Las neuronas de imágenes dentro de las secciones del cerebro gruesas, según el método de Golgi-Cox

Resumen

Se presenta un protocolo por el método de tinción de Golgi-Cox en secciones de cerebro de espesor, con el fin de visualizar las neuronas con árboles dendríticos largas contenidos dentro de muestras de tejido individuales. También se presentan dos variantes de este protocolo que implica cresilo contratinción violeta, y la congelación de los cerebros no transformadas para almacenamiento a largo plazo.

Resumen

El método de Golgi-Cox de la tinción de las neuronas ha sido empleado durante más de doscientos años para avanzar en nuestra comprensión de la morfología de las neuronas dentro del cerebro muestras histológicas. Si bien es preferible desde un punto de vista práctico para preparar secciones de cerebro en el mayor espesor posible, a fin de aumentar la probabilidad de identificar neuronas teñidas que están contenidos completamente dentro de las secciones individuales, este enfoque es limitado desde un punto de vista técnico por la distancia de trabajo de alto -magnification objetivos de microscopio. Presentamos aquí un protocolo para teñir las neuronas utilizando el método de Golgi-Cox en secciones de cerebro de ratón que se cortan en 500 espesor m, y para visualizar las neuronas en toda la profundidad de estas secciones usando un microscopio vertical equipado con una alta resolución de 30X de silicona 1,05 NA objetivo de inmersión en aceite que tiene una distancia de trabajo de 800 m. describen además dos variantes útiles de este protocolo que se puede emplear para contrateñir la superficie demontado secciones de cerebro con la tinción de violet Nissl de cresilo, o para congelar los cerebros enteros para almacenamiento a largo plazo antes de seccionar y el procesamiento final. El protocolo principal y sus dos variantes producen secciones de cerebro de espesor manchadas, a lo largo de la cual los árboles neurona dendríticas completos y espinas dendríticas se pueden visualizar y cuantificar de forma fiable.

Introducción

La visualización de las neuronas individuales dentro de muestras de tejido permite el análisis in situ de las neuronas características morfológicas, que ha avanzado significativamente nuestra comprensión del cerebro y cómo puede ser influenciado por la enfermedad endógena o factores ambientales exógenas. El método de tinción de Golgi-Cox es un medio rentables, relativamente simples de la tinción de una muestra aleatoria de las neuronas dentro del cerebro. En primer lugar desarrollado por Golgi ¹ y modificado por Cox ² en la década de 1800, los investigadores han perfeccionado esta técnica en los últimos años para producir neuronas claros y bien teñidas con que se pueden utilizar para visualizar y cuantificar tanto la morfología del árbol dendrítico y la densidad de la columna ^{3, 4, 5, 6, 7, 8, 9}.

Una consideración técnica importante para la visualización de las neuronas teñidas dentro de las secciones del cerebro es el espesor máximo rebanada, que está limitada por la distancia de trabajo de los objetivos disponibles de gran aumento / de alta resolución del microscopio. objetivos de inmersión en aceite comunes en el 60 - 100X gama proporcionan una excelente resolución, pero están limitados por sus distancias de trabajo que son típicamente no mayor de 200 m. Las secciones de cerebro de corte en el rango de 200 micras pueden ser adecuadas para visualizar ciertos tipos de neuronas que pueden estar contenidos dentro de este grosor de corte, por ejemplo las neuronas piramidales en las capas superficiales de la corteza cerebral ^{10, 11, 12,} las neuronas piramidales en la región CA1 de la hipocampo ^{13, 14,} y las células granulares en el giro dentado del hipocampo ^15. Las neuronas con relativamente más largoárboles dendríticos, tales como las neuronas piramidales en las capas profundas de la corteza cerebral que para el ratón se puede extender más de 800 m desde el cuerpo celular ^16, proporcionan un mayor reto porque tendrían que ser seccionada en un ángulo perfecto cerebros para contener todo el árbol de dendritas dentro de los 200 m rodajas. Esto puede incluso no ser factible si una dendrita o cualquiera de sus ramas se extienden en la dirección rostral o caudal. Si bien es posible abordar esta limitación mediante el trazado de una neurona a través de múltiples secciones de cerebro adyacentes, este enfoque presenta un desafío técnico significativo en la alineación de las secciones con precisión para la localización ^17. Un enfoque más práctico sería para visualizar las neuronas enteras contenidas dentro de las secciones del cerebro que se cortan en un espesor mayor.

Presentamos aquí una técnica para teñir las neuronas dentro de 400 - secciones de cerebro de espesor 500 micras de ratones utilizando el método de Golgi-Cox, y para visualizar su morphology usando un silicio objetivo de inmersión en aceite de alta resolución que tiene una distancia de trabajo de 800 m. La impregnación y el procesamiento de protocolo de Golgi-Cox que describimos se modificó a partir de uno de los protocolos modernos más citados en la literatura ^6. Nuestro enfoque con secciones de cerebro de espesor proporciona la ventaja de aumentar la probabilidad de identificar neuronas de cualquier tipo que están contenidos completamente dentro de la sección. Además del protocolo principal, también presentes dos variaciones que proporcionan ventajas únicas: (1) la tinción de Golgi-Cox con la contratinción cresil violeta en la superficie de las secciones montadas, con el fin de definir los límites de las regiones del cerebro y para identificar capas de la corteza cerebral, y (2) tinción de Golgi-Cox con una etapa de congelación intermedio para el almacenamiento a largo plazo de cerebros enteros impregnadas antes de seccionar y el procesamiento final.

Protocolo

ratones CD1-deformación hembras adultas se utilizaron en este estudio. tinción similar se puede lograr usando ambos sexos en diversas edades. Los animales experimentales fueron atendidos de acuerdo a los principios y directrices del Consejo Canadiense de los Animales, y el protocolo experimental fue aprobado por la Universidad de Guelph Cuidado de Animales.

1. Golgi-Cox tinción

1. Golgi-Cox La impregnación de cerebros
   1. Hacer la solución Golgi-Cox de 1% (w / v) de dicromato de potasio, 0,8% (w / v) de cromato de potasio y 1% (w / v) de cloruro de mercurio disolviendo el dicromato de potasio y cromato de potasio en agua de alta calidad por separado . Mezclar las soluciones, añadir el cloruro de mercurio y filtrar la solución final utilizando grado 1 papel de filtro. Guardar la solución en la oscuridad durante un máximo de un mes.
   2. Anestesiar al ratón usando 5% de isoflurano.
   3. La eutanasia el ratón por decapitación y eliminar rápidamente el cerebro.
   4. Coloque el cerebro en un vial de centelleo de 20 mL glass que contenía 17 ml de solución de Golgi-Cox y se incuba en la oscuridad a TA durante 25 d.
   5. Cryoprotect el cerebro colocándolo en un tubo cónico de 50 ml que contenía 40 ml de sacarosa crioprotector (30% (w / v) de sacarosa en tampón fosfato 0,1 M, pH 7,4) en la oscuridad a 4 ° C durante 24 h.
      Nota: Las siguientes tres pasos opcionales se pueden emplear como alternativa al protocolo principal, con el fin de congelar el cerebro en esta etapa para el almacenamiento a largo plazo.
   6. Congelar todo el cerebro sumergiéndolo en 200 ml de isopentano que ha sido previamente enfriada en hielo seco.
   7. Coloque el cerebro congelado en un tubo cónico de 50 ml y almacenar en la oscuridad a -80 ° C.
   8. Cuando esté listo para proceder, descongelar el cerebro colocándolo en un tubo cónico de 50 ml que contiene 40 ml de crioprotector sacarosa en la oscuridad a 4 ° C durante 24 h.
2. Seccionamiento cerebro
   1. Retire el cerebro de la sacarosa y el bloquek es para seccionar cortando el cerebelo utilizando una hoja de afeitar y dejando un borde plano en el extremo caudal restante del cerebro.
   2. agar de calor (3% (w / v) en agua) hasta que se funde y se deja enfriar hasta que esté ligeramente por encima de su punto de fusión.
   3. Coloque el cerebro en un pequeño plato desechable sopesar con su extremo caudal boca abajo y añadir una cantidad suficiente de agar fundido para cubrir el cerebro.
   4. Una vez que el agar se ha solidificado, recortar el exceso de agar dejando aproximadamente de 2 - 4 mm que rodea el cerebro y la cola del cerebro a la etapa de un vibratome con su cara hacia abajo extremo caudal usando una pequeña cantidad de pegamento de cianoacrilato de etilo.
   5. Llenar el área de la etapa de la vibratome con una cantidad suficiente de crioprotector sacarosa para cubrir el cerebro, y la sección del cerebro en un grosor de corte alcanzan 400 - 500! M (dependiendo de la región del cerebro a ser examinado) usando una frecuencia de vibración de 86 Hz y una velocidad de avance de la hoja de 0,125 mm / s.
   6. Usando un pequeño pincel, Secciones lugar cerebro en un pocillo de una placa de cultivo tisular de 6 pocillos que contiene insertos y de malla inferior comercialmente disponibles precargada con 10 ml de 6% (w / v) de sacarosa en tampón fosfato 0,1 M, pH 7,4.
   7. Incubar las secciones en la oscuridad a 4 ° CO / N.
3. El desarrollo de las secciones del cerebro
   1. El uso de los insertos de malla inferior, transferir secciones de cerebro en un nuevo pocillo que contenía 5 ml de paraformaldehído al 2% (v / w) (PBD) en tampón de fosfato 0,1 M, pH 7,4. Incubar en un eje de balancín se mueve a velocidad lenta en la oscuridad a TA durante 15 min.
   2. Lavar las secciones dos veces transfiriéndolos a nuevos pocillos que contienen 5 ml de agua. Lavar en un eje de balancín se mueve a una velocidad moderada en la oscuridad a TA durante 5 min.
   3. secciones de transferencia en un nuevo pocillo que contenía 5 ml de 2,7% (v / v) de hidróxido de amonio. Incubar en un eje de balancín que se mueve a una velocidad lenta en la oscuridad a TA durante 15 min.
   4. Lavar las secciones dos veces transfiriéndolos a nuevos pocillos que contienen 5 ml de agua. lavar ona eje de balancín se mueve a una velocidad moderada en la oscuridad a TA durante 5 min.
   5. Secciones de transferencia en un nuevo pocillo que contenía 5 ml de fijador A (ver Tabla de Materiales) que ha sido diluido en 10 veces de agua de su original concentración comprado. Incubar en un eje de balancín que se mueve a una velocidad lenta en la oscuridad a TA durante 25 min.
   6. Lavar las secciones dos veces transfiriéndolos a nuevos pocillos que contienen 5 ml de agua. Lavar en un eje de balancín se mueve a una velocidad moderada en la oscuridad a TA durante 5 min.
4. Montaje de las secciones del cerebro
   1. Usando un pincel pequeño, montar las secciones en portaobjetos de microscopio. Eliminar el exceso de agua y agar usando pinzas y una pequeña de tejido. Asegúrese de que todo el agar se retira antes de proceder a la deshidratación.
   2. Permitir secciones se sequen al aire a temperatura ambiente durante aproximadamente 45 min (400 m secciones) o 90 min (500 m secciones).
      NOTA: El nivel de temporización y adecuado de sequedad es crítica, y puede necesitar ser determinado en cadalaboratorio dependiendo de la temperatura ambiente y nivel de humedad. Demasiado corto un tiempo de secado conduce a las secciones que están fuera de las diapositivas durante etapas de deshidratación posteriores, y demasiado largo de un tiempo de secado conduce a secciones de craqueo. Secciones todavía parecen ser brillante en el nivel apropiado de sequedad.
   3. secciones se tiñen con violeta de cresilo mediante la colocación de diapositivas en recipientes de tinción Coplin como se indica.
      NOTA: Este paso opcional puede emplearse para las secciones que nunca habían sido congelados, con el fin de teñir los núcleos neuronales con violeta de cresilo. Hemos encontrado que la compensación y la rehidratación de las secciones antes de la incubación en violeta de cresilo conduce a incluso las manchas y bajo fondo a través de secciones.
      1. Colocar en agente de compensación durante 5 min. Repita una vez.
      2. Colocar en 100% de etanol durante 5 min. Repita una vez.
      3. Colocar en etanol al 95% en agua, a continuación, 75% de etanol en agua, y luego etanol al 50% en agua durante 2 min cada una.
      4. Colocar en agua durante 5 min.
      5. Colocar en 0,5% cre (v / w)violeta Syl en agua durante 7 min.
      6. Colocar en agua durante 2 min. Repita una vez.
   4. Deshidratar secciones mediante la colocación de diapositivas en recipientes de tinción Coplin como se indica.
      1. Colocar en 50% de etanol en agua, luego 75% de etanol en agua, y luego etanol al 95% en agua durante 2 min cada una.
      2. Colocar en 100% de etanol durante 5 min. Repita una vez.
      3. Colocar en agente de compensación durante 5 min. Repita una vez.
         Nota: Estos deshidratación y de compensación veces son suficientes para procesar cerebros de ratón como se describe en este manuscrito. Sin embargo, hemos observado para otras especies, incluida la rata y cowbird, que puede necesitar ser extendido hasta 15 min total de la etapa de limpieza final.
   5. secciones cubreobjetos usando un medio de montaje anhidro.
   6. Permitir que se sequen horizontalmente en la oscuridad a temperatura ambiente durante al menos 5 d.

2. Imaging manchado neuronas en el cerebro secciones gruesas

1. La captura de Pilas de imágenes
   1. Encender la bombilla de luz del microscopio, cámara, y el controlador de fase.
   2. Abra el software de microscopio (por ejemplo, Neurolucida).
   3. Coloque una diapositiva en la platina del microscopio.
   4. Capturar una en toda la vista de la imagen 2D de la sección de cerebro usando un objetivo de baja magnificación como 1,25X 0,4 NA PlanApo o 4X 0,16 NA
      1. Enfoque la imagen y ajustar la configuración de la cámara, incluyendo el tiempo de exposición y balance de blancos.
      2. Crear un punto de referencia haciendo clic izquierdo en cualquier parte de la sección
      3. Capture la imagen seleccionando la opción "recibir la imagen única" dentro de la ventana de adquisición de imágenes.
   5. Captura mediados de resolución pilas de imágenes de la zona que contiene las neuronas (s) de interés, usando un 10X 0,3 objetivo NA UPlan FL N.
      1. Enfocar la imagen y ajustar la configuración de la cámara, incluyendo la exposición y el balance de blancos.
      2. Establecer los límites superior e inferior de la pila de imágenes, centrándose en la parte superior de la sección de unand selección de "ajuste" al lado de "parte superior de la pila" dentro de la ventana de adquisición de imágenes, y luego se centra en la parte inferior de la sección y seleccionando "set" al lado de "parte inferior de la pila" dentro de la ventana de adquisición de imágenes.
      3. Ajuste la distancia de paso de 5 micras mediante la introducción de "5 micras" junto a "distancia entre imágenes" dentro de la ventana de adquisición de imágenes.
      4. Capturar la pila de imágenes mediante la selección de "pila de adquirir" dentro de la ventana de adquisición de imágenes.
      5. Repita los pasos anteriores para capturar toda el área de interés, asegurándose de que todas las pilas de imágenes se superponen en al menos un 10% en los ejes X e Y.
   6. Captura de alta resolución pilas de imágenes de la zona que contiene la neurona de interés, utilizando un 30X 1,05 NA silicona objetivo de inmersión en aceite.
      1. Aplicar 3 - 4 gotas de aceite de inmersión de silicona a la diapositiva y coloque el objetivo sobre el portaobjetos, asegurando a hacer contacto entre el objetivo y el OIl.
      2. Enfocar la imagen y ajustar la configuración de la cámara, incluyendo la exposición y el balance de blancos.
      3. Establecer los límites superior e inferior de la pila de imágenes, centrándose en la parte superior de la sección y seleccionando "set" al lado de "parte superior de la pila" dentro de la ventana de adquisición de imágenes, y luego se centra en la parte inferior de la sección y seleccionando "set" junto a "parte inferior de la pila" dentro de la ventana de adquisición de imágenes.
      4. Ajuste la distancia de paso de 1 m mediante la introducción de "1 m" al lado de "distancia entre imágenes" dentro de la ventana de adquisición de imágenes.
      5. Capturar la pila de imágenes mediante la selección de "pila de adquirir" dentro de la ventana de adquisición de imágenes.
      6. Repita los pasos anteriores para capturar toda el área de interés, asegurándose de que todas las pilas de imágenes se superponen en al menos un 10% en los ejes X e Y.
   7. Guarde el archivo de datos y guardar todos los archivos de imagen en formato TIFF para el procesamiento externo.
2. La creación de Z-proyección imágenes y sus montajes
   1. Crear imágenes Z-proyección en ImageJ
      1. el software ImageJ abierto que ha instalado el plugin Bio-formatos.
      2. Seleccione "Plug-ins" -> "Bio-formatos" -> "Bio-Formatos importador".
      3. Seleccione el archivo de imagen de pila que se abrirá.
      4. Una vez abierto el archivo, cambiar el formato a RGB seleccionando la opción "Imagen" -> "Tipo" -> "Color RGB".
      5. Crear el Z-proyección seleccionando "Imagen" -> "Pilas" -> "Z proyecto ...".
      6. Guarda la imagen Z-proyección bidimensional como un archivo TIFF.
   2. Crear un montaje de imagen bidimensional de toda el área de interés.
      1. Abra el software (por ejemplo, Adobe Photoshop).
      2. Seleccione "Archivo" -> "Automatizar" -> "Photomerge".
      3. Seleccione "Examinar" y luego añadir todas imagES archivos que se fusionen.
      4. Asegurar que "Blend Images Juntos" está seleccionado y luego seleccione "OK".
      5. Guardar la imagen resultante montaje de toda el área de interés como un archivo TIFF.

Resultados

Este protocolo de tinción Golgi-Cox y sus dos variantes opcionales descritos pueden emplearse para visualizar las neuronas individuales dentro de 400 - 500 micras secciones de cerebro de espesor. Montajes de imágenes representativos de dos dimensiones Z-proyecciones capturados usando un objetivo de 10X y 5 micras pasos en el eje Z se muestran en la Figura 1: A1 - C1 para un área grande de secciones cerebrales coronales que incluye el área de la corteza cingulada ante...

Discusión

Se describe aquí un protocolo de tinción Golgi-Cox junto con dos variantes útiles para la visualización de las neuronas dentro de las secciones del cerebro de espesor. Como se muestra en los resultados representativos, el uso de un objetivo de alta resolución que tiene una larga distancia m de trabajo 800 permite la visualización fiable de las neuronas enteras a lo largo de la profundidad de las secciones del cerebro cortadas a 500! M. Este estudio de secciones del cerebro relativamente gruesas aumenta la probabil...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
potassium dichromate	Fisher Scientific	P188-100	Hazardous
potassium chromate	Fisher Scientific	P220-100	Hazardous
mercuric chloride	Fisher Scientific	S25423	Hazardous
Whatman grade 1 filter paper	Fisher Scientific	1001-185
isoflurane	Pharmaceutical Partners of Canada	CP0406V2
20 mL scintillation vial	Fisher Scientific	03-337-4
sucrose	Bioshop Canada	SUC700.1
sodium phosphate monobasic	Sigma Aldrich	S5011-500G
sodium phosphate dibasic	Sigma Aldrich	S9390-500G
50 mL conical tube	Fisher Scientific	12-565-271
isopentane	Fisher Scientific	AC126470010	Also known as 2-methylbutane; hazardous
agar	Sigma Aldrich	A1296-100G
small weigh dish	Fisher Scientific	02-202-100
vibratome	Leica	VT1000 S
6-well tissue culture plates	Fisher Scientific	08-772-1b
mesh bottom tissue culture inserts	Fisher Scientific	07-200-214
paraformadelhyde (PFA), 16%	Electron Microscope Sciences	15710-S	Hazardous
ammonium hydroxide	Fisher Scientific	A669S-500	Hazardous
Kodak Fixative A	Sigma Aldrich	P7542
superfrost plus slides	Fisher Scientific	12-550-15
CitroSolv clearing agent	Fisher Scientific	22-143-975
anhydrous ethyl alcohol	Commercial Alcohols	N/A
cresyl violet	Sigma Aldrich	C1791
permount	Fisher Scientific	SP15-100
upright microscope	Olympus	BX53 model
colour camera, 12 bit	MBF Biosciences	DV-47d	QImaging part 01-MBF-2000R-F-CLR-12
3D motorized microscope stage, controller and enoders	MBF Biosciences	N/A	Supplied and integrated with microscope by MBF Biosciences
4X microscope objective	Olympus	4x 0.16 N.A. UplanSApo
10X microscope objective	Olympus	10x 0.3 N.A. UPlan FL N
30X microscope objective	Olympus	30x 1.05 N.A. UPlanSApo
60X microscope objective	Olympus	60x 1.42 N.A. PlanAPO N
silicone immersion oil	Olympus	Z-81114
Neurolucida software	MBF Biosciences	Version 10
ImageJ software	U. S. National Institutes of Health	Current version	With the OME Bio-Formats plugin installed
Photoshop software	Adobe	version CS6