقسام الدماغ المجاورة، ويدخل هذا النهج تحديا تقنيا كبيرا في التوفيق بين الأقسام بدقة للبحث عن المفقودين ^(17). ومن شأن اتباع نهج أكثر واقعية يكون لتصور الخلايا العصبية كلها الواردة في أقسام الدماغ التي قطعت في سمك أكبر.

نفيدكم هنا تقنية وصمة عار الخلايا العصبية داخل 400-500 ميكرون أقسام الدماغ سميكة من الفئران باستخدام طريقة جولجي كوكس، وتصور لهم موrphology باستخدام عالية الدقة السيليكون هدف النفط الغمر يحتوي على مسافة العمل 800 ميكرون. يتم تعديل التشريب وتجهيز بروتوكول جولجي كوكس التي وصفنا من أحد البروتوكولات الحديثة الأكثر ذكرا في الأدب ^6. نهجنا مع أقسام الدماغ سميكة يوفر ميزة زيادة احتمال تحديد الخلايا العصبية من أي نوع أن ترد بشكل كامل داخل القسم. وبالإضافة إلى البروتوكول الرئيسي، ونحن أيضا موجودة شكلان التي توفر مزايا فريدة من نوعها: (1) جولجي كوكس تلطيخ مع مباين الكريزيل البنفسجي على سطح أقسام المركبة، من أجل تحديد حدود مناطق الدماغ وتحديد طبقات قشرة الدماغ، و (2) جولجي كوكس تلطيخ مع خطوة تجميد المتوسطة للتخزين على المدى الطويل من العقول كلها مشربة قبل باجتزاء والتجهيز النهائي.

Protocol

تم استخدام الكبار للإناث الفئران CD1 سلالة في هذه الدراسة. تلطيخ مماثل يمكن تحقيق ذلك باستخدام كلا الجنسين في مختلف الأعمار. ويهتم حيوانات التجارب لوفقا لمبادئ وتوجيهات من المجلس الكندي لرعاية الحيوان، وتمت الموافقة على بروتوكول تجريبي من قبل الجامعة لجنة رعاية الحيوان جويلف.

1. جولجي كوكس تلطيخ

1. جولجي كوكس إشباع العقول
   1. جعل الحل جولجي كوكس 1٪ (ث / ت) ثاني كرومات البوتاسيوم، و 0.8٪ (ث / ت) كرومات البوتاسيوم و 1٪ (ث / ت) كلوريد الزئبق عن طريق إذابة ثاني كرومات البوتاسيوم وكرومات البوتاسيوم في الماء عالية الجودة بشكل منفصل . مزيج من الحلول، إضافة كلوريد الزئبق وتصفية الحل النهائي باستخدام الصف 1 ورق الترشيح. تخزين الحل في الظلام لمدة شهر واحد.
   2. تخدير الماوس باستخدام 5٪ الأيزوفلورين.
   3. الموت ببطء الماوس عن طريق قطع الرأس وإزالة بسرعة الدماغ.
   4. وضع الدماغ في قارورة التلألؤ 20 مل غلاس التي تحتوي على 17 مل من محلول جولجي كوكس واحتضان في الظلام في RT لمدة 25 د.
   5. Cryoprotect الدماغ عن طريق وضعها في أنبوب مخروطي 50 مل تحتوي على 40 مل من السكروز cryoprotectant (30٪ (ث / ت) السكروز في 0.1 M الفوسفات العازلة، ودرجة الحموضة 7.4) في الظلام في 4 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
      ملاحظة: قد تكون عاملة وفيما يلي ثلاث خطوات اختيارية كبديل للبروتوكول الرئيسي، من أجل تجميد الدماغ في هذه المرحلة للتخزين على المدى الطويل.
   6. تجميد الدماغ كله تخبط في 200 مل نظير البنتان التي تم precooled على الثلج الجاف.
   7. وضع الدماغ المجمدة في أنبوب 50 مل المخروطية وتخزينها في الظلام في -80 ° C.
   8. عندما تصبح جاهزة للشروع، ذوبان الجليد الدماغ عن طريق وضعها في أنبوب مخروطي 50 مل تحتوي على 40 مل من cryoprotectant السكروز في الظلام في 4 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
2. الدماغ باجتزاء
   1. إزالة الدماغ من السكروز والكتلةك ذلك لباجتزاء بقطع المخيخ باستخدام شفرة حلاقة وترك حافة مسطحة في نهاية الذيلية المتبقية من الدماغ.
   2. أجار الحرارة (3٪ (ث / ت) في الماء) حتى ذاب والسماح لتبرد حتى يصبح أعلى قليلا من نقطة انصهاره.
   3. وضع الدماغ في صغير المتاح وزن الطبق مع نهايته الذيلية وجها لأسفل وإضافة كمية كافية من أجار ذاب لتغطي الدماغ.
   4. مرة واحدة وقد عززت أجار، وتقليم أجار الزائد وترك ما يقرب من 2-4 ملم المحيطة بالدماغ والغراء الدماغ إلى مرحلة من مراحل vibratome مع نهايته الذيلية وجها لأسفل باستخدام كمية صغيرة من الغراء إيثيل غراء سريع.
   5. ملء المنطقة مرحلة من مراحل vibratome مع كمية كافية من cryoprotectant السكروز لتغطي الدماغ، وقسم الدماغ في سمك شريحة من 400-500 ميكرون (اعتمادا على المنطقة من المخ لفحصها) باستخدام تردد الاهتزاز من 86 هرتز و سرعة شفرة النهوض 0.125 ملم / ثانية.
   6. باستخدام فرشاة الدهان الصغيرة، أقسام الدماغ مكان في بئر من لوحة 6 جيدا زراعة الأنسجة التي تحتوي على إدراج-شبكة السفلية المتاحة تجاريا وقبل مليئة 10 مل من 6٪ (ث / ت) السكروز في 0.1 M الفوسفات العازلة، ودرجة الحموضة 7.4.
   7. احتضان المقاطع في الظلام في 4 درجات CO / N.
3. تطوير أقسام الدماغ
   1. عن طريق إدراج-شبكة القاع، ونقل أقسام الدماغ في عالم جديد يحتوي بشكل جيد 5 مل من 2٪ (ث / ت) لامتصاص العرق (PBD) في 0.1 M الفوسفات العازلة، ودرجة الحموضة 7.4. احتضان على الكرسي الهزاز يتحرك بسرعة بطيئة في الظلام في RT لمدة 15 دقيقة.
   2. غسل أقسام مرتين من قبل نقلهم إلى آبار جديدة تحتوي على 5 مل من الماء. يغسل على الكرسي الهزاز تتحرك بسرعة معتدلة في الظلام في RT لمدة 5 دقائق.
   3. نقل المقاطع إلى بئر جديدة تحتوي على 5 مل من 2.7٪ (ت / ت) هيدروكسيد الأمونيوم. احتضان على الكرسي الهزاز يتحرك بسرعة بطيئة في الظلام في RT لمدة 15 دقيقة.
   4. غسل أقسام مرتين من قبل نقلهم إلى آبار جديدة تحتوي على 5 مل من الماء. غسل سغ الروك تتحرك بسرعة معتدلة في الظلام في RT لمدة 5 دقائق.
   5. نقل المقاطع إلى جديد يحتوي بشكل جيد 5 مل من تثبيتي A (انظر الجدول المواد) التي تم مخففة في 10X المياه من التركيز الأصلي شراؤها. احتضان على الكرسي الهزاز يتحرك بسرعة بطيئة في الظلام في RT لمدة 25 دقيقة.
   6. غسل أقسام مرتين من قبل نقلهم إلى آبار جديدة تحتوي على 5 مل من الماء. يغسل على الكرسي الهزاز تتحرك بسرعة معتدلة في الظلام في RT لمدة 5 دقائق.
4. تصاعد أقسام الدماغ
   1. باستخدام فرشاة الدهان الصغيرة، جبل أقسام على الشرائح المجهر. إزالة المياه الزائدة وأجار باستخدام الملقط والأنسجة الصغيرة. ضمان أن تتم إزالة جميع أجار قبل الشروع في الجفاف.
   2. السماح أقسام للهواء الجاف في RT لمدة 45 دقيقة (400 ميكرون أقسام) أو 90 دقيقة (500 ميكرون أقسام).
      ملاحظة: مستوى توقيت والسليم للجفاف أمر بالغ الأهمية، وربما تحتاج إلى أن تحدد في كلمختبر اعتمادا على درجة الحرارة المحيطة ومستوى الرطوبة. قصيرة جدا وقت التجفيف يؤدي إلى أقسام تسقط من الشرائح خلال الخطوات اللاحقة الجفاف، وطويل جدا وقت التجفيف يؤدي إلى أقسام تكسير. سوف أقسام تزال تبدو لامعة على المستوى المناسب من جفاف.
   3. أقسام صمة عار مع البنفسجي الكريزيل عن طريق وضع شرائح في الجرار تلطيخ Coplin كما هو محدد.
      ملاحظة: يمكن استعمال هذه خطوة اختيارية لالمقاطع التي لم يتم تجميدها، من أجل وصمة عار نوى الخلايا العصبية مع البنفسجي الكريزيل. لقد وجدنا أن المقاصة والمضادة للجفاف أقسام قبل الحضانة في البنفسجي الكريزيل يؤدي حتى إلى تلطيخ وخلفية منخفضة عبر المقاطع.
      1. ضع في تطهير وكيل لمدة 5 دقائق. التكرار مرة واحدة.
      2. ضع في الإيثانول بنسبة 100٪ لمدة 5 دقائق. التكرار مرة واحدة.
      3. ضع في 95٪ من الإيثانول في الماء، ثم 75٪ من الإيثانول في الماء، ثم الايثانول 50٪ في الماء لمدة 2 دقيقة لكل منهما.
      4. وضع في الماء لمدة 5 دقائق.
      5. ضع في 0.5٪ (ث / ت) لجنة المساواة العرقيةالبنفسجي SYL في الماء لمدة 7 دقائق.
      6. وضع في الماء لمدة 2 دقيقة. التكرار مرة واحدة.
   4. يذوى المقاطع عن طريق وضع شرائح في الجرار تلطيخ Coplin كما هو محدد.
      1. ضع في 50٪ من الإيثانول في الماء، ثم 75٪ من الإيثانول في الماء، ثم الايثانول 95٪ في الماء لمدة 2 دقيقة لكل منهما.
      2. ضع في الإيثانول بنسبة 100٪ لمدة 5 دقائق. التكرار مرة واحدة.
      3. ضع في تطهير وكيل لمدة 5 دقائق. التكرار مرة واحدة.
         ملاحظة: هذه الجفاف والمقاصة مرات كافية لمعالجة أدمغة فئران كما هو موضح في هذه المخطوطة. ومع ذلك، لاحظنا بالنسبة للأنواع الأخرى بما في ذلك الفئران وشحارير البقر، أن الخطوة المقاصة النهائية قد تحتاج إلى أن تمتد ما يصل الى 15 مجموعه دقيقة.
   5. أقسام ساترة باستخدام المتوسطة المتزايدة اللامائية.
   6. تسمح الشرائح لتجف أفقيا في الظلام في RT لا يقل عن 5 د.

2. التصوير الملون الخلايا العصبية داخل الدماغ أقسام سميكة

1. التقاط صورة الأكوام
   1. تشغيل لمبة ضوء المجهر، والكاميرا، وجهاز تحكم المرحلة.
   2. فتح البرنامج المجهر (على سبيل المثال، Neurolucida).
   3. وضع شريحة على المسرح المجهر.
   4. التقاط صورة على نطاق عرض 2D من قسم المخ باستخدام هدف تضخم منخفض مثل 1.25X 0.4 NA PlanAPO أو 4X 0.16 NA
      1. تركيز الصورة وضبط إعدادات الكاميرا بما في ذلك وقت التعرض وتوازن اللون الأبيض.
      2. إنشاء نقطة مرجعية من قبل اليسار النقر في أي مكان على القسم
      3. التقاط الصور عن طريق اختيار "الحصول على صورة واحدة" ضمن إطار الحصول على الصور.
   5. التقاط منتصف قرار مداخن صورة للمنطقة التي تحتوي على الخلايا العصبية (ق) من الفائدة، وذلك باستخدام 10X 0.3 NA الهدف UPlan FL N.
      1. التركيز على الصورة وضبط إعدادات الكاميرا بما في ذلك التعرض وتوازن اللون الأبيض.
      2. تعيين الحدود العليا والدنيا للصورة كومة من خلال التركيز على الجزء العلوي من القسمالثانية اختيار "مجموعة" إلى جانب "قمة كومة" ضمن إطار الحصول على الصور، ومن ثم التركيز على الجزء السفلي من القسم واختيار "مجموعة" بجانب "أسفل كومة" ضمن إطار الحصول على الصور.
      3. تعيين مسافة خطوة إلى 5 ميكرون عن طريق إدخال "5 ميكرون" بجوار "المسافة بين الصور" ضمن إطار الحصول على الصور.
      4. القبض على كومة صورة عن طريق اختيار "كومة صورة اكتساب" ضمن إطار الحصول على الصور.
      5. كرر الخطوات المذكورة أعلاه للقبض على المنطقة بأكملها من الفائدة، والتأكد من أن جميع مداخن صورة تتداخل لا يقل عن 10٪ في X و Y محاور.
   6. التقاط عالية الدقة مداخن صورة للمنطقة التي تحتوي على الخلايا العصبية من الفائدة، وذلك باستخدام 30X 1.05 NA سيليكون هدف النفط الغمر.
      1. تطبيق 3-4 قطرات من زيت السيليكون الغمر إلى الشريحة ووضع الهدف على الشريحة، وضمان لاجراء اتصالات بين الهدف ومنظمة اوكسفام الدوليةل.
      2. التركيز على الصورة وضبط إعدادات الكاميرا بما في ذلك التعرض وتوازن اللون الأبيض.
      3. تعيين الحدود العليا والدنيا للصورة كومة من خلال التركيز على الجزء العلوي من الباب، واختيار "مجموعة" إلى جانب "قمة كومة" ضمن إطار الحصول على الصور، ومن ثم التركيز على الجزء السفلي من الباب، واختيار "ضبط" بجانب "أسفل كومة" ضمن إطار الحصول على الصور.
      4. تعيين مسافة خطوة إلى 1 ميكرومتر عن طريق إدخال "1 ميكرون" بجوار "المسافة بين الصور" ضمن إطار الحصول على الصور.
      5. القبض على كومة صورة عن طريق اختيار "كومة صورة اكتساب" ضمن إطار الحصول على الصور.
      6. كرر الخطوات المذكورة أعلاه للقبض على المنطقة بأكملها من الفائدة، والتأكد من أن جميع مداخن صورة تتداخل لا يقل عن 10٪ في X و Y محاور.
   7. حفظ ملف البيانات وحفظ جميع ملفات الصور في شكل TIFF للتجهيز الخارجي.
2. خلق صور Z-الإسقاط وصورة التنسيقات
   1. إنشاء صور Z-الإسقاط في يماغيج
      1. برنامج ImageJ المفتوح الذي المساعد بيو تنسيقات مثبتة.
      2. حدد "الإضافات" -> "بيو تنسيقات" -> "بيو تنسيقات المستورد".
      3. حدد الملف كومة صورة ليتم فتحه.
      4. بمجرد فتح الملف، تغيير تنسيق لRGB عن طريق اختيار "صورة" -> "نوع" -> "RGB اللون".
      5. إنشاء Z-الإسقاط عن طريق اختيار "صورة" -> "أكوام" -> "Z المشروع ...".
      6. حفظ صورة ثنائية الأبعاد Z-الإسقاط كملف TIFF.
   2. إنشاء المونتاج صورة ثنائية الأبعاد من المنطقة بأكملها من الفائدة.
      1. فتح البرنامج (على سبيل المثال، أدوبي فوتوشوب).
      2. حدد "ملف" -> "أتمتة" -> "الدمج الصوري".
      3. حدد "استعراض" ثم قم بإضافة كل ايماجوفاق الملفات المراد دمجها.
      4. تأكد من أن "مزيج الصور معا" يتم تحديد ومن ثم حدد "OK".
      5. حفظ الصورة المونتاج الناتجة من المنطقة بأكملها من الفائدة كملف TIFF.

النتائج

يجوز استخدام هذا البروتوكول تلطيخ جولجي كوكس وصفهما مشتقاته اختياري لتصور الخلايا العصبية الفردية داخل 400-500 ميكرون أقسام الدماغ سميكة. وتظهر صورة مركبة تمثيلية اثنين من الأبعاد Z-توقعات استولت باستخدام الهدف 10X و 5 ميكرومتر الخطوات في محور Z في ?...

Discussion

نحن هنا وصف بروتوكول تلطيخ جولجي كوكس جنبا إلى جنب مع اثنين من المتغيرات مفيدة لتصور الخلايا العصبية داخل أقسام الدماغ سميكة. كما هو مبين في ممثل النتائج، واستخدام هدفا عالية الدقة لديه طويلة المسافة 800 ميكرون العمل يسمح التصور يمكن الاعتماد عليها من الخلايا العصبية...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
potassium dichromate	Fisher Scientific	P188-100	Hazardous
potassium chromate	Fisher Scientific	P220-100	Hazardous
mercuric chloride	Fisher Scientific	S25423	Hazardous
Whatman grade 1 filter paper	Fisher Scientific	1001-185
isoflurane	Pharmaceutical Partners of Canada	CP0406V2
20 mL scintillation vial	Fisher Scientific	03-337-4
sucrose	Bioshop Canada	SUC700.1
sodium phosphate monobasic	Sigma Aldrich	S5011-500G
sodium phosphate dibasic	Sigma Aldrich	S9390-500G
50 mL conical tube	Fisher Scientific	12-565-271
isopentane	Fisher Scientific	AC126470010	Also known as 2-methylbutane; hazardous
agar	Sigma Aldrich	A1296-100G
small weigh dish	Fisher Scientific	02-202-100
vibratome	Leica	VT1000 S
6-well tissue culture plates	Fisher Scientific	08-772-1b
mesh bottom tissue culture inserts	Fisher Scientific	07-200-214
paraformadelhyde (PFA), 16%	Electron Microscope Sciences	15710-S	Hazardous
ammonium hydroxide	Fisher Scientific	A669S-500	Hazardous
Kodak Fixative A	Sigma Aldrich	P7542
superfrost plus slides	Fisher Scientific	12-550-15
CitroSolv clearing agent	Fisher Scientific	22-143-975
anhydrous ethyl alcohol	Commercial Alcohols	N/A
cresyl violet	Sigma Aldrich	C1791
permount	Fisher Scientific	SP15-100
upright microscope	Olympus	BX53 model
colour camera, 12 bit	MBF Biosciences	DV-47d	QImaging part 01-MBF-2000R-F-CLR-12
3D motorized microscope stage, controller and enoders	MBF Biosciences	N/A	Supplied and integrated with microscope by MBF Biosciences
4X microscope objective	Olympus	4x 0.16 N.A. UplanSApo
10X microscope objective	Olympus	10x 0.3 N.A. UPlan FL N
30X microscope objective	Olympus	30x 1.05 N.A. UPlanSApo
60X microscope objective	Olympus	60x 1.42 N.A. PlanAPO N
silicone immersion oil	Olympus	Z-81114
Neurolucida software	MBF Biosciences	Version 10
ImageJ software	U. S. National Institutes of Health	Current version	With the OME Bio-Formats plugin installed
Photoshop software	Adobe	version CS6