Imaging Neurone innerhalb Dickhirnschnitten Mit der Golgi-Cox-Methode

Zusammenfassung

Wir präsentieren ein Protokoll der Golgi-Cox-Färbung in dicken Hirnschnitten für die Verwendung, um Neuronen mit langen Dendritenbäume innerhalb einzelner Gewebeproben enthalten ist, zu visualisieren. Zwei Varianten dieses Protokolls werden auch vorgestellt, Kresylviolett Gegenfärbung einzubeziehen und das Einfrieren von nicht verarbeiteten Gehirne für die Langzeitlagerung.

Zusammenfassung

Der Golgi-Cox-Methode von Neuron-Färbung ist seit mehr als zweihundert Jahren beschäftigt unser Verständnis der neuronalen Morphologie innerhalb histologischen Hirnproben vorzurücken. Zwar ist es aus praktischer Sicht zu bevorzugen ist, um Hirnschnitt bei der größten Dicke möglich ist, um die Wahrscheinlichkeit des Identifizierens stained Neuronen zu erhöhen, die vollständig innerhalb einzelnen Abschnitte enthalten ist, herzustellen, ist dieser Ansatz aus technischen Sicht von dem Arbeitsabstand von hohen begrenztem Lineare Wiedergabe Mikroskopobjektive. Wir berichten hier über ein Protokoll Neuronen färbt das Golgi-Cox-Verfahren in Mausgehirnschnitte verwenden, die bei 500 & mgr; m Dicke geschnitten werden, und Neuronen in der gesamten Tiefe dieser Abschnitte zur Visualisierungen mit einem hochauflösenden 30X 1,05 NA Silikon ausgerüstet ein aufrechtes Mikroskop Ölimmersionsobjektiv, das einen 800 um Arbeitsabstand aufweist. Wir berichten auch zwei nützliche Varianten dieses Protokolls, das verwendet werden kann, um die Oberfläche des gegenzufärbenmontiert Gehirnschnitt mit der Kresylviolett Nissl-Färbung, oder ganze Gehirne für die Langzeitlagerung vor dem Schneiden und Endverarbeitung gefrieren. Das Hauptprotokoll und seine zwei Varianten produzieren gefärbte dicke Hirnschnitten, wobei durchwegs voll Neuron Dendritenbäume und Dendriten Stacheln können zuverlässig sichtbar gemacht und quantifiziert werden.

Einleitung

Die Visualisierung von einzelnen Neuronen innerhalb von Gewebeproben ermöglicht die in - situ - Analyse von Neuronen morphologischer Eigenschaften, die unser Verständnis des Gehirns deutlich fortgeschritten sind und wie sie durch endogene Krankheit oder exogene Umweltfaktoren beeinflusst werden. Die Golgi-Cox-Färbeverfahren sind ein kostengünstiges, relativ einfaches Mittel eine Stichprobe von Neuronen im Gehirn Anfärben. Zuerst von Golgi ¹ entwickelt und modifiziert von Cox ² in den 1800er Jahren haben die Forscher weiter verfeinert , diese Technik im Laufe der Jahre klar, gut gefärbten Neuronen zu erzeugen , die verwendet werden können , zu visualisieren und sowohl Dendritenbaum Morphologie und Wirbelsäule Dichte ^{3, 4,} zu quantifizieren ^{5, 6, 7, 8, 9}.

Eine wichtige technische Überlegungen für die Visualisierung von gefärbten Neuronen in Hirnschnitten ist die maximale Schichtdicke, die von der Arbeitsabstand der verfügbaren hochvergrößernde / hochauflösendes Mikroskop-Objektive begrenzt ist. Gemeinsame Öl-Tauchziele in den 60 - 100X Bereich hervorragende Auflösung bieten, sind aber durch ihre Arbeitsabstände begrenzt, die typischerweise nicht größer sind als 200 & mgr; m. Hirnschnitte bei der 200 um Bereich schneiden kann ausreichend sein , bestimmte Neuron Typen sichtbar zu machen , die innerhalb dieser Schichtdicke enthalten sein können, beispielsweise pyramidalen Neuronen in flachen Schichten der Hirnrinde ^{10, 11, 12,} pyramidalen Neuronen in der CA1 - Region des Hippocampus ^{13, 14} und Körnerzellen im Gyrus dentatus des Hippocampus ^15. Neurone mit relativ mehrDendritenbäume wie pyramidalen Neuronen in tiefen Schichten des Hirnrinde , die für Maus kann mehr als 800 erstrecken , um von dem Zellkörper ^16, eine größere Herausforderung bieten , da Gehirne in einem perfekten Winkel geschnitten werden müßten den gesamten Dendriten Baum enthalten innerhalb von 200 & mgr; m-Scheiben. Dies kann auch nicht durchführbar sein, wenn ein Dendrit oder eine ihrer Verzweigungen in der rostralen oder kaudalen Richtung erstrecken. Während es möglich ist , diese Einschränkung zu adressieren , indem ein Neuron über mehrere benachbarte Hirnschnitte Tracing stellt dieser Ansatz eine erhebliche technische Herausforderung , die Abschnitte genau in Ausrichtung ¹⁷ zur Verfolgung. Ein praktischer Ansatz wäre gesamte Neuronen in Hirnschnitten enthalten ist, zu visualisieren, die mit einer größeren Dicke geschnitten werden.

Wir berichten hier über eine Technik Neuronen zu färben innerhalb von 400 bis 500 & mgr; m dicker Hirnschnitten von Mäusen, die die Golgi-Cox-Methode und dessen mo zu visualisierenrphology unter Verwendung eines hochauflösenden Silizium-Ölimmersionsobjektiv, das einen 800 um Arbeitsabstand aufweist. Das Golgi-Cox Imprägnierung und Verarbeitungsprotokoll , das wir beschreiben , wird aus einem der zitierten modernen Protokollen in der Literatur ⁶ modifiziert. Unser Ansatz mit dicken Hirnschnitten bietet den Vorteil einer Erhöhung der Wahrscheinlichkeit der Identifizierung Neuronen jeglicher Art, die im Abschnitt vollständig enthalten sind. Neben dem Hauptprotokoll wir auch zeigen zwei Varianten, die einzigartige Vorteile bieten: (1) Golgi-Cox-Färbung mit Cresylviolett Gegenfärbemittel auf der Oberfläche der montierten Teile, um die Grenzen der Hirnregionen zu definieren und Schichten des identifizieren Großhirnrinde, und (2) Golgi-Cox-Färbung mit einem Zwischengefrierschritt für die lang~~POS=TRUNC von imprägniertem gesamtem Gehirn vor dem Schneiden und Endverarbeitung.

Protokoll

Erwachsene weibliche CD1-Stamm-Mäuse wurden in dieser Studie verwendet. Ähnliche Färbung kann unter Verwendung beider Geschlechter in verschiedenen Altersstufen durchgeführt werden. Versuchstiere wurden nach den Grundsätzen und Richtlinien des Canadian Council on Animal Care betreut, und das experimentelle Protokoll wurde von der University of Guelph Animal Care Committee genehmigt.

1. Golgi-Cox Staining

1. Golgi-Cox Imprägnierung von Brains
   1. Macht die Golgi-Cox Lösung von 1% (w / v) Kaliumdichromat, 0,8% (w / v) Kaliumchromat und 1% (w / v) Quecksilberchlorid durch das Kaliumdichromat Auflösen und Kaliumchromat in hochwertiges Wasser separat . Mischen Sie die Lösungen, fügen Sie das Quecksilberchlorid und filtern die endgültige Lösung unter Verwendung von Grad 1 Filterpapier. Bewahren Sie die Lösung im Dunkeln für bis zu einem Monat.
   2. Betäuben die Maus mit 5% Isofluran.
   3. Euthanize die Maus durch Enthauptung und schnell das Gehirn entfernen.
   4. Legen Sie das Gehirn in ein 20 ml Glasszintillationsröhrchen mit 17 ml Golgi-Cox-Lösung und Inkubieren im Dunkeln bei RT 25 d.
   5. Cryoprotect das Gehirn, indem es in ein konisches 50 ml-Röhrchen mit 40 ml Saccharose Kryoprotektivum (30% (w / v) Sucrose in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,4) im Dunkeln bei 4 ° C für 24 h platziert.
      HINWEIS: Die folgenden optionalen drei Schritte als Alternative zum Hauptprotokoll verwendet werden können, um das Gehirn in dieser Phase für die langfristige Lagerung einfrieren.
   6. Frieren Sie das ganze Gehirn, indem es in 200 ml Isopentan getaucht, das auf Trockeneis vorgekühlt wurde.
   7. Das tiefgefrorene Gehirn in ein 50 ml konischen Röhrchen und speichert im Dunkel bei -80 ° C.
   8. Wenn bereit zu gehen, aufzutauen, das Gehirn, indem es in ein konisches 50 ml-Röhrchen mit 40 ml Saccharose Kryoschutzmittels im Dunkeln bei 4 ° C für 24 h platziert.
2. Gehirn Sectioning
   1. Entfernen Sie das Gehirn aus dem Saccharose und block es zum Schneiden durch das Kleinhirn mit einer Rasierklinge abgeschnitten und eine flache Kante an dem verbleibenden kaudalen Ende des Gehirns zu verlassen.
   2. Wärme-Agar (3% (w / v) in Wasser), bis sie geschmolzen und abkühlen lassen, bis sie geringfügig über seinem Schmelzpunkt liegt.
   3. Legen Sie das Gehirn in einem kleinen Einweg wiegt Gericht mit seinen Schwanzende bedruckten Seite nach unten und fügen Sie eine ausreichende Menge an geschmolzenem Agar, das Gehirn zu decken.
   4. Sobald der Agar sich verfestigt hat, Überschüssiges Agar verlassen etwa 2 bis 4 mm um das Gehirn und das Gehirn auf die Bühne eines Vibratom mit seinem caudalen Ende der Vorderseite nach unten Leim eine kleine Menge von Ethylcyanoacrylat Leim.
   5. Füllen Bühnenbereich des Vibratom mit einer ausreichenden Menge an Saccharose Gefrierschutzmitteln, das Gehirn zu bedecken, und Abschnitt des Gehirn bei einer Schichtdicke von 400 bis 500 um (je nach der Hirnregion zu untersuchenden) unter Verwendung eine Schwingungsfrequenz von 86 Hz und eine Klingenvorschubgeschwindigkeit von 0,125 mm / s.
   6. Mit einem kleinen Pinsel, Place Hirnschnitten in eine Vertiefung einer 6-Well-Gewebekulturplatte mit im Handel erhältlichen maschenBodenEinsätze und vorgefüllt mit 10 ml 6% (w / v) Sucrose in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,4 enthält.
   7. Inkubieren Abschnitte im Dunkeln bei 4 ° CO / N.
3. Die Entwicklung Hirnschnitten
   1. Unter Verwendung der maschenBodenEinsätze, übertragen Hirnschnitten in eine neue Vertiefung mit 5 ml 2% (w / v) Paraformaldehyd (PBD) in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,4. Inkubieren auf einem Schüttler bei niedriger Geschwindigkeit im Dunkeln bei RT für 15 min bewegt.
   2. Wasche zweimal Abschnitte von ihnen, um neue Vertiefungen mit 5 ml Wasser zu übertragen. Waschen Sie auf einer Wippe mit mäßiger Geschwindigkeit im Dunkeln bei RT für 5 min bewegt.
   3. Transferabschnitte in einen neuen gut, die 5 ml von 2,7% (v / v) Ammoniumhydroxid. Inkubieren auf einem Schüttler mit einer langsamen Geschwindigkeit im Dunkeln bei RT für 15 min bewegt.
   4. Wasche zweimal Abschnitte von ihnen, um neue Vertiefungen mit 5 ml Wasser zu übertragen. waschen Sie ona Wippe für 5 Minuten bei mäßiger Geschwindigkeit im Dunkeln bei RT bewegt.
   5. Transferabschnitte in einen neuen gut , die 5 ml Fixativ A (siehe Materialien Table) , die in Wasser 10 - fach von seiner ursprünglichen Konzentration verdünnt gekauft wurde. Inkubieren auf einer Wippe mit einer langsamen Geschwindigkeit im Dunkeln bei RT für 25 min bewegt.
   6. Wasche zweimal Abschnitte von ihnen, um neue Vertiefungen mit 5 ml Wasser zu übertragen. Waschen Sie auf einer Wippe mit mäßiger Geschwindigkeit im Dunkeln bei RT für 5 min bewegt.
4. Montage Gehirnschnitte
   1. Mit einem kleinen Pinsel, montieren Schnitte auf Objektträger. Überschüssiges Wasser und Agar Pinzette und ein kleines Gewebe verwendet wird. Stellen Sie sicher, dass alle Agar, bevor mit Dehydratation entfernt wird.
   2. Allow Abschnitte an der Luft trocknet bei RT für etwa 45 min (400 & mgr; m Abschnitte) oder 90 min (500 & mgr; m Abschnitte).
      HINWEIS: Der Zeitpunkt und die richtige Höhe der Trockenheit ist kritisch und muss möglicherweise in jedem zu bestimmendenLabor in Abhängigkeit von der Umgebungstemperatur und der Luftfeuchtigkeit. Ein zu kurzer Trocknungszeit führt zu Abschnitten aus den Folien während der anschließenden Entwässerungsschritte fallen, und ein zu lange Trocknungszeit führt zu Abschnitten Knacken. Abschnitte werden nach wie vor auf der entsprechenden Ebene der Trockenheit sein glänzend erscheinen.
   3. Stain Schnitte mit Kresylviolett von Dias in Coplin Färbeschalen wie angezeigt setzt.
      HINWEIS: Dieser optionale Schritt für Abschnitte verwendet werden kann, die eingefroren nie hatte, um neuronale Kerne mit Kresylviolett zu färben. Wir haben gefunden, dass das Clearing und Rehydratisieren Abschnitte vor der Inkubation in Kresylviolett führt zu noch über Abschnitte und niedrige Hintergrundfärbung.
      1. Platzieren in Mittel für 5 min löschen. Wiederhole einmal.
      2. Legen Sie in 100% Ethanol für 5 min. Wiederhole einmal.
      3. Platzieren in 95% Ethanol in Wasser, dann 75% Ethanol in Wasser und dann 50% Ethanol in Wasser für 2 min je.
      4. Legen Sie in Wasser für 5 min.
      5. Platzieren in 0,5% (w / v) cresyl violet in Wasser für 7 min.
      6. Legen Sie in Wasser für 2 min. Wiederhole einmal.
   4. Dehydratisieren Abschnitte durch wie angegeben Dias in Coplin Färbeschalen platzieren.
      1. Platzieren in 50% Ethanol in Wasser, dann 75% Ethanol in Wasser und dann 95% Ethanol in Wasser für 2 min je.
      2. Legen Sie in 100% Ethanol für 5 min. Wiederhole einmal.
      3. Platzieren in Mittel für 5 min löschen. Wiederhole einmal.
         HINWEIS: Diese Austrocknung und Clearing Zeiten sind ausreichend Gehirn der Maus zu verarbeiten, wie in diesem Manuskript beschrieben. Wir haben jedoch für andere Arten, einschließlich Ratten und cowbird beobachtet, dass der endgültige Clearing Schritt muß bis 15 min insgesamt verlängert werden.
   5. Coverslip Abschnitte eine wasserfreie Befestigungsmedium verwendet.
   6. Erlauben Folien für mindestens 5 d horizontal im Dunkeln bei RT zu trocknen.

2. Imaging Stained Neurone innerhalb Thick Hirnschnitten

1. Erfassen von Bildstapel
   1. Schalten Sie das Mikroskop Glühbirne, die Kamera und Objekttischsteuerung.
   2. Öffnen Sie die Mikroskop - Software (zB Neurolucida).
   3. Platzieren einer Folie auf dem Mikroskoptisch.
   4. Erfassen eine 2D-Weitsichtbild des Gehirns Abschnitt eine niedrige Vergrößerung Ziel Verwendung wie 1,25X 0,4 NA PlanApo oder 4x 0,16 NA
      1. Fokus Bild und stellen Sie die Kameraeinstellungen einschließlich der Belichtungszeit und Weißabgleich.
      2. Erstellen Sie einen Referenzpunkt mit der linken Maustaste irgendwo auf dem Abschnitt
      3. Nehmen Sie das Bild von „erwerben einzelnes Bild“ im Bildaufnahmefenster auswählen.
   5. Erfassen Mitte Auflösung Bildstapel der Fläche enthält, die Neuronen (e) von Interesse, unter Verwendung eines 10X-0,3 NA uPlan FL N Ziels.
      1. das Bild konzentrieren und die Kameraeinstellungen einschließlich der Belichtung und Weißabgleich einzustellen.
      2. Stellen Sie die obere und untere Grenze für die Bildstapel durch an der Oberseite des Abschnitts eine fokussierendend die Auswahl von „gesetzt“ neben „top of stack“ innerhalb des Bildaufnahmefensters, und dann auf den Boden des Abschnitts konzentriert und „set“ neben „bottom of stack“ innerhalb des Bildaufnahmefensters ausgewählt wird.
      3. Stellen Sie das Schrittweite bis 5 um durch „5 & mgr; m“ neben „Abstand zwischen den Bildern“ innerhalb des Bildaufnahmefensters eintritt.
      4. Nehmen Sie das Bild Stapel von „acquire Bildstapel“ im Bildaufnahmefenster auswählen.
      5. Wiederholen der obigen Schritte den gesamten Bereich von Interesse zu erfassen, um sicherzustellen, dass alle Bildstapel von mindestens 10% überlappen, in der X- und Y-Achsen.
   6. Erfassen hochauflösenden Bildstapeln der Fläche des Neurons von Interesse enthalten, unter Verwendung eines 30X 1,05 NA Silikonölimmersionsobjektiv.
      1. Anwenden von 3 bis 4 Tropfen Silikon Sionsöl auf den Objektträger und legt das Ziel über den Objektträger, um sicherzustellen, Kontakt herzustellen zwischen dem Objektiv und oil.
      2. das Bild konzentrieren und die Kameraeinstellungen einschließlich der Belichtung und Weißabgleich einzustellen.
      3. Stellen Sie die obere und untere Grenze für die Bildstapel durch an die Oberseite des Abschnitts Fokussierung und die Auswahl von „gesetzt“ neben „top of stack“ innerhalb des Bildaufnahmefensters, und dann auf den Boden des Abschnitts Fokussierung und die Auswahl von „gesetzt“ neben „bottom of stack“ innerhalb des Bildaufnahmefensters.
      4. Stellen Sie die Schrittweite auf 1 & mgr; m um „1 & mgr; m“ neben „Abstand zwischen den Bildern“ innerhalb des Bildaufnahmefensters eintritt.
      5. Nehmen Sie das Bild Stapel von „acquire Bildstapel“ im Bildaufnahmefenster auswählen.
      6. Wiederholen der obigen Schritte den gesamten Bereich von Interesse zu erfassen, um sicherzustellen, dass alle Bildstapel von mindestens 10% überlappen, in der X- und Y-Achsen.
   7. Speichern Sie die Datei und speichern Sie alle Bilddateien im TIFF-Format für externe Verarbeitung.
2. Erstellen von Z-Projektionsbilder und Bild Montages
   1. Erstellen Z-Projektionsbilder in ImageJ
      1. Offene ImageJ-Software, die das Bio-Formate Plugin installiert hat.
      2. Wählen Sie "Plugins" -> "Bio-Formate" -> "Bio-Formate Importeur".
      3. Wählen Sie die Bildstapel-Datei zu öffnen.
      4. Sobald die Datei geöffnet wird, um das Format zu ändern, indem RGB „Bild“ wählen -> „Type“ -> „RGB-Farbe“.
      5. Erstellen Sie die Z-Projektion durch Auswahl von "Bild" -> "Stacks" -> "Z Projekt ...".
      6. Speicher zweidimensionales Z-Projektionsbild als TIFF-Datei.
   2. Erstellen Sie ein zweidimensionales Bild Montage der gesamten Fläche von Interesse.
      1. Öffnen Sie die Software (zB Adobe Photoshop).
      2. Wählen Sie "Datei" -> "Automatisieren" -> "Photomerge".
      3. Wählen Sie „Durchsuchen“ und dann alle imag hinzufügenes Dateien zusammengeführt werden.
      4. Stellen Sie sicher, dass „Blend Images Together“ ausgewählt ist, und wählen Sie dann „OK“.
      5. Speichern Sie die Montagebild des gesamten Bereichs von Interesse als TIFF-Datei.

Ergebnisse

500 & mgr; m dicke Gehirnschnitte - Dieses Golgi-Cox-Färbung Protokoll und seine beiden beschriebenen optionalen Varianten können einzelne Neuronen innerhalb von 400 zu visualisieren eingesetzt werden. Repräsentatives Bild montages von zweidimensionalen Z-Projektionen Ziel unter Verwendung eines 10X aufgefangen und 5 um Schritte in der Z - Achse ist in Abbildung 1 gezeigt: A1 - C1 für einen großen Bereich der koronalen Hirnschnitten, die den anterioren cingulär...

Diskussion

Wir beschreiben hier ein Golgi-Cox Färbeprotokolls zusammen mit zwei nützliche Varianten für Neuronen im dicken Hirnschnitten sichtbar zu machen. Wie in den Repräsentative Ergebnisse gezeigt, die Verwendung eines hochauflösenden Ziel, die eine lange 800 & mgr; m Arbeitsabstand hat ermöglicht die zuverlässige Visualisierung der gesamten Neuronen über die gesamte Tiefe des Gehirns bei 500 & mgr; m geschnitten Abschnitte. Diese Studie von relativ dicken Hirnschnitten erhöht die Wahrscheinlichkeit, dass gef...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
potassium dichromate	Fisher Scientific	P188-100	Hazardous
potassium chromate	Fisher Scientific	P220-100	Hazardous
mercuric chloride	Fisher Scientific	S25423	Hazardous
Whatman grade 1 filter paper	Fisher Scientific	1001-185
isoflurane	Pharmaceutical Partners of Canada	CP0406V2
20 mL scintillation vial	Fisher Scientific	03-337-4
sucrose	Bioshop Canada	SUC700.1
sodium phosphate monobasic	Sigma Aldrich	S5011-500G
sodium phosphate dibasic	Sigma Aldrich	S9390-500G
50 mL conical tube	Fisher Scientific	12-565-271
isopentane	Fisher Scientific	AC126470010	Also known as 2-methylbutane; hazardous
agar	Sigma Aldrich	A1296-100G
small weigh dish	Fisher Scientific	02-202-100
vibratome	Leica	VT1000 S
6-well tissue culture plates	Fisher Scientific	08-772-1b
mesh bottom tissue culture inserts	Fisher Scientific	07-200-214
paraformadelhyde (PFA), 16%	Electron Microscope Sciences	15710-S	Hazardous
ammonium hydroxide	Fisher Scientific	A669S-500	Hazardous
Kodak Fixative A	Sigma Aldrich	P7542
superfrost plus slides	Fisher Scientific	12-550-15
CitroSolv clearing agent	Fisher Scientific	22-143-975
anhydrous ethyl alcohol	Commercial Alcohols	N/A
cresyl violet	Sigma Aldrich	C1791
permount	Fisher Scientific	SP15-100
upright microscope	Olympus	BX53 model
colour camera, 12 bit	MBF Biosciences	DV-47d	QImaging part 01-MBF-2000R-F-CLR-12
3D motorized microscope stage, controller and enoders	MBF Biosciences	N/A	Supplied and integrated with microscope by MBF Biosciences
4X microscope objective	Olympus	4x 0.16 N.A. UplanSApo
10X microscope objective	Olympus	10x 0.3 N.A. UPlan FL N
30X microscope objective	Olympus	30x 1.05 N.A. UPlanSApo
60X microscope objective	Olympus	60x 1.42 N.A. PlanAPO N
silicone immersion oil	Olympus	Z-81114
Neurolucida software	MBF Biosciences	Version 10
ImageJ software	U. S. National Institutes of Health	Current version	With the OME Bio-Formats plugin installed
Photoshop software	Adobe	version CS6