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摘要

我们提出了一个协议，用于使用所述高尔基体考克斯染色法在厚的脑切片中，为了可视化与包含单个组织样品中的树突状长树木神经元。此协议的两种变型还提出涉及甲酚紫复染，和未加工的大脑进行长期存储的冻结。

摘要

神经细胞染色的高尔基 - 考克斯方法已使用超过两百年的脑组织样本中推进我们的神经元形态的理解。虽然它是从实用的观点考虑，优选以制备在最大厚度可能脑切片中，为了提高识别被完全包含单个区段内染色的神经元的概率，该方法是从由高工作距离技术的角度有限-magnification显微镜物镜。我们在这里报告的协议使用在小鼠脑切片的高尔基体考克斯方法，其是在500米微米厚的切割染色的神经元，并使用配有高分辨率30X 1.05 NA硅氧烷直立显微镜遍及这些区段的深度可视化的神经元油浸物镜，其具有800μm的工作距离。我们还报告这个协议可用于复染的表面的两个有用的变体安装的脑切片用甲酚紫染色尼斯尔，或以切片和最后的处理之前，冻结长期储存整个大脑。的主要协议和它的两个变体产生染色的厚的脑切片，在整个这充分神经元的树突树和枝晶棘可以可靠地可视化和量化。

引言

单个神经元的组织样本中的可视化允许的神经元形态特征的原位分析，已显著提高了我们的大脑的理解，以及如何可以通过内源性疾病或外生环境因素的影响。高尔基-考克斯染色方法是在大脑中的神经元染色的随机样本的具有成本效益的，相对简单的装置。首先通过高尔基1在19世纪开发并由考克斯2改性，研究人员已经进一步改进这种技术多年来，以产生清晰，染色的神经元可被用于可视化和量化两者树突树形态和棘密度3,4 5，6，7，8，9。

对于染色的神经元的脑切片中的可视化的一个主要技术考虑是最大的切片厚度，这是由可用高倍率/高分辨率显微镜物镜的工作距离的限制。在60共同油浸物镜 - 100X范围上提供优异的分辨率，但他们的工作距离是通常不超过200微米的更大的限制。在200微米范围内切脑切片可能是足够的可视化可以被包含在此切片厚度内的某些神经元类型，在大脑皮质10，11，12，在的CA1区锥体细胞的浅层示例锥体神经元海马13，14，和颗粒细胞在海马15的齿状脑回。相对较长的神经元树突树，如大脑皮层的深层内锥体神经元，对于鼠标可以从细胞体16延伸大于800μm，提供了更大的挑战，因为大脑将需要在一个完美的角度被分段以包含整个树突树在200倍微米的切片。这甚至可能不是可行的，如果枝晶或任何其分支在延髓或尾方向延伸。虽然可以通过跟踪在多个相邻的脑切片中的神经元，以解决此限制，这种方法引入了在准确对准部分用于跟踪17显著的技术挑战。一个更实际的方法是可视化包含被以更大的厚度切脑切片内整个神经元。

我们在这里报告的技术染色400元以内 - 使用高尔基 - 考克斯方法小鼠的500微米厚的脑切片，并以可视化的MOrphology使用具有800微米的工作距离的高分辨率硅油浸物镜。我们描述了高尔基体考克斯浸渍和处理协议从最引用的现代协议之一在文献6改性。我们的与厚的脑切片方法提供了增加的标识被完全包含在节中的任何类型的神经元的概率的优点。除了主协议中，我们还提供独特的优点本两个变化:（1）高尔基体考克斯染色具有安装部分的表面上的甲酚紫染液中，为了限定脑区的边界，并确定的层大脑皮层，和（2）高尔基体考克斯染色与之前切片和最后的处理浸渍整个大脑的长期存储的中间冷冻步骤。

研究方案

成年雌性CD1系小鼠在本研究中使用。类似的染色可以在不同的年龄段使用两种性别来完成。实验动物照顾根据原则和加拿大动物保护协会的指导方针，以及实验方案经圭尔夫大学动物保护委员会的大学。

1.高尔基考克斯染色

  1. 脑的高尔基-考克斯浸渍
    1. 由重铬酸钾和铬酸钾成高品质的水分别溶解使1％的高尔基体考克斯溶液（W / V）的重铬酸钾，0.8％（W / V）的铬酸钾和1％（W / V）氯化汞。混合溶液中，添加氯化汞和过滤器使用1级滤纸最终溶液。存储长达一个月在黑暗中的解决方案。
    2. 麻醉，用5％异氟醚的鼠标。
    3. 断头安乐死鼠标，迅速取出大脑。
    4. 放置大脑到含有17毫升的高尔基考克斯溶液20mL玻璃闪烁瓶中，并在室温在黑暗中孵育25天。
    5. 通过在4℃下将其置于含有40毫升蔗糖的冷冻保护剂的50mL锥形管中（30％（W / V）蔗糖的0.1M磷酸盐缓冲液，pH 7.4）在黑暗中24小时Cryoprotect大脑。
      注:以下可选三个步骤可被用作替代的主要协议，为了冻结所述的脑在此阶段对于长期储存。
    6. 通过将其浸入已预冷在干冰上200毫升异戊烷冻结整个大脑。
    7. 放置冷冻大脑进入在黑暗中的50mL锥形管中，并储存在-80℃。
    8. 当准备好继续时，通过将其放置到含有40毫升在黑暗中蔗糖的冷冻保护剂在4℃下24小时的50mL锥形管解冻大脑。
  2. 脑切片
    1. 从蔗糖和集团取出大脑ķ它用于通过切断使用刀片小脑和在脑的剩余尾端留下一平边缘切片。
    2. 热琼脂（3％（重量/体积）的水），直到它被熔化并放冷，直到它是稍微高于其熔点。
    3. 放置在脑以其尾端面朝下一个小一次性称重盘中，并添加熔融的琼脂足够量的以覆盖大脑。
    4. 一旦琼脂凝固后，修剪多余琼脂留下大约2 - 4毫米大脑周围和胶水大脑使用乙基氰基丙烯酸酯胶少量其尾端面朝下一个振动切片机的阶段。
    5. 填充蔗糖的冷冻保护剂的足量的振动切片机的阶段区以覆盖所述脑，和部分中的脑在400层厚 - 使用86赫兹的振动频率为500μm（取决于大脑区域待检查）和为0.125mm / s的刀片前进速度。
    6. 使用小油漆刷，地点脑切片成含有市售的网状底部插入和6孔组织培养板的孔中的预填充用10mL的6％的0.1M磷酸盐缓冲液，pH 7.4（W / V）蔗糖。
    7. 在4℃CO / N孵育在黑暗部分。
  3. 开发脑切片
    1. 使用网状底部插入，在0.1M磷酸盐缓冲液，pH 7.4中转移的脑切片到一个新的孔含有5毫升的2％（W ​​/ V）多聚甲醛（PBD）。孵育上的摇杆以低速在黑暗中在RT移动15分钟。
    2. 通过将它们转移到含有5毫升水新井洗部分两次。洗上的摇杆以中等速度在黑暗中在RT移动5分钟。
    3. 转移部分到含有5毫升的2.7％（V / V）氢氧化铵一个新井。孵育上的摇杆以缓慢的速度在黑暗中在RT移动15分钟。
    4. 通过将它们转移到含有5毫升水新井洗部分两次。 Ø洗净呐摇杆以中等速度在黑暗中在RT移动5分钟。
    5. 转印部到一个新的孔含有5毫升固定剂A的（见材料表 ），其具有在水中的10倍稀释从其原始购买浓度。孵育上的摇杆以缓慢的速度在黑暗中在RT移动25分钟。
    6. 通过将它们转移到含有5毫升水新井洗部分两次。洗上的摇杆以中等速度在黑暗中在RT移动5分钟。
  4. 安装脑切片
    1. 使用小油漆刷，安装部到显微镜载玻片上。除去过量的水和琼脂使用镊子和小组织。确保所有琼脂和脱水继续之前除去。
    2. 允许部分空气干燥在室温约45分钟（400个微米的部分）或90分钟（500个微米的部分）。
      注:干的时间和适当的水平是关键的，并且可能需要在每一个都被确定实验室取决于环境温度和湿度水平。过短的干燥时间，导致在随后的脱水步骤脱落幻灯片的部分，和太长的干燥时间导致部分开裂。部分将仍然显得有光泽，在干燥的适当水平。
    3. 通过将滑动到科普林染色瓶当指示用甲酚紫染色切片。
      注:此可选步骤可以采用一种从未冰冻切片，以染色用甲酚紫神经元细胞核。我们发现，清理和甲酚紫孵育前补水部分导致甚至染色和跨节低背景。
      1. 在清除剂5分钟放置。重复一次。
      2. 在100％乙醇放置5分钟。重复一次。
      3. 在95％乙醇中放置水，再用75％乙醇在水中，然后在水中50％的乙醇，每次2分钟。
      4. 在水中放置5分钟。
      5. 在0.5％的地方（W / V）CRESYL在水中呈紫色7分钟。
      6. 在水中放置2分钟。重复一次。
    4. 通过将滑动到科普林染色罐子所示脱水部分。
      1. 在50％乙醇中放置水，再用75％乙醇在水中，然后在水中95％的乙醇，每次2分钟。
      2. 在100％乙醇放置5分钟。重复一次。
      3. 在清除剂5分钟放置。重复一次。
        注意:这些脱水和清洁时间足以在这个手稿中描述处理小鼠的大脑。然而，我们观察到对其他物种，包括大鼠和牛鹂属，最终结算步骤可能需要被延长至15分钟总。
    5. 使用无水安装平台盖玻片部分。
    6. 允许滑动以水平地在黑暗中在室温下至少5天干燥。

2.厚脑切片内成像彩色神经元

  1. 捕获图像堆栈
    1. 打开显微镜灯泡，相机和阶段控制器。
    2. 打开显微镜软件（ 例如 ，Neurolucida）。
    3. 放置在显微镜载物台上的滑动。
    4. 使用低放大倍数的物镜如1.25X 0.4 NA PlanAPO或4X 0.16 NA捕获脑切片的2D宽视图图像
      1. 焦点图像和调整相机设置包括曝光时间和白平衡。
      2. 上一节创建左键点击一个参考点的任何位置
      3. 通过选择图像采集窗口内"获取单个图像"捕获图像。
    5. 捕获包含感兴趣的神经元（多个）区域的中间分辨率图像栈，使用10X 0.3 NA UPlan FLÑ目标。
      1. 聚焦图像和调整相机设置包括曝光和白平衡。
      2. 通过集中到一个部分的顶部设置用于图像堆栈中的上和下边界第二选择"设置"图像采集窗口内旁边的"堆栈的顶部"，然后聚焦到段的底部，并选择所述图像采集窗口内"设置"旁边的"栈的底部"。
      3. 由图像采集窗口内输入"5微米"旁边的"距离图像之间的"设定为5μm的步距。
      4. 由图像采集窗口内选择"获取图像堆栈"捕获图像栈。
      5. 重复上述步骤，以捕获感兴趣的整个区域，确保所有图像栈至少10％，在X和Y轴重叠。
    6. 捕获包含感兴趣的神经元区域的高分辨率图像栈，使用30X 1.05 NA硅油浸泡的目的。
      1. 申请3 - 硅浸油4滴于载玻片并把目标在幻灯片，确保能够使目标与爱之间的接触湖
      2. 聚焦图像和调整相机设置包括曝光和白平衡。
      3. 通过集中到该部分的顶部，并选择"设定"设定为图像堆栈中的上和下边界旁图像采集窗口内，然后"堆的顶部"聚焦到段的底部，并选择"设置"图像采集窗口内旁边的"栈的底部"。
      4. 由图像采集窗口内输入"1微米"旁边的"距离图像之间的"设置为1微米的步距。
      5. 由图像采集窗口内选择"获取图像堆栈"捕获图像栈。
      6. 重复上述步骤，以捕获感兴趣的整个区域，确保所有图像栈至少10％，在X和Y轴重叠。
    7. 保存数据文件和TIFF格式保存所有图像文件进行外部处理。
  2. 创建Z-投影图像和图像的剪辑画面
    1. 创建ImageJ的Z-投影图像
      1. 已经安装了生物格式插件打开ImageJ软件。
      2. 选择"插件" - >"生物格式" - >"生物格式进口商"。
      3. 选择图像栈要打开的文件。
      4. >"类型" - - >"RGB颜色"一旦文件被打开，通过选择"图像"更改格式为RGB。
      5. 通过选择 "图像" 创建Z-投影 - > "堆栈" - > "Z项目..."。
      6. 保存的二维Z-投影图像为TIFF文件。
    2. 创建感兴趣整个区域的二维图像蒙太奇。
      1. 打开软件（ 如 Adobe公司的Photoshop）。
      2. 选择 "文件" - > "自动完成" - > "的Photomerge"。
      3. 选择"浏览"，然后添加所有IMAGES文件合并。
      4. 确保"混合图像一起"被选中，然后选择"OK"。
      5. 保存的利益为TIFF文件的整个区域的产生蒙太奇图像。

结果

此高尔基体考克斯染色方案和它的两个描述可选的变体可以被采用以400个内可视化的单个神经元 - 500微米厚的脑切片。使用10X物镜和在Z轴5层微米的步骤捕获的二维Z-突起的代表性图像的蒙太奇显示在图1:A1 - C1为冠状脑切片的大面积，其包括前扣带回皮层区域1和次级运动皮层18。切片在500微米切割。需要注意的是，其包括甲酚紫染色的协议变...

讨论

我们在这里介绍一个高尔基考克斯染色协议了两个有用的变种沿着厚的脑切片中神经元的可视化。正如代表结果所示，使用具有长800μm的工作距离的高分辨率目标的允许整个神经元在整个500μm的切割脑切片的深度可靠可视化。比较厚的脑切片的这项研究增加了任何类型的神经元染色完全包含切片，这是长而复杂的顶端树突树锥体神经元是特别重要内的概率。例如，在啮齿动物的脑中的冠状切片，?...

披露声明

作者宣称，他们没有竞争的经济利益。

致谢

这项工作是由一个发现格兰特CDCB从自然科学和加拿大（NSERC）工程研究理事会，加拿大创新基金会（CFI项目编号30381），约翰·R·埃文斯领导基金研究基础设施补助金CDCB，并支持发现格兰特NJM从NSERC。 ELL是由安大略研究生奖学金和安大略兽医学院的奖学金OVC圭尔夫大学的支持。 CDS是由NSERC本科生助研支持。 ALM是由NSERC亚历山大·格雷厄姆·贝尔奖学金和安大略兽医学院在圭尔夫大学的奖学金OVC支持。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
potassium dichromateFisher ScientificP188-100Hazardous
potassium chromateFisher ScientificP220-100Hazardous
mercuric chlorideFisher ScientificS25423Hazardous
Whatman grade 1 filter paperFisher Scientific1001-185
isofluranePharmaceutical Partners of CanadaCP0406V2
20 mL scintillation vialFisher Scientific03-337-4
sucroseBioshop CanadaSUC700.1
sodium phosphate monobasicSigma AldrichS5011-500G
sodium phosphate dibasicSigma AldrichS9390-500G
50 mL conical tubeFisher Scientific12-565-271
isopentaneFisher ScientificAC126470010Also known as 2-methylbutane; hazardous
agarSigma AldrichA1296-100G
small weigh dishFisher Scientific02-202-100
vibratomeLeicaVT1000 S
6-well tissue culture platesFisher Scientific08-772-1b
mesh bottom tissue culture insertsFisher Scientific07-200-214
paraformadelhyde (PFA), 16%Electron Microscope Sciences15710-SHazardous
ammonium hydroxideFisher ScientificA669S-500Hazardous
Kodak Fixative ASigma AldrichP7542
superfrost plus slidesFisher Scientific12-550-15
CitroSolv clearing agentFisher Scientific22-143-975
anhydrous ethyl alcoholCommercial AlcoholsN/A
cresyl violetSigma AldrichC1791
permountFisher ScientificSP15-100
upright microscopeOlympusBX53 model
colour camera, 12 bitMBF BiosciencesDV-47dQImaging part 01-MBF-2000R-F-CLR-12
3D motorized microscope stage, controller and enodersMBF BiosciencesN/ASupplied and integrated with microscope by MBF Biosciences
4X microscope objectiveOlympus4x 0.16 N.A. UplanSApo
10X microscope objectiveOlympus10x 0.3 N.A. UPlan FL N 
30X microscope objectiveOlympus30x 1.05 N.A. UPlanSApo 
60X microscope objectiveOlympus60x 1.42 N.A. PlanAPO N
silicone immersion oilOlympusZ-81114
Neurolucida softwareMBF BiosciencesVersion 10
ImageJ softwareU. S. National Institutes of HealthCurrent versionWith the OME Bio-Formats plugin installed
Photoshop softwareAdobeversion CS6

参考文献

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