골지 - 콕스 방법을 사용하여 두꺼운 뇌 섹션 내에서 이미징 뉴런

요약

우리는 하나의 조직 샘플에 포함 된 긴 수지상 나무와 뉴런을 시각화하기 위해, 두께 뇌 부분에 골지 - 콕스 염색 방법을 사용하기위한 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜의 두 가지 변종은 크레 실 바이올렛으로 대조, 장기 저장을위한 처리되지 않은 뇌의 동결을 포함 그되게됩니다.

초록

신경 세포 염색의 골지 - 콕스 방법은 조직 학적 뇌 샘플 내에서 신경 세포의 형태에 대한 우리의 이해를 사전에 200 개 이상의 년 동안 사용되어왔다. 완전히 단일 구역 내에 포함 된 스테인드 뉴런을 식별하는 가능성을 증가시키기 위해, 가능한 한 최대 두께 뇌 부분을 제조 실용적인 관점에서 바람직하지만,이 방법은 높은 작업 거리만큼 기술적 인 관점에서 제한 -magnification 현미경 목표. 우리는 여기에 500 개 μm의 두께로 절단 마우스 뇌 섹션의 골지 - 콕스 방법을 사용하여 신경 세포를 염색하고, 고해상도 30 배 1.05 NA 실리콘 장착 직립 현미경을 사용하여이 부분의 깊이를 통해 뉴런을 시각화하기 위해 프로토콜을보고 800 μm의 작동 거리를 갖는 오일 액침 대물. 우리는 또한의 표면을 Counterstain과에 이용 될 수있다이 프로토콜의 두 가지 유용한 변종을보고크레 실 바이올렛 니슬 뇌 부분을 장착하기 전이나 절편 및 최종 처리에 장기 저장을위한 전체 뇌 동결. 주요 프로토콜과의 두 가지 변종은 전체 신경 세포의 수지상 나무와 수상 돌기 가시가 안정적으로 시각화 및 정량화 할 수있는 전체에 스테인드 두께 뇌 부분을 생산하고 있습니다.

서문

조직 샘플 내의 개별 뉴런의 시각화는 뇌에 대한 우리의 이해를 전진 크게하고이 내인성 질환이나 외생 적 환경 적 요인에 의해 영향을받을 수있는 방법 신경 세포의 형태 학적 특성의 현장에서 분석이 가능합니다. 골지 - 콕스 염색법은 뇌에서 뉴런의 무작위 샘플을 염색하는 비용 효율적인 상대적으로 단순한 방법이다. 먼저 1800 년대에 골지 ^(1)에 의해 개발 콕스 ^2에 의해 수정, 연구자들은 ^또한, 시각화 및 수지상 트리 형태와 척추 밀도 ^{3, 4} 모두 정량화하는 데 사용할 수있는 명확하고 잘 스테인드 뉴런을 생산하기 위해 수년에 걸쳐이 기술을 세련했다 ^{5, 6, 7, 8, 9,}.

뇌 섹션 내에서 스테인드 뉴런의 시각화를위한 주요 기술적 인 고려 사항은 가능한 고배율 / 고해상도 현미경 목표의 작동 거리에 의해 제한되는 최대 슬라이스 두께입니다. 60 공통 오일 침지 목표 - 100X는 뛰어난 해상도를 제공 범위하지만, 일반적으로 200 μm의보다 크지 않습니다 자신의 작업 거리에 의해 제한됩니다. 200 ㎛의 범위로 잘라 뇌 절편 대뇌 피질 ^(10),의 CA1 영역 ^{11, 12,} 피라미드 신경의 얕은 층에서의 예시적인 피라미드 신경이 슬라이스 두께 내에 포함될 수있는 소정의 신경 세포 유형을 시각화하기 적합 할 수 해마 ^(15)의 치아 이랑에서 해마 ^{13, 14,} 및 과립 세포. 상대적으로 이상과 뉴런이러한 뇌 전체 수지상 트리를 포함하는 완벽한 각도로 구분 될 필요가 있기 때문에 셀 본체 ^(16)에서 800 μm의를 확장 할 수 있습니다 마우스, 더 큰 도전을 제공하는 대뇌 피질의 깊은 층에서 피라미드 신경 세포로 수지상 나무, 200 개 μm의 슬라이스 내의. 수지상 또는 분기 중 입쪽 또는 꼬리 방향으로 연장되는 경우에도 실현 될 수 없다. 그것은 다수의 뇌에 인접 섹션에 걸쳐 신경을 추적하여 이러한 제약을 해결하는 것이 가능하지만,이 방식은 ¹⁷ 정확하게 추적하는 섹션을 정렬하는 데 중요한 기술적 도전을 소개한다. 더 실용적인 접근 방식은 더 큰 두께로 잘라 뇌 섹션에 포함 된 전체 뉴런을 시각화하는 것입니다.

골지 - 콕스 방법을 사용하여 마우스의 500 μm의 두께 뇌 부분, 그들의 개월을 시각화 - 우리는 여기에 (400) 내에서 신경 세포를 염색하는 기술을보고rphology 800 μm의 작동 거리를 갖는 고해상도 실리콘 오일 침지 목적을 사용. 우리가 설명하는 골지 - 콕스 함침 처리 프로토콜은 문헌 ^(6)에 가장 많이 인용 된 현대 프로토콜 중 하나에서 수정됩니다. 두꺼운 뇌 섹션 우리의 접근 방식은 완전히 섹션에 포함 된 모든 유형의 뉴런을 식별의 가능성을 증가시키는 장점을 제공한다. 기본 프로토콜뿐만 아니라, 또한 독특한 장점 제공 본 개의 변형 : 위해 장착 섹션의 표면 상 크레 실 바이올렛 Counterstain과 함께 (1) 골지 - 콕스 염색 뇌 영역의 경계를 정의하고, 레이어를 식별 할 단면 처리 및 최종 처리 이전에 함침 전체 뇌의 장기 저장을위한 중간 제빙 단계와 대뇌 피질, (2) - 골지 콕스 염색.

프로토콜

성인 여성 CD1 - 변형 마우스는이 연구에 사용되었다. 유사 염색은 다양한 연령층에서 남녀 모두를 사용하여 수행 할 수 있습니다. 실험 동물은 원칙과 동물 관리에있는 캐나다 협의회의 지침에 따라 마음에 든다고하고, 실험 프로토콜은 구 엘프 동물 관리위원회의 대학에 의해 승인되었다.

1. 골지 - 콕스 염색

1. 두뇌의 골지 - 콕스 함침
   1. 별도로 고품질 물로 칼륨 중크롬산 및 크롬산 칼륨을 용해시켜 1 %의 골지 - 콕스 용액 (w / v)의 중크롬산 칼륨 0.8 % (w / v)의 크롬산 칼륨 1 % (w / v)의 염화 수은 만들기 . 상기 혼합 용액을 염화 수은을 추가 등급 1 여과지를 이용하여 최종 용액을 필터. 최대 1 개월 어둠 속에서 솔루션을 저장합니다.
   2. 5 %의 이소 플루 란을 사용하여 마우스를 마취.
   3. 잘린 마우스를 안락사 빠르게 두뇌를 제거합니다.
   4. 골지 - 콕스 용액 17 mL를 함유하는 20 ML 글래스 섬광 바이알로 뇌를 놓고 25 일 동안 실온에서 어두운 곳에서 배양한다.
   5. 24 시간 동안 4 ℃의 어두운 곳에서 (0.1 M 인산 완충액, pH가 7.4 / V) 슈 크로스 W (30 %) 자당 동결 방지제를 40㎖를 함유하는 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 배치하여 뇌 Cryoprotect.
      주 : 다음 옵션 세 단계가 장기 저장이 단계에서 뇌를 고정하기 위해, 주요 프로토콜의 대안으로 사용될 수있다.
   6. 드라이 아이스에 미리 냉각 된 200 ㎖의 이소 펜탄에 침지하여 뇌 전체를 고정.
   7. -80 ℃에서 어둠 속에서 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 저장 동결 뇌 놓는다.
   8. 준비가 진행하면, 24 시간 동안 4 ℃에서 어둠 속에서 자당 동결 방지제를 40㎖를 함유하는 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 배치하여 뇌를 해동.
2. 뇌 단면
   1. 자당 및 블록에서 뇌를 제거면도날을 사용하여 소뇌를 차단하고, 뇌의 나머지 꼬리 단부에 평탄한 가장자리를 남겨 절편 대 케이.
   2. 열 한천 (3 % (w / v)의 물)가 용융 그것의 녹는 점보다 약간 때까지 식지 때까지.
   3. 그 꼬리 끝면이 아래로 작은 일회용 무게 접시에 두뇌를 놓고 두뇌를 포함 용융 한천의 충분한 양을 추가합니다.
   4. 한천은 고형화되면, 약 2 이탈 초과 한천 트림 - 뇌를 둘러싸고 4mm 및 에틸 시아 노 아크릴 레이트 접착제를 소량 사용하여 꼬리 단면 다운 가진에 vibratome의 스테이지 뇌 접착제.
   5. 400, 슬라이스 두께 뇌 및 단면 뇌 다루 자당 동결 방지제의 충분한 양을 가진에 vibratome의 스테이지 영역 채움 - 86 Hz의 진동 주파수를 사용하여 (피검 뇌 영역에 따라) 500 ㎛ 또는 0.125 mm / s의 블레이드 발전 속도.
   6. 작은 페인트 브러시를 사용하여상업적으로 이용 가능한 메쉬 바닥 인서트와를 함유하는 6- 웰 조직 배양 플레이트의 웰에 위치 뇌 부분 미리 작성된 6 % 10 ㎖의 0.1 M 인산 완충액, pH를 7.4 (w / v)의 자당.
   7. CO 4 ° / N의 어두운 부분을 부화.
3. 뇌 섹션 개발
   1. 메쉬 바닥 인서트를 사용하여 0.1 M 인산 완충액, pH 7.4의 웰에 2 %의 파라 포름 알데히드 5 ㎖ (/ V w) (PBD)를 포함하는 신규로 뇌 단면을 옮긴다. 실온에서 15 분 동안 어두운 데에서 저속으로 이동하는 로커 인큐베이션.
   2. 5 ㎖의 물을 함유하는 새로운 우물로 전송하여 두 부분을 씻는다. 5 분 동안 실온에서 어두운 곳에서 중간 속도로 이동하는 로커 씻는다.
   3. 2.7 % (V / V) 수산화 암모늄을 함유하는 5 ㎖의 새로운 웰로 수수 부. 실온에서 15 분 동안 어두운 데에서 느린 속도로 이동 로커에 부화.
   4. 5 ㎖의 물을 함유하는 새로운 우물로 전송하여 두 부분을 씻는다. 오 세척5 분 동안 실온에서 어두운 곳에서 중간 속도로 이동 NA 로커.
   5. 또한 정착액 (A)의 5 ㎖을 함유하는 신규로 수수 부 원래 구입 농도에서 물에 10 배 희석 한 것 (재료 표 참조). 25 분 동안 실온에서 어두운 곳에서 느린 속도로 이동 로커에 부화.
   6. 5 ㎖의 물을 함유하는 새로운 우물로 전송하여 두 부분을 씻는다. 5 분 동안 실온에서 어두운 곳에서 중간 속도로 이동하는 로커 씻는다.
4. 뇌 섹션을 장착
   1. 작은 페인트 브러시를 사용하여, 현미경 슬라이드 위에 섹션을 탑재합니다. 여분의 물을 제거하고 핀셋과 작은 조직을 사용하여 한천. 모든 한천 탈수를 진행하기 전에 제거되었는지 확인합니다.
   2. 약 45 분 (400 개 ㎛의 부분) 또는 90 분 (500 개 ㎛의 부분)을 실온에서 공기 건조시킨 부분을 허용한다.
      주 : 건조시기 적절한 수준은 중요하고, 각 결정해야기관 주위 온도 및 습도 수준에 따라. 너무 짧은 건조 시간 이후 탈수 단계에서 슬라이드 탈락 섹션에 이르게, 너무 긴 건조 시간이 균열 부분에 연결됩니다. 섹션은 여전히 ​​건조의 적절한 수준에서 반짝 것으로 나타납니다.
   3. 나타낸 바와 같이, 코 플린 염색 단지에 배치하여 슬라이드 크레 실 바이올렛 염색 섹션.
      참고 :이 옵션 단계는 크레 실 바이올렛 신경 세포 핵을 염색하기 위해, 동결 된 적이 섹션을 위해 사용될 수있다. 우리는 지우고 크레 실 바이올렛 부화하기 전에 섹션을 재수하는 경우에도 염색 및 섹션에서 저 배경에 이르게 것으로 나타났습니다.
      1. 5 분 동안 에이전트를 삭제에 놓는다. 한 번 반복합니다.
      2. 5 분 동안 100 % 에탄올에 놓는다. 한 번 반복합니다.
      3. 물에이어서, 물에 95 % 에탄올 75 % 에탄올을 배치하고, 2 분마다 물에이어서 50 % 에탄올.
      4. 5 분 동안 물에 놓는다.
      5. 0.5 %에서 발생 CRE (/ V w)7 분 동안 물 SYL 보라.
      6. 2 분 동안 물에 놓는다. 한 번 반복합니다.
   4. 나타낸 바와 같이, 코 플린 염색 단지에 배치하여 슬라이드 부 탈수.
      1. 물 다음, 물 50 % 에탄올 75 % 에탄올을 배치하고, 2 분마다 수중 후 95 % 에탄올.
      2. 5 분 동안 100 % 에탄올에 놓는다. 한 번 반복합니다.
      3. 5 분 동안 에이전트를 삭제에 놓는다. 한 번 반복합니다.
         참고 :이 탈수 및 청소 시간이 원고에 설명 된대로 마우스의 뇌를 처리하기에 충분합니다. 그러나, 우리는 최종 청산 단계는 15 분 총까지 연장해야 할 수도, 쥐 cowbird을 포함한 다른 종에서 관찰했다.
   5. 무수 장착 매체를 이용하여 커버 슬립 구간.
   6. 슬라이드는 적어도 5 일 동안 실온에서 어두운 곳에서 수평으로 건조 할 수있다.

두꺼운 뇌 섹션 내에서 2 이미징 스테인드 뉴런

1. 이미지 스택을 캡처
   1. 현미경 전구, 카메라, 무대 컨트롤러를 켭니다.
   2. 현미경 소프트웨어 (예를 들어, Neurolucida)를 엽니 다.
   3. 현미경 무대에 슬라이드를 놓습니다.
   4. 예컨대 1.25 0.4 NA PlanAPO 또는 4X 0.16 NA로 저배율 대물 렌즈를 이용하여 뇌 단면의 2D 시야각 이미지를 캡처
      1. 이미지 초점 및 노출 시간 및 화이트 밸런스를 포함한 카메라 설정을 조정합니다.
      2. 섹션의 아무 곳이나 왼쪽 버튼으로 클릭하여 기준점 만들기
      3. 이미지 획득 창에서 "하나의 이미지를 획득"을 선택하여 이미지를 캡처합니다.
   5. 10 배 NA 0.3 UPlan FL N 목적을 사용하여 관심의 뉴런 (들)를 함유하는 영역의 중간 해상도 이미지를 캡처 스택.
      1. 이미지를 초점과 노출, 화이트 밸런스를 포함한 카메라 설정을 조정합니다.
      2. 섹션 A의 정상에 초점을 맞춤으로써 이미지 스택의 상단 및 하단 경계를 설정ND 선택 화상 획득 창에서 "스택 상단 '옆 다음 섹션의 바닥에 집중하고, 화상 획득 윈도우 내에 다음에"바닥 스택 ","설정 "을 선택"설정 ".
      3. 화상 획득 창에서 "이미지 사이의 거리를"다음 "5 μm의"을 입력하여 5 ㎛ 인 스텝 거리를 설정한다.
      4. 화상 획득 창에서 "이미지 획득 스택"을 선택하여 이미지 캡처 스택.
      5. 모든 이미지 스택은 X 축과 Y 축에 10 % 이상 겹치는 것을 확인하고, 관심의 전체 영역을 캡처하려면 위의 단계를 반복합니다.
   6. 30 배 NA 1.05 실리콘 오일 액침 대물를 사용 관심 뉴런을 포함하는 영역의 높은 해상도 이미지를 캡처 스택.
      1. 대물과 OI과 접촉하도록 보장 슬라이드 침지 실리콘 오일 4 방울 슬라이드 위에 대물 배치 - 3 적용엘.
      2. 이미지를 초점과 노출, 화이트 밸런스를 포함한 카메라 설정을 조정합니다.
      3. 섹션 상단에 포커싱 "설정"을 선택하여 이미지 스택 상위 및 하위 경계를 설정 다음 다음 이미지 획득 창에서, 및 "스택의 상단"부분의 바닥에 집중하고 선택하는 「설정」 이미지 획득 창에서 "스택의 하단에"옆에.
      4. 화상 획득 창에서 "이미지 사이의 거리를"다음에 "1 ㎛"을 입력하여 1 ㎛의 단계의 거리를 설정한다.
      5. 화상 획득 창에서 "이미지 획득 스택"을 선택하여 이미지 캡처 스택.
      6. 모든 이미지 스택은 X 축과 Y 축에 10 % 이상 겹치는 것을 확인하고, 관심의 전체 영역을 캡처하려면 위의 단계를 반복합니다.
   7. 데이터 파일을 저장하고 외부 처리를 위해 TIFF 형식의 모든 이미지 파일을 저장합니다.
2. Z 프로젝션 이미지와 이미지 몽타주 만들기
   1. ImageJ에있는 Z-투사 이미지 만들기
      1. 바이오 형식 플러그인이 설치되어 열기 ImageJ에 소프트웨어.
      2. "플러그인"을 선택 -> "바이오 형식"-> "바이오 형식 가져 오기".
      3. 이미지 스택 파일을 선택 열 수 있습니다.
      4. > "유형"- -> "RGB 색상"파일이 열리면, "이미지"를 선택하여 RGB의 형식을 변경합니다.
      5. "이미지"를 선택하여 Z 프로젝션 만들기 -> "스택"-> "Z 프로젝트 ...".
      6. TIFF 파일로 두 개의 차원 Z 프로젝션 이미지를 저장합니다.
   2. 관심의 전체 영역의 2 차원 이미지의 몽타주를 작성합니다.
      1. (예를 들어, 어도비 포토샵) 소프트웨어를 엽니 다.
      2. "파일"을 선택 -> "자동화"-> "진 Photomerge를".
      3. 선택 "찾아보기"및 모든 IMAG을 추가ES 파일을 병합 할 수 있습니다.
      4. "함께 이미지를 혼합"을 선택하고 "확인"을 선택해야합니다.
      5. TIFF 파일로 관심의 전체 영역의 결과 몽타주 이미지를 저장합니다.

결과

500 μm의 두께 뇌 구역 -이 골지체 콕스 - 염색 프로토콜과 두 바와 선택적 변이체 (400) 내의 개별 뉴런을 시각화하는데 이용 될 수있다. 10 배의 대물 렌즈와 Z 축에서 5 ㎛의 단계를 사용하여 캡처 이차원 Z-돌기 대표 화상 몽타주는도 1에 도시된다 : A1 - 전방 피질 영역 (1)과를 포함하는 코로나 뇌 부분의 넓은 영역에 대한 C1 이차 운동 ?...

토론

우리는 두께 뇌 부분에서 신경을 시각화 여기 골지 - 콕스 염색 프로토콜이 유용한 변종과 함께 설명합니다. 대표 결과에 나타낸 바와 같이, 긴 800 μm의 작동 거리가있는 고해상도 목적의 사용은 500 μm의 절단 뇌 부분의 깊이에 걸쳐 전체 뉴런의 신뢰성 시각화 수 있습니다. 비교적 두꺼운 뇌 섹션의이 연구는 모든 유형의 스테인드 신경 세포가 완전히 길고 복잡한 꼭대기 수지상 나무와 피라미드 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
potassium dichromate	Fisher Scientific	P188-100	Hazardous
potassium chromate	Fisher Scientific	P220-100	Hazardous
mercuric chloride	Fisher Scientific	S25423	Hazardous
Whatman grade 1 filter paper	Fisher Scientific	1001-185
isoflurane	Pharmaceutical Partners of Canada	CP0406V2
20 mL scintillation vial	Fisher Scientific	03-337-4
sucrose	Bioshop Canada	SUC700.1
sodium phosphate monobasic	Sigma Aldrich	S5011-500G
sodium phosphate dibasic	Sigma Aldrich	S9390-500G
50 mL conical tube	Fisher Scientific	12-565-271
isopentane	Fisher Scientific	AC126470010	Also known as 2-methylbutane; hazardous
agar	Sigma Aldrich	A1296-100G
small weigh dish	Fisher Scientific	02-202-100
vibratome	Leica	VT1000 S
6-well tissue culture plates	Fisher Scientific	08-772-1b
mesh bottom tissue culture inserts	Fisher Scientific	07-200-214
paraformadelhyde (PFA), 16%	Electron Microscope Sciences	15710-S	Hazardous
ammonium hydroxide	Fisher Scientific	A669S-500	Hazardous
Kodak Fixative A	Sigma Aldrich	P7542
superfrost plus slides	Fisher Scientific	12-550-15
CitroSolv clearing agent	Fisher Scientific	22-143-975
anhydrous ethyl alcohol	Commercial Alcohols	N/A
cresyl violet	Sigma Aldrich	C1791
permount	Fisher Scientific	SP15-100
upright microscope	Olympus	BX53 model
colour camera, 12 bit	MBF Biosciences	DV-47d	QImaging part 01-MBF-2000R-F-CLR-12
3D motorized microscope stage, controller and enoders	MBF Biosciences	N/A	Supplied and integrated with microscope by MBF Biosciences
4X microscope objective	Olympus	4x 0.16 N.A. UplanSApo
10X microscope objective	Olympus	10x 0.3 N.A. UPlan FL N
30X microscope objective	Olympus	30x 1.05 N.A. UPlanSApo
60X microscope objective	Olympus	60x 1.42 N.A. PlanAPO N
silicone immersion oil	Olympus	Z-81114
Neurolucida software	MBF Biosciences	Version 10
ImageJ software	U. S. National Institutes of Health	Current version	With the OME Bio-Formats plugin installed
Photoshop software	Adobe	version CS6