Neurônios de imagem dentro de seções do cérebro grossas usando o método de Golgi-Cox

Resumo

Apresenta-se um protocolo para a utilização do método de coloração de Golgi-Cox em secções do cérebro de espessura, a fim de visualizar os neurónios com árvores dendriticas longos contidos dentro de amostras de tecidos individuais. Duas variantes deste protocolo são também apresentados que envolvem cresilo contracoloração violeta, e a congelação dos cérebros não transformadas, para o armazenamento a longo prazo.

Resumo

O método de Golgi-Cox neurónio de coloração foi utilizado para mais de duzentos anos para avançar a nossa compreensão dos neurónios morfologia dentro de amostras de cérebro histológicos. Embora seja preferível do ponto de vista prático para preparar secções de cérebro na maior espessura possível, a fim de aumentar a probabilidade de identificação de neurónios corados que estão totalmente contidos no interior de secções individuais, esta abordagem é limitada a partir de um ponto de vista técnico pela distância de trabalho de alta -magnification objetivos microscópio. Relatamos aqui um protocolo para corar neurónios usando o método de Golgi-Cox em secções de cérebro de rato que são cortadas a 500 de espessura? M, e de visualizar os neurónios em toda a profundidade destas secções utilizando um microscópio vertical equipado com uma alta resolução de 30X 1,05 NA silicone objectiva de imersão em óleo que tem uma distância de trabalho de 800? m. Nós também relatam duas variantes úteis deste protocolo que pode ser empregue para a superfície de contracoloraçãomontadas secções de cérebro com o corante de Nissl violeta de cresilo, ou a congelar cérebros inteiros para armazenamento a longo prazo antes de seccionamento e o processamento final. O protocolo principal e as suas duas variantes produzir secções de cérebro de espessura coradas, ao longo da qual árvores neurónio dendríticas completos e espinhos dendríticos podem ser fiavelmente visualizadas e quantificadas.

Introdução

A visualização dos neurónios individuais dentro de amostras de tecido permite a análise in si tu de características morfológicas de neurónios, que tem avançado de forma significativa a nossa compreensão do cérebro e como ela pode ser influenciada pela doença endógeno ou factores ambientais exógenos. O método de coloração de Golgi-Cox é um meio eficaz em termos de custos, relativamente simples de marcação de uma amostra aleatória de neurónios no cérebro. Primeiro desenvolvido por Golgi ¹ e modificado por Cox ² em 1800, os investigadores têm refinado ainda mais esta técnica ao longo dos anos para produzir neurónios claras, bem corados que podem ser utilizados para visualizar e quantificar tanto morfologia árvore dendrítica e densidade da coluna ^{3, 4, 5, 6, 7, 8, 9}.

Uma consideração importante técnica para a visualização dos neurónios corados nas secções do cérebro é a espessura máxima fatia, que é limitada pela distância de trabalho de objectivos disponíveis de elevada ampliação / de alta resolução de microscópio. objetivos de imersão em óleo comuns no 60 - 100X intervalo fornece excelente resolução, mas são limitados por suas distâncias de trabalho que são tipicamente não superior a 200 mm. Secções cerebrais cortados no pm gama 200 pode ser adequado para visualizar certos tipos neuronais que podem estar contidos dentro desta espessura da fatia, por exemplo, neurónios piramidais em camadas superficiais do córtex cerebral ^{de 10, 11, 12,} neurónios piramidais na região CA1 do hipocampo ^{13, 14,} e as células granulares no giro dentado do hipocampo ^15. Neurônios com relativamente mais longoárvores dendriticas, tais como os neurónios piramidais em camadas profundas do córtex cerebral que para o rato pode estender-se mais do que 800 um a partir do corpo da célula ^16, proporcionam uma maior desafio porque os cérebros teriam de ser seccionados com um ângulo ideal para conter toda a árvore de dendrite dentro de 200? m fatias. Isso pode até não ser viável se um dendrite ou qualquer de seus ramos se estendem na direção rostral ou caudal. Embora seja possível para resolver esta limitação, traçando um neurônio em várias seções cerebrais adjacentes, esta abordagem apresenta um desafio técnico significativo em alinhar as secções com precisão para rastrear ^17. Uma abordagem mais prática seria para visualizar os neurónios inteiras contidos dentro de secções do cérebro que são cortadas a uma espessura maior.

Relatamos aqui uma técnica para corar neurónios dentro 400-500 seces cerebrais de espessura de ratinhos, utilizando o método de Golgi-Cox, e para visualizar a sua morphology usando uma objectiva de silício de imersão em óleo de alta resolução que tem uma distância de trabalho de 800? m. A impregnação e o processamento do protocolo de Golgi-Cox que descrevemos é modificado a partir de um dos protocolos mais modernos-citados na literatura ^6. A nossa abordagem com secções de cérebro de espessura proporciona a vantagem de aumentar a probabilidade de identificação de neurónios de qualquer tipo dos que são totalmente contida dentro da secção. Em adição ao protocolo principal, que também apresentam duas variações que fornecem vantagens únicas: (1) a coloração de Golgi-Cox com o contra-corante violeta de cresilo na superfície de secções montadas, de modo a definir os limites de regiões do cérebro e para identificar camadas da córtex cerebral, e (2) a coloração de Golgi-Cox com um passo de congelação intermédia para o armazenamento de longo prazo de impregnados cérebros inteiros antes do corte e o processamento final.

Protocolo

ratinhos fêmea adultos CD1-deformação foram utilizados neste estudo. coloração semelhante pode ser realizada utilizando ambos os sexos em várias idades. Os animais experimentais foram tratados de acordo com os princípios e diretrizes do Canadian Council on Animal Care, eo protocolo experimental foi aprovado pela Universidade do Comitê Animal Care Guelph.

1. Golgi-Cox Coloração

1. Golgi-Cox impregnação de Brains
   1. Adicione a solução de Golgi-Cox de 1% (w / v) de dicromato de potássio, 0,8% (w / v) cromato de potássio e 1% (w / v) de cloreto de mercúrio dissolvendo o dicromato de potássio e de cromato de potássio em água de alta qualidade separadamente . Misturar as soluções, adicionar o cloreto de mercúrio e filtrar a solução final, utilizando um papel de filtro de grau. Guardar a solução no escuro por até um mês.
   2. Anestesiar o rato usando 5% de isoflurano.
   3. Euthanize o mouse por decapitação e remover rapidamente o cérebro.
   4. Coloque o cérebro em um frasco de cintilação de 20 mL glass contendo 17 mL de solução de Golgi-Cox e incubar no escuro à temperatura ambiente durante 25 d.
   5. Cryoprotect o cérebro, colocando-o para um tubo cónico de 50 ml contendo 40 ml de sacarose crioprotector (30% (w / v) de sacarose em tampão de fosfato 0,1 M, pH 7,4) no escuro a 4 ° C durante 24 h.
      NOTA: Os seguintes passos opcionais três podem ser utilizadas como uma alternativa para o protocolo principal, a fim de congelar o cérebro, nesta fase, para o armazenamento a longo prazo.
   6. Congelar todo o cérebro por imersão em 200 ml de isopentano que foi pré-arrefecido em gelo seco.
   7. Coloque o cérebro congelado para um tubo cónico de 50 ml e armazenar no escuro a -80 ° C.
   8. Quando pronto para prosseguir, descongelar o cérebro, colocando-o para um tubo cónico de 50 ml contendo 40 ml de crioprotector sacarose no escuro a 4 ° C durante 24 h.
2. Seccionamento cérebro
   1. Remover o cérebro a partir da sacarose e blocok ele para o corte, cortando o cerebelo usando uma lâmina de barbear e deixando uma borda plana na extremidade caudal restante do cérebro.
   2. agar de calor (3% (w / v) em água) até que seja derretida e deixada arrefecer até que esteja ligeiramente acima do seu ponto de fusão.
   3. Coloque o cérebro em uma pequena descartável pesam prato com sua extremidade caudal de face para baixo e adicionar uma quantidade suficiente de agar derretido para cobrir o cérebro.
   4. Depois do agar ter solidificado, aparar o excesso de ágar deixando cerca de 2 - 4 milímetros em torno do cérebro e cola do cérebro para o estágio de um vibratome com a sua extremidade caudal de face para baixo usando uma pequena quantidade de acetato de cola de cianoacrilato.
   5. Preencher a área de estágio de vibratome com uma quantidade suficiente de agente crioprotector sacarose para cobrir o cérebro, e a secção do cérebro com uma espessura de fatia de 400-500? M (dependendo da região do cérebro a ser examinadas) usando uma frequência de 86 Hz vibração e uma velocidade de avanço da lâmina de 0,125 mm / s.
   6. Usando um pincel pequeno, Secções lugar cérebro em um poço de uma placa de cultura de tecidos de 6 cavidades contendo inserções de malha de fundo comercialmente disponíveis e pré-carregada com 10 mL de 6% (w / v) de sacarose em tampão de fosfato 0,1 M, pH 7,4.
   7. Incubar secções no escuro a 4 ° CO / N.
3. Desenvolver seções do cérebro
   1. Usando as inserções de malha-inferior, transferir secções do cérebro para um novo poço contendo 5 ml de paraformaldeído a 2% (v / w) (PBD) em tampão fosfato 0,1 M, pH 7,4. Incubar num agitador rotativo em movimento a uma velocidade lenta no escuro à temperatura ambiente durante 15 min.
   2. Lavar duas vezes por secções transferindo-os para novos poços contendo 5 mL de água. Lavar num agitador rotativo em movimento a uma velocidade moderada, no escuro à temperatura ambiente durante 5 min.
   3. secções de transferência para um novo poço contendo 5 mL de 2,7% (v / v) de hidróxido de amónio. Incubar num agitador rotativo em movimento a uma velocidade lenta no escuro à temperatura ambiente durante 15 min.
   4. Lavar duas vezes por secções transferindo-os para novos poços contendo 5 mL de água. Lave ond balancim movendo-se a uma velocidade moderada, no escuro à temperatura ambiente durante 5 min.
   5. Secções de transferência para um novo poço contendo 5 ml de fixador A (ver Tabela Materiais) que foi diluída em água 10x a partir da sua concentração original é comprada. Incubar num agitador rotativo em movimento a uma velocidade lenta no escuro à temperatura ambiente durante 25 min.
   6. Lavar duas vezes por secções transferindo-os para novos poços contendo 5 mL de água. Lavar num agitador rotativo em movimento a uma velocidade moderada, no escuro à temperatura ambiente durante 5 min.
4. Montagem seções do cérebro
   1. Usando um pincel pequeno, montar secções em lâminas de microscópio. Remover o excesso de água e ágar usando uma pinça e um pequeno tecido. Certifique-se de que todos agar é removido antes de prosseguir com a desidratação.
   2. Permitir secções para secar ao ar à temperatura ambiente durante cerca de 45 min (400 seces) ou 90 min (500 seces).
      Observação: O nível de temporização e adequado de secura é crítico, e pode necessitar de ser determinada em cadalaboratório dependendo da temperatura ambiente e grau de humidade. Um tempo muito curto de secagem leva a seções caindo de slides durante passos de desidratação subsequentes e um tempo muito longo de secagem leva a seções de cracking. Seções ainda aparecerá para ser brilhante ao nível adequado de secura.
   3. secções de mancha com violeta de cresilo por colocação desliza para tinas de coloração Coplin como indicado.
      NOTA: Este passo opcional pode ser utilizado para seções que nunca tinham sido congeladas, para manchar núcleos neuronais com cresil violeta. Nós descobrimos que a compensação e reidratação seções antes da incubação em violeta cresil leva a ainda coloração e baixo fundo através seções.
      1. Colocar em agente de compensação, durante 5 min. Repetir uma vez.
      2. Colocar em etanol a 100% durante 5 min. Repetir uma vez.
      3. Colocar em 95% de etanol em água, depois 75% de etanol em água, e, em seguida, 50% de etanol em água durante 2 minutos cada.
      4. Colocar em água durante 5 minutos.
      5. Colocar em 0,5% (w / v) cresyl violeta em água durante 7 minutos.
      6. Colocar em água durante 2 min. Repetir uma vez.
   4. Desidratar secções colocando desliza para tinas de coloração Coplin como indicado.
      1. Colocar em 50% de etanol em água, depois 75% de etanol em água, e, em seguida, 95% de etanol em água durante 2 minutos cada.
      2. Colocar em etanol a 100% durante 5 min. Repetir uma vez.
      3. Colocar em agente de compensação, durante 5 min. Repetir uma vez.
         Nota: Estes desidratação e de compensação vezes são suficientes para processar cérebro do rato, conforme descrito neste manuscrito. No entanto, temos observado para outras espécies, incluindo ratos e cuco, que o passo de limpeza final, pode ter de ser alargada até 15 min total.
   5. secções lamela utilizando um meio de montagem anidro.
   6. Permitir que as lâminas secar horizontalmente no escuro à temperatura ambiente durante, pelo menos, 5 d.

2. Imagiologia manchado neurônios dentro de espessura de seções do cérebro

1. Capturando Pilhas de imagens
   1. Ligue a lâmpada microscópio, câmera e controlador de palco.
   2. Abra o software microscópio (por exemplo, Neurolucida).
   3. Coloque um slide no palco microscópio.
   4. Capturar uma imagem de toda a vista 2D da secção de cérebro utilizando uma objectiva de ampliação baixa, tais como 1,25X 0,4 NA PlanAPO ou 4X 0,16 NA
      1. Concentre-se imagem e ajustar as configurações da câmera, incluindo o tempo de exposição e balanço de branco.
      2. Criar um ponto de referência clicando com o botão esquerdo em qualquer lugar na seção
      3. Capturar a imagem, selecionando "adquirir uma única imagem" dentro da janela de aquisição de imagem.
   5. Capturar pilhas de imagens meio-resolução da área que contém os neurónios (s) de interesse, usando uma 10X 0,3 NA uPlan FL N objectivo.
      1. Focar a imagem e ajustar as configurações da câmera, incluindo a exposição e balanço de branco.
      2. Definir os limites superior e inferior para a pilha de imagens, concentrando-se ao topo da seção de umnd selecionar "set" ao lado de "topo da pilha" dentro da janela de aquisição da imagem e, em seguida, com foco para a parte inferior da seção e selecionar "set" ao lado de "fundo da pilha" dentro da janela de aquisição de imagem.
      3. Defina a distância passo para 5 mm, digitando "5 m" ao lado de "distância entre imagens" dentro da janela de aquisição de imagem.
      4. Capturar a pilha de imagens, selecionando "pilha de adquirir" dentro da janela de aquisição de imagem.
      5. Repetir as etapas acima para captar toda a área de interesse, certificando-se de que todas as pilhas de imagens se sobrepõem, pelo menos, 10% na eixos X e Y.
   6. Capturar pilhas de imagens de alta-resolução da zona contendo o neurónio de interesse, usando uma NA de silicone objectiva de imersão em óleo de 30X 1,05.
      1. Aplicar 3 - 4 gotas de óleo de silicone de imersão para o slide e coloque o objetivo sobre o slide, garantindo a fazer contato entre o objetivo e oieu.
      2. Focar a imagem e ajustar as configurações da câmera, incluindo a exposição e balanço de branco.
      3. Definir os limites superior e inferior para a pilha de imagens, concentrando-se ao topo da seção e selecionar "set" ao lado de "topo da pilha" dentro da janela de aquisição de imagem, e em seguida, com foco para a parte inferior da seção e selecionar "set" ao lado de "fundo da pilha" dentro da janela de aquisição de imagem.
      4. Defina a distância passo para 1 mm, digitando "1 mm" ao lado de "distância entre imagens" dentro da janela de aquisição de imagem.
      5. Capturar a pilha de imagens, selecionando "pilha de adquirir" dentro da janela de aquisição de imagem.
      6. Repetir as etapas acima para captar toda a área de interesse, certificando-se de que todas as pilhas de imagens se sobrepõem, pelo menos, 10% na eixos X e Y.
   7. Salve o arquivo de dados e salvar todos os arquivos de imagem em formato TIFF para processamento externo.
2. Criando Z-projeção Imagens e Imagem Montages
   1. Criar imagens Z-projecção em ImageJ
      1. software ImageJ aberto que tem o plugin Bio-Formatos instalado.
      2. Selecione "Plugins" -> "Bio-Formatos" -> "Bio-Formatos Importador".
      3. Selecione o arquivo de pilha para ser aberto.
      4. Uma vez que o arquivo é aberto, alterar o formato para RGB, selecionando "Imagem" -> "Type" -> "Cor RGB".
      5. Criar o Z-projeção, selecionando "Imagem" -> "Stacks" -> "Z Project ...".
      6. Salvar a imagem Z-projeção bidimensional como um arquivo TIFF.
   2. Criar uma montagem imagem bidimensional de toda a área de interesse.
      1. Abra o software (por exemplo, Adobe Photoshop).
      2. Selecione "Arquivo" -> "Automatizar" -> "Photomerge".
      3. Selecione "Procurar" e, em seguida, adicionar todos imagarquivos es a serem incorporadas.
      4. Certifique-se de que "Blend Images Together" é selecionada e, em seguida, selecione "OK".
      5. Salve a imagem montagem resultante de toda a área de interesse como um arquivo TIFF.

Resultados

Este protocolo de coloração de Golgi-Cox e suas duas variantes descritas opcionais podem ser utilizados para visualizar os neurónios individuais dentro de 400 - 500? M de espessura secções do cérebro. Montagens de imagem representativos de dois-dimensional Z-projecções capturados utilizando uma objectiva de 10X e 5? M passos no eixo Z são mostrados na Figura 1: A1 - C1 para uma grande área de secções cerebrais coronais, que inclui a área de córtex cingulado...

Discussão

Descrevemos aqui um protocolo de coloração de Golgi-Cox, juntamente com duas variantes úteis para visualizar os neurónios do cérebro dentro de secções espessas. Como mostrado nos resultados representativos, a utilização de uma objectiva de alta resolução que tem uma longa distância 800? M de trabalho permite a visualização dos neurónios de confiança inteiras ao longo da profundidade das secções de cérebro cortadas em 500 mm. Este estudo de secções de cérebro relativamente espessas aumenta a probabi...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
potassium dichromate	Fisher Scientific	P188-100	Hazardous
potassium chromate	Fisher Scientific	P220-100	Hazardous
mercuric chloride	Fisher Scientific	S25423	Hazardous
Whatman grade 1 filter paper	Fisher Scientific	1001-185
isoflurane	Pharmaceutical Partners of Canada	CP0406V2
20 mL scintillation vial	Fisher Scientific	03-337-4
sucrose	Bioshop Canada	SUC700.1
sodium phosphate monobasic	Sigma Aldrich	S5011-500G
sodium phosphate dibasic	Sigma Aldrich	S9390-500G
50 mL conical tube	Fisher Scientific	12-565-271
isopentane	Fisher Scientific	AC126470010	Also known as 2-methylbutane; hazardous
agar	Sigma Aldrich	A1296-100G
small weigh dish	Fisher Scientific	02-202-100
vibratome	Leica	VT1000 S
6-well tissue culture plates	Fisher Scientific	08-772-1b
mesh bottom tissue culture inserts	Fisher Scientific	07-200-214
paraformadelhyde (PFA), 16%	Electron Microscope Sciences	15710-S	Hazardous
ammonium hydroxide	Fisher Scientific	A669S-500	Hazardous
Kodak Fixative A	Sigma Aldrich	P7542
superfrost plus slides	Fisher Scientific	12-550-15
CitroSolv clearing agent	Fisher Scientific	22-143-975
anhydrous ethyl alcohol	Commercial Alcohols	N/A
cresyl violet	Sigma Aldrich	C1791
permount	Fisher Scientific	SP15-100
upright microscope	Olympus	BX53 model
colour camera, 12 bit	MBF Biosciences	DV-47d	QImaging part 01-MBF-2000R-F-CLR-12
3D motorized microscope stage, controller and enoders	MBF Biosciences	N/A	Supplied and integrated with microscope by MBF Biosciences
4X microscope objective	Olympus	4x 0.16 N.A. UplanSApo
10X microscope objective	Olympus	10x 0.3 N.A. UPlan FL N
30X microscope objective	Olympus	30x 1.05 N.A. UPlanSApo
60X microscope objective	Olympus	60x 1.42 N.A. PlanAPO N
silicone immersion oil	Olympus	Z-81114
Neurolucida software	MBF Biosciences	Version 10
ImageJ software	U. S. National Institutes of Health	Current version	With the OME Bio-Formats plugin installed
Photoshop software	Adobe	version CS6