Imagerie Neurones dans les sections du cerveau épais Utilisation du Golgi-Cox Méthode

Résumé

Nous présentons un protocole d'utilisation de la méthode de coloration de Golgi-Cox dans des coupes de cerveau d'épaisseur, afin de visualiser les neurones avec de longs arbres dendritiques contenus dans des échantillons de tissus individuels. Deux variantes de ce protocole sont également présentées qui impliquent violet contre-coloration crésyl, et le gel des cerveaux non transformés pour le stockage à long terme.

Résumé

La méthode Golgi-Cox de coloration des neurones a été employé pendant plus de deux cents ans pour faire progresser notre compréhension de la morphologie des neurones dans les échantillons de cerveau histologiques. Bien qu'il soit préférable d'un point de vue pratique pour préparer des coupes du cerveau à la plus grande épaisseur possible, afin d'augmenter la probabilité d'identifier les neurones colorés qui sont entièrement contenus dans les sections individuelles, cette approche est limitée du point de vue technique par la distance de travail de haut -magnification objectifs de microscope. Nous rapportons ici un protocole pour colorer les neurones en utilisant la méthode Golgi-Cox dans des coupes de cerveau de souris qui sont coupées à une épaisseur de 500 um, et de visualiser les neurones tout au long de la profondeur de ces sections à l'aide d'un microscope droit muni d'une haute résolution 30X de silicone 1,05 NA objectif à immersion dans l'huile qui a une distance de travail de 800 um. Nous présentons également deux variantes utiles de ce protocole qui peut être utilisé pour la surface de contre-colorermonté des coupes de cerveau avec le colorant de Nissl violet de crésyle, ou de geler les cerveaux entiers pour le stockage à long terme avant la coupe et le traitement final. Le protocole principal et ses deux variantes produisent des coupes de cerveau épais tachés, tout au long de laquelle les arbres dendritiques complet des neurones et des épines dendritiques peuvent être de manière fiable visualiser et de quantifier.

Introduction

La visualisation des neurones individuels dans des échantillons de tissus permet de l'analyse in situ des caractéristiques morphologiques des neurones, ce qui a considérablement fait progresser notre compréhension du cerveau et comment elle peut être influencée par la maladie endogène ou des facteurs environnementaux exogènes. La méthode de coloration Golgi-Cox est un rapport coût-efficacité, des moyens relativement simples de coloration d'un échantillon aléatoire de neurones dans le cerveau. D' abord développé par Golgi ¹ et modifié par Cox ² dans les années 1800, les chercheurs ont affiné cette technique au cours des années à produire des neurones clairs, bien colorés qui peuvent être utilisés pour visualiser et de quantifier à la fois la morphologie des arbres dendritique et la densité de la colonne vertébrale ^{3, 4, 5, 6, 7, 8, 9}.

Une considération importante technique pour la visualisation des neurones colorés dans les sections du cerveau est l'épaisseur de la tranche maximale, qui est limitée par la distance de travail des objectifs disponibles de microscope à fort grossissement / haute résolution. Objectifs communs d'immersion d'huile dans les années 60 - 100X gamme offrent une excellente résolution, mais sont limités par leurs distances de travail qui ne sont généralement pas supérieure à 200 um. Les coupes de cerveau coupées à 200 um gamme peuvent être adéquates pour visualiser certains types de neurones qui peuvent être contenus à l'intérieur de cette épaisseur de tranche, par exemple des neurones pyramidaux dans les couches superficielles du cortex cérébral ^{10, 11, 12,} les neurones pyramidaux de la région CA1 de la hippocampe ^{13, 14,} et les cellules granulaires du gyrus denté de l'hippocampe ^15. Neurones avec relativement plusarbres dendritiques, tels que les neurones pyramidaux dans les couches profondes du cortex cérébral que pour la souris peut dépasser de plus de 800 um à partir du corps de la cellule ^16, fournissent un plus grand défi , car les cerveaux devraient être sectionné à un angle idéal pour contenir l'ensemble de l' arbre dendritique à moins de 200 um tranches. Cela peut ne pas être encore possible si un dendrites ou l'une de ses branches s'étendent dans la direction rostrale ou caudale. Bien qu'il soit possible de remédier à cette limitation en traçant un neurone à travers plusieurs sections du cerveau adjacentes, cette approche présente un défi technique important dans l' alignement des sections avec précision pour le traçage ^17. Une approche plus pratique serait de visualiser les neurones entiers contenus dans les sections du cerveau qui sont découpées à une plus grande épaisseur.

Nous rapportons ici une technique pour colorer les neurones dans 400 - coupes de cerveau d'épaisseur 500 um de souris en utilisant la méthode Golgi-Cox, et de visualiser leur morphology en utilisant un objectif à immersion dans l'huile silicone à haute résolution qui a une distance de travail de 800 um. Le protocole d'imprégnation et de traitement Golgi-Cox que nous décrivons est modifié à partir de l' un des protocoles modernes les plus cités dans la littérature ^6. Notre approche avec des coupes de cerveau épais offre l'avantage d'augmenter la probabilité d'identifier les neurones de tout type qui sont entièrement contenu dans la section. En plus du protocole principal, nous présentons également deux variantes qui offrent des avantages uniques: (1) coloration Golgi-Cox avec le contre-colorant violet de crésyl sur la surface des sections montées, afin de définir les limites des régions du cerveau et d'identifier les couches de la cortex cérébral, et (2) la coloration de Golgi-Cox avec une étape intermédiaire de congélation pour le stockage à long terme des cerveaux entiers imprégnés avant la coupe et le traitement final.

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Protocole

Des souris femelles CD1-souches adultes ont été utilisés dans cette étude. coloration similaire peut être réalisée en utilisant les deux sexes à différents âges. animaux expérimentaux ont été pris en charge selon les principes et les lignes directrices du Conseil canadien de protection des animaux, et le protocole expérimental a été approuvé par l'Université de Guelph Comité de protection des animaux.

1. Golgi-Cox Staining

1. Golgi-Cox Imprégnation de cerveaux
   1. Ajouter la solution Golgi-Cox de 1% (p / v) de dichromate de potassium, 0,8% (p / v) chromate de potassium et 1% (p / v) de chlorure mercurique en dissolvant le dichromate de potassium et le chromate de potassium dans de l'eau de haute qualité séparément . Mélanger les solutions, ajoutez le chlorure mercurique et filtrer la solution finale à l'aide du papier filtre grade 1. Conserver la solution dans l'obscurité pendant jusqu'à un mois.
   2. Anesthésier la souris en utilisant 5% d'isoflurane.
   3. Euthanasier la souris par décapitation et retirer rapidement le cerveau.
   4. Placer le cerveau dans un flacon à scintillation en verre de 20 ml contenant 17 ml de solution Golgi-Cox et incuber dans l'obscurité à température ambiante pendant 25 jours.
   5. Cryoprotect le cerveau en le plaçant dans un tube conique de 50 ml contenant 40 ml de saccharose cryoprotecteur (30% (p / v) de saccharose dans 0,1 M de tampon de phosphate, pH 7,4) dans l'obscurité à 4 ° C pendant 24 h.
      REMARQUE: Les options trois étapes suivantes peuvent être utilisées comme une alternative au protocole principal, afin de geler le cerveau à ce stade pour le stockage à long terme.
   6. Geler l'ensemble du cerveau en le plongeant dans 200 ml isopentane qui a été pré-refroidi sur la glace sèche.
   7. Placez le cerveau congelé dans un tube conique de 50 ml et stocker dans l'obscurité à -80 ° C.
   8. Lorsqu'il est prêt à poursuivre, décongeler le cerveau en le plaçant dans un tube conique de 50 ml contenant 40 ml de saccharose cryoprotecteur dans l'obscurité à 4 ° C pendant 24 h.
2. cerveau Sectionnement
   1. Retirez le cerveau du saccharose et block pour sectionner en coupant le cervelet en utilisant une lame de rasoir et en laissant un bord plat à l'extrémité caudale restante du cerveau.
   2. agar-agar de chaleur (3% (p / v) dans de l'eau) jusqu'à ce qu'il soit fondu et laisser refroidir jusqu'à ce qu'elle soit légèrement supérieure à son point de fusion.
   3. Placez le cerveau dans un petit plat à usage unique peser avec son extrémité caudale face vers le bas et ajouter une quantité suffisante d'agar fondu pour couvrir le cerveau.
   4. Une fois solidification de la gélose, de l'assiette excès agar laissant environ 2 - 4 mm entourant le cerveau et coller le cerveau au stade d'un vibratome avec son extrémité caudale face vers le bas en utilisant une petite quantité de colle de type cyanoacrylate d'éthyle.
   5. Remplir la zone d'étape du vibratome avec une quantité suffisante de cryoprotecteur du saccharose à couvrir le cerveau, et la section du cerveau à une épaisseur de tranche de 400 - 500 pm (en fonction de la région du cerveau à examiner) en utilisant une fréquence de vibration de 86 Hz et une vitesse d'avancement de la lame de 0,125 mm / s.
   6. En utilisant une petite brosse de peinture, Lieu des coupes de cerveau dans un puits d'une plaque de culture tissulaire à 6 puits contenant des inserts en maille à fond disponibles dans le commerce et pré-remplie avec 10 ml de 6% (p / v) de saccharose dans 0,1 M de tampon de phosphate, pH 7,4.
   7. Incuber sections dans l'obscurité à 4 ° CO / N.
3. Développer les sections du cerveau
   1. Utilisation des inserts en maille-bas, transférer des coupes de cerveau dans un nouveau puits contenant 5 ml de 2% (p / v) de paraformaldehyde (PBD) dans 0,1 M de tampon de phosphate, pH 7,4. Incuber sur un bras oscillant se déplace à vitesse lente dans l'obscurité à température ambiante pendant 15 min.
   2. Laver deux fois les sections en les transférant vers de nouveaux puits contenant 5 ml d'eau. Laver sur une bascule se déplaçant à une vitesse modérée dans l'obscurité à température ambiante pendant 5 min.
   3. les sections de transfert dans un nouveau puits contenant 5 ml de 2,7% (v / v) d'hydroxyde d'ammonium. Incuber sur un bras oscillant se déplaçant à une vitesse lente dans l'obscurité à température ambiante pendant 15 min.
   4. Laver deux fois les sections en les transférant vers de nouveaux puits contenant 5 ml d'eau. laver ona bascule se déplaçant à une vitesse modérée dans l'obscurité à température ambiante pendant 5 min.
   5. Les sections de transfert dans un nouveau puits contenant 5 ml de fixatif A (voir Tableau Matériaux) qui a été dilué dans de l' eau 10 fois à partir de sa concentration d' origine acheté. Incuber sur un bras oscillant se déplaçant à une vitesse lente dans l'obscurité à température ambiante pendant 25 min.
   6. Laver deux fois les sections en les transférant vers de nouveaux puits contenant 5 ml d'eau. Laver sur une bascule se déplaçant à une vitesse modérée dans l'obscurité à température ambiante pendant 5 min.
4. Montage Sections du cerveau
   1. L'utilisation d'un petit pinceau, monter des sections sur des lames de microscope. Retirer l'excès d'eau et d'agar en utilisant une pince à épiler et un petit tissu. Assurez-vous que tous agar est retiré avant de procéder à la déshydratation.
   2. Laisser sécher à l'air les sections à température ambiante pendant environ 45 min (à 400 um sections) ou 90 min (500 um sections).
      NOTE: Le moment et bon niveau de sécheresse est critique, et peut être déterminée dans chaquelaboratoire selon la température ambiante et le niveau d'humidité. Trop court un temps de séchage conduit à des sections chute des diapositives au cours des étapes de déshydratation ultérieures, et trop long temps de séchage conduit à des sections de craquage. Les articles apparaîtront encore être brillant au niveau de sécheresse approprié.
   3. sections taches avec du violet de crésyl en plaçant des diapositives dans des pots de Coplin comme indiqué.
      REMARQUE: Cette étape facultative peut être utilisée pour les sections qui n'a jamais été congelé, afin de colorer les noyaux des neurones avec le violet de crésyl. Nous avons constaté que la compensation et les sections réhydrater avant l'incubation en violet de crésyl conduit à même coloration et faible bruit de fond à travers les sections.
      1. Placez en agent de compensation pendant 5 min. Répéter une fois.
      2. Placez dans 100% d'éthanol pendant 5 min. Répéter une fois.
      3. Placer dans 95% d'éthanol dans l'eau, puis 75% d'éthanol dans de l'eau, puis 50% d'éthanol dans l'eau pendant 2 minutes à chaque fois.
      4. Placez dans l'eau pendant 5 min.
      5. Placer dans 0,5% (p / v) cresyl violette dans l'eau pendant 7 min.
      6. Placez dans l'eau pendant 2 min. Répéter une fois.
   4. Déshydrater sections en plaçant des diapositives dans des pots de Coplin comme indiqué.
      1. Placer dans 50% d'éthanol dans de l'eau, puis 75% d'éthanol dans de l'eau, puis 95% d'éthanol dans l'eau pendant 2 minutes à chaque fois.
      2. Placez dans 100% d'éthanol pendant 5 min. Répéter une fois.
      3. Placez en agent de compensation pendant 5 min. Répéter une fois.
         NOTE: Ces déshydratation et les temps d'élimination sont suffisantes pour traiter les cerveaux de souris comme décrit dans ce manuscrit. Cependant, nous avons observé pour d'autres espèces, y compris le rat et le vacher, que l'étape de compensation finale peut être étendue jusqu'à 15 min au total.
   5. sections lamelle couvre-objet en utilisant un milieu de montage anhydre.
   6. Permettre aux lames sécher à l'horizontale dans l'obscurité à température ambiante pendant au moins 5 d.

2. Imagerie Stained Neurones dans les sections du cerveau épais

1. Capture d'image Stacks
   1. Allumez l'ampoule du microscope, la caméra et contrôleur de scène.
   2. Ouvrez le logiciel de microscope (par exemple, Neurolucida).
   3. Placez une lame sur la platine du microscope.
   4. Capturer une image large vue 2D de la section du cerveau à l'aide d'un objectif de faible grossissement tel que 1,25X 0,4 NA PlanApo ou 4X 0,16 NA
      1. Mettre l'accent image et ajuster les réglages de l'appareil, y compris le temps d'exposition et la balance des blancs.
      2. Créer un point de référence en cliquant avec le bouton gauche ne importe où sur la section
      3. Capturer l'image en sélectionnant « acquérir une image unique » dans la fenêtre d'acquisition d'images.
   5. Capturer des piles d'images à mi-résolution de la zone contenant les neurones (s) d'intérêt, en utilisant un objectif 10X 0,3 NA UPlan FL N.
      1. Focaliser l'image et régler les paramètres de l'appareil, y compris l'exposition et la balance des blancs.
      2. Fixer les limites supérieure et inférieure pour la pile d'images en se concentrant sur le haut de la section d'unnd sélectionner « set » à côté de « haut de la pile » dans la fenêtre d'acquisition d'images, et en se concentrant ensuite au fond de la section et en sélectionnant « réglé » à côté de « bas de pile » dans la fenêtre d'acquisition d'images.
      3. Régler la distance de l'étape de 5 um en entrant « 5 um » près de « la distance entre les images » dans la fenêtre d'acquisition d'images.
      4. Capturez la pile d'images en sélectionnant « acquérir pile d'images » dans la fenêtre d'acquisition d'images.
      5. Répéter les étapes ci-dessus pour capturer toute la zone d'intérêt, faire en sorte que toutes les piles d'images se chevauchent d'au moins 10% dans les axes X et Y.
   6. Capturer des piles d'images à haute résolution de la zone contenant le neurone d'intérêt, en utilisant un objectif d'immersion dans l'huile de silicone 30X 1,05 NA.
      1. Appliquer 3 - 4 gouttes d'huile d'immersion de silicone à la diapositive et placez l'objectif sur la lame, assurant de prendre contact entre l'objectif et Oil.
      2. Focaliser l'image et régler les paramètres de l'appareil, y compris l'exposition et la balance des blancs.
      3. Fixer les limites supérieure et inférieure pour la pile d'images en se concentrant sur le haut de la section et en sélectionnant « réglé » à côté de « haut de la pile » dans la fenêtre d'acquisition d'images, et en se concentrant ensuite au fond de la section et en sélectionnant « set » à côté de « bas de pile » dans la fenêtre d'acquisition d'images.
      4. Régler la distance de l'étape à 1 um en entrant « 1 um » près de « la distance entre les images » dans la fenêtre d'acquisition d'images.
      5. Capturez la pile d'images en sélectionnant « acquérir pile d'images » dans la fenêtre d'acquisition d'images.
      6. Répéter les étapes ci-dessus pour capturer toute la zone d'intérêt, faire en sorte que toutes les piles d'images se chevauchent d'au moins 10% dans les axes X et Y.
   7. Enregistrez le fichier de données et enregistrer tous les fichiers d'image au format TIFF pour le traitement externe.
2. Création d' images de projection de Z et de l' image Montages
   1. Créer des images de projection en Z ImageJ
      1. Ouvrez le logiciel ImageJ qui a le plug-in Bio-formats installés.
      2. Sélectionnez "Plugins" -> "Bio-Formats" -> "Importateur Bio-Formats".
      3. Sélectionnez le fichier de pile d'images à ouvrir.
      4. Une fois que le fichier est ouvert, changer le format RVB en sélectionnant « Image » -> « Type » -> « Couleur RVB ».
      5. Créer la projection de Z en sélectionnant "Image" -> "Stacks" -> "Projet Z ...".
      6. Enregistrer l'image Z-projection à deux dimensions sous forme de fichier TIFF.
   2. Créer un montage d'image à deux dimensions de la surface entière d'intérêt.
      1. Ouvrez le logiciel (par exemple, Adobe Photoshop).
      2. Sélectionnez "Fichier" -> "Automatiser" -> "Photomerge".
      3. Sélectionnez « Parcourir », puis ajoutez les images fichiers à fusionner.
      4. Assurez-vous que « Blend Images Together » est sélectionné puis sélectionnez « OK ».
      5. Enregistrez l'image de montage résultant de toute la zone d'intérêt en tant que fichier TIFF.

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Résultats

Ce protocole de coloration Golgi-Cox et ses deux variantes décrites facultatifs peuvent être utilisés pour visualiser les neurones individuels à moins de 400 - 500 um d'épaisseur des coupes de cerveau. Image représentative des montages de deux dimensions Z-projections capturées en utilisant un objectif 10X et 5 um étapes de l'axe Z sont représentés sur la figure 1: A1 - C1 pour une grande surface de coupes cérébrales coronales qui comprend la zone de ...

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Discussion

Nous décrivons ici un protocole de coloration Golgi-Cox ainsi que deux variantes utiles pour visualiser les neurones dans les sections du cerveau épais. Comme le montrent les résultats représentatifs, l'utilisation d'un objectif à haute résolution qui a une longue 800 um distance de travail permet la visualisation fiable de l'ensemble des neurones tout au long de la profondeur des coupes de cerveau coupées à 500 um. Cette étude des coupes de cerveau relativement épaisses augmente la probabilité qu...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
potassium dichromate	Fisher Scientific	P188-100	Hazardous
potassium chromate	Fisher Scientific	P220-100	Hazardous
mercuric chloride	Fisher Scientific	S25423	Hazardous
Whatman grade 1 filter paper	Fisher Scientific	1001-185
isoflurane	Pharmaceutical Partners of Canada	CP0406V2
20 mL scintillation vial	Fisher Scientific	03-337-4
sucrose	Bioshop Canada	SUC700.1
sodium phosphate monobasic	Sigma Aldrich	S5011-500G
sodium phosphate dibasic	Sigma Aldrich	S9390-500G
50 mL conical tube	Fisher Scientific	12-565-271
isopentane	Fisher Scientific	AC126470010	Also known as 2-methylbutane; hazardous
agar	Sigma Aldrich	A1296-100G
small weigh dish	Fisher Scientific	02-202-100
vibratome	Leica	VT1000 S
6-well tissue culture plates	Fisher Scientific	08-772-1b
mesh bottom tissue culture inserts	Fisher Scientific	07-200-214
paraformadelhyde (PFA), 16%	Electron Microscope Sciences	15710-S	Hazardous
ammonium hydroxide	Fisher Scientific	A669S-500	Hazardous
Kodak Fixative A	Sigma Aldrich	P7542
superfrost plus slides	Fisher Scientific	12-550-15
CitroSolv clearing agent	Fisher Scientific	22-143-975
anhydrous ethyl alcohol	Commercial Alcohols	N/A
cresyl violet	Sigma Aldrich	C1791
permount	Fisher Scientific	SP15-100
upright microscope	Olympus	BX53 model
colour camera, 12 bit	MBF Biosciences	DV-47d	QImaging part 01-MBF-2000R-F-CLR-12
3D motorized microscope stage, controller and enoders	MBF Biosciences	N/A	Supplied and integrated with microscope by MBF Biosciences
4X microscope objective	Olympus	4x 0.16 N.A. UplanSApo
10X microscope objective	Olympus	10x 0.3 N.A. UPlan FL N
30X microscope objective	Olympus	30x 1.05 N.A. UPlanSApo
60X microscope objective	Olympus	60x 1.42 N.A. PlanAPO N
silicone immersion oil	Olympus	Z-81114
Neurolucida software	MBF Biosciences	Version 10
ImageJ software	U. S. National Institutes of Health	Current version	With the OME Bio-Formats plugin installed
Photoshop software	Adobe	version CS6