تحليل الجذعية الصرف في الأعمدة والطبقات

Summary

هنا، وتبين لنا كيفية تحليل التوجيه شجيري من الخلايا العصبية النخاع ذبابة الفاكهة في الأعمدة وطبقات. يتضمن سير العمل تقنية التصوير المزدوج بغية تحسين جودة الصورة والأدوات الحاسوبية لتعقب وتسجيل العرش الجذعية لمجموعة عمود إشارة ولتحليل الهياكل الجذعية في الفضاء 3D.

Abstract

في مناطق كثيرة من الجهاز العصبي المركزي، مثل الفصوص البصرية الطاير والقشرة الفقاريات، ويتم تنظيم الدوائر متشابك في طبقات والأعمدة لتسهيل الأسلاك الدماغ أثناء التطور ومعالجة المعلومات في الحيوانات المتقدمة. الخلايا العصبية بعد المشبكي التشعبات المعقدة في أنماط نوع معين في طبقات محددة لالمشبك مع محطات قبل المشبكي المناسبة. يتكون neuropil النخاع ذبابة من 10 طبقات ونحو 750 الأعمدة. ومعصب كل عمود من التشعبات أكثر من 38 نوعا من الخلايا العصبية النخاع، والتي تتطابق مع المحطات محور عصبي من بعض 7 أنواع من afferents بطريقة نوع معين. تفاصيل هذا التقرير الإجراءات لصورة وتحليل التشعبات من الخلايا العصبية النخاع. يتضمن العمل ثلاثة أقسام: (ط) قسم التصوير المزدوج عرض يجمع بين اثنين من مداخن صورة متحد البؤر التي تم جمعها في التوجهات المتعامدة في صورة 3D عالية الدقة من التشعبات. (ثانيا) التغصنات البحث عن المفقودين وقسم التسجيل يتتبع شجيريالعرش في 3D وتسجل آثار الجذعية لمجموعة عمود المرجعية؛ (ج) يحلل قسم تحليل شجيري أنماط شجيري فيما يتعلق الأعمدة والطبقات، بما في ذلك إنهاء وإسقاط مستو الاتجاه طبقة محددة العرش الجذعية، ويستمد تقديرات شجيري المتفرعة وإنهاء الترددات. البروتوكولات تستخدم الإضافات مخصصة بنيت على MIPAV مفتوحة المصدر (الطبية المعالجة التصوير، والتحليل، والتصور) منصة والعرف أدوات العمل باللغة مصفوفة المختبر. معا، وهذه البروتوكولات سير العمل الكامل لتحليل التوجيه شجيري من الخلايا العصبية النخاع ذبابة الفاكهة في طبقات والأعمدة، لتحديد أنواع الخلايا، وتحديد العيوب في المسوخ.

Introduction

خلال التنمية، الخلايا العصبية التشعبات المعقدة في أنماط متفرعة معقدة ولكنها نمطية لتشكيل نقاط الاشتباك العصبي مع شركائهم قبل المشبكي. أنماط المتفرعة شجيري ترتبط بالهوية وظائف الخلايا العصبية. المواقع العرش شجيري تحديد نوع المدخلات قبل المشبكي التي يتلقونها، في حين أن شجيري المتفرعة التعقيد والميدان الأحجام تنظم عدد المدخلات. وهكذا، والخصائص المورفولوجية الجذعية هي العوامل الحاسمة في اتصال متشابك وحساب الخلايا العصبية. في العديد من مناطق أدمغة المعقدة، مثل الفصوص البصرية الطاير وشبكية العين الفقارية، ويتم تنظيم الدوائر متشابك في الأعمدة وطبقات لتسهيل معالجة المعلومات ^{1، 2.} في مثل هذه المنظمة عمود وطبقة الخلايا العصبية قبل المشبكي من مميزة لمحاور المشروع طريقة لإنهاء في طبقة معينة (ما يسمى استهداف طبقة معينة)، وتشكل مجموعة منظمة ثنائية الأبعاد (حتى-كاليد خريطة طبوغرافية)، في حين تمتد الخلايا العصبية بعد المشبكي التشعبات من الأحجام المناسبة في طبقات محددة لتلقي المدخلات قبل المشبكي من أنواع الصحيح والأرقام. حين محور عصبي استهداف طبقات والأعمدة ويتم دراستها جيدا ^{3، 4،} لا يعرف الكثير الكثير عن كيفية توجيه التشعبات إلى طبقات محددة وتوسيع بشكل مناسب الحجم حقول تقبلا لتشكيل اتصالات متشابك مع الشركاء قبل المشبكي الصحيح ^5. وقد أعاق صعوبة التصوير وقياس شجيري استهداف طبقات والأعمدة دراسة التطور الجذعية في هياكل الدماغ عمودية ومغلفة.

ذبابة الفاكهة الخلايا العصبية النخاع هي نموذج مثالي لدراسة التوجيه الشجيرية والتجمع الدائرة في الأعمدة وطبقات. ويتم تنظيم neuropil النخاع ذبابة كما شعرية 3D من 10 طبقات ونحو 750 الأعمدة. ومعصب كل عمود من قبل مجموعة من afferents، بما في ذلك عhotoreceptors R7 / R8 والخلايا العصبية الصفيحة L1 - L5، التي تشكل الخرائط الطبوغرافية في طبقة محددة الأزياء ⁶ محطات المحاور. حوالي 38 أنواع من الخلايا العصبية النخاع موجودة في كل عمود النخاع والتشعبات وضع في طبقات محددة ومع أحجام الحقول المناسبة للحصول على مدخلات من هذه afferents ^7. وقد أعيد بناء الدوائر متشابك في النخاع على المستوى المجهري الإلكترون. وبالتالي، فإن الشراكات متشابك راسخة ^{7، 8.} وعلاوة على ذلك، تتوفر ^{9، 10، 11} الأدوات الوراثية لوصفها أنواع مختلفة من الخلايا العصبية النخاع. من خلال دراسة ثلاثة أنواع من transmedulla (تيم) الخلايا العصبية (TM2، Tm9 وTm20)، حددنا سابقا اثنين من خلية من نوع محدد سمات شجيري: (ط) الخلايا العصبية تيم التشعبات في أي الأمامي أو الخلفي الاتجاه تتوقع (مستو مسقطةالاتجاه ection)، اعتمادا على أنواع الخلايا و (ب) التشعبات من الخلايا العصبية النخاع تنتهي في طبقات النخاع محددة بطريقة خلية من نوع معين (إنهاء طبقة محددة) ^12. مستو الاتجاه إسقاط وإنهاء طبقة محددة كافية لتمييز هذه الأنواع الثلاثة من الخلايا العصبية تيم، في حين أن الطفرات التي تعطل الردود تيم لطبقة والعمود العظة تؤثر على جوانب محددة من هذه الصفات.

هنا، نقدم سير العمل كاملا لدراسة الزخرفة الجذعية من الخلايا العصبية النخاع ذبابة الفاكهة في الأعمدة وطبقات (الشكل 1). لأول مرة، وتبين لنا طريقة التصوير المزدوج الرأي، والذي يستخدم برمجيات معدة للجمع بين اثنين من صورة مبائر مداخن لتوليد صور الخواص ذات جودة عالية. هذا الأسلوب يتطلب الوحيد متحد البؤر التقليدية المجهري لتوليد صور عالية الجودة التي تسمح لتتبع موثوق بها من الفروع الشجيرية، دون اللجوء إلى super-قرار المجهري، ومثل هذاالصورة STED (الانبعاث المستحث استنفاد) أو الإضاءة الهيكلية. ثانيا، نحن نقدم وسيلة لتتبع العرش الجذعية ولتسجيل آثار محوار مما أدى إلى مجموعة عمود إشارة. ثالثا، نقدم لك مجموعة من الطرق الحسابية لاستخراج المعلومات حول اتجاه مستو إسقاط وإنهاء طبقة محددة من التشعبات، وكذلك لاشتقاق تقديرات شجيري المتفرعة وإنهاء الترددات. معا، وهذه الأساليب تسمح لتوصيف أنماط الجذعية في 3D، وتصنيف أنواع الخلايا على أساس الأشكال التضاريسية الجذعية، وتحديد العيوب المحتملة في المسوخ.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

ملاحظة: بروتوكول يحتوي على ثلاثة أقسام: ثنائي رأي التصوير (الأقسام 1-3)، تتبع شجيري والتسجيل (الأقسام 4-6)، وتحليل شجيري (الأقسام 7-9) (الشكل 1). وتقدم رموز وملفات سبيل المثال في جدول المواد / المعدات.

1. المزدوج صورة اكتساب

ملاحظة: تم تصميم هذه الخطوة للحصول على اثنين من مداخن صورة من الخلايا العصبية من الاهتمام في توجهات اثنين متعامد (الأفقية والأمامية).

1. إعداد العقول ذبابة التي تحتوي على المسمى قليلة الخلايا العصبية النخاع (~ 10 خلية / الدماغ الفص) مع علامة غشاء GFP (mCD8GFP)، كما هو موضح سابقا ^(12). وصمة عار في الدماغ مع الأرنب مكافحة GFP (لالتشعبات العصبية النخاع) والفأرة mAb24B10 (لمحاور مبصرة)، الأجسام المضادة الأولية، والأجسام المضادة الثانوية فلوري (اليكسا 488 المضادة للأرنب واليكسا 568 الأجسام المضادة للماوس)، كما هو موضح سابقا13. مسح الدماغ في 70٪ الجلسرين في برنامج تلفزيوني 1X.
2. لتركيب الدماغ في الاتجاه الأفقي (2A الأرقام، B)، ونقل الطاير الدماغ مسح الجلسرين إلى انخفاض 20 ميكرولتر من antifade المتوسطة المتزايدة في وسط شريحة.
3. إرفاق بقع صغيرة من الطين في 4 زوايا ساترة لمنع ساترة من سحق عينة الدماغ أثناء التركيب.
   ملاحظة: توفر بقع الطين توسيد لمنع ساترة من سحق العينة. يجب أن يكون كل التصحيح الطين حوالي 1 ملم في القطر.
4. تحت المجهر تشريح، ضع العقول في موقف بطني المتابعة ووضع ساترة على رأس لتأمين الدماغ. استخدام السطح الظهري محدب من الدماغ كمعلم لتحديد اتجاه عينة الدماغ (الشكل 2A).
5. الحصول على صورة كومة الأول (عرض أفقي) مع المجهر متحد البؤر. استخدام عدسة موضوعية عالية NA (مثل 63X 1.3 NA الجلسرين أو الغمر النفط objeعدسة التفاعلية الذي نظمه) وتقريب رقمي 2.5x و (حجم بكسل 0.105 ميكرون لكل بكسل، وعدد المتوسط ​​هو 2). الحصول على أكثر من 180 المقاطع البصرية (512 × 512 بكسل) لتغطية neuropil النخاع مع حجم خطوة من 0.2 ميكرون.
6. قم بإعادة تحميل الدماغ كما هو موضح في الخطوات 1،3-1،4، ولكن محاذاة الدماغ في موقف الأمامي المتابعة (عرض مباشر).
7. الحصول على صورة كومة الثاني (عرض مباشر) من نفس الخلايا العصبية، كما هو موضح في الخطوة 1.5.
   ملاحظة: العثور على نفس الخلايا العصبية قد تكون صعبة عندما يكون هناك العديد من الخلايا العصبية المسماة في الفص البصري. للتعرف على نفس الخلايا العصبية من كل التوجهات، المنخفض التكبير مداخن صورة من وجهتي النظر قد تكون هناك حاجة (على سبيل المثال، استخدام التكبير من 0.7، وحجم خطوة من 0.45 ميكرون إلى اكتساب منخفضة الدقة مداخن صورة). إذا كانت الصورة أكبر من 512 × 512، وينبغي اقتصاص الصورة إلى 512 × 512 قبل الجمع الصورة، وحجم البكسل يجب أن تبقي في 0.105 ميكرون لكل بكسل في حين تصوير ميدانية واسعة. فقدان الإشارةمشكلة محتملة للالأنسجة العميقة. إذا كانت الإشارة ضعيفة، صورة النصف بطني من الدماغ. للحد من photobleaching من خلال المسح الضوئي، واستخدام منخفضة كقوة الليزر ممكن. استخدام مؤشر مجموعة للتحقق من التعرض المفرط قبل الحصول مداخن صورة. إذا كان ذلك ممكنا، واستخدام المجهر متحد البؤر مجهزة للكشف عن GaAsP.
8. تحديد وتسجيل موقع من الخلايا العصبية في المصالح فيما يتعلق neuropil النخاع (يمين / يسار [R / L] وظهري / بطني [D / V]). تحقق مما إذا انتقلت عينة خلال الحصول على الصور عن طريق فحص كومة الصورة.
   ملاحظة: عينة تتحرك في كثير من الأحيان بسبب تصاعد غير لائق. في حالة حدوث حركة عينة، المكدس صورة لا يمكن استخدامها لتسجيل ويجب التخلص. إعادة تحميل العينة والحصول على مداخن صورة من نفس الخلايا العصبية.

2. صورة Deconvolution

ملاحظة: يستخدم خطوة deconvolution البرمجيات صورة deconvolution لاستعادة الصور التي يتم الحصول عليها تدهورت بسبب عدم وضوحوالضوضاء. في حين أن هذا الخطوة اختيارية، ويحسن إلى حد كبير على جودة الصورة. فمن المستحسن استخدام مداخن صورة deconvolved لتسجيل الصورة والجمع في القسم 3.

1. بدء تشغيل البرنامج deconvolution في الوضع التفاعلي. تحميل كومة صورة (في مغلق أو شكل المجهري معين) عن طريق اختيار القائمة: ملف / فتح (أو Ctrl-س) في النافذة الرئيسية.
2. انقر لتحديد كومة صورة تحميل واختيار القائمة: العمليات لفتح نافذة تشغيل الصورة. استخدام كلاسيك إمكانية قصوى تقدير (CMLE) خوارزمية الافتراضية.
3. في إطار العملية صورة، انقر فوق "معلمات" علامة التبويب. أدخل المعلمات المناسبة على المدى المتوسط عدسة الغمر، وتضمين المتوسطة، والفتحة العددية (على سبيل المثال، النفط، الجلسرين، الخ.) (على سبيل المثال، النفط الغمر، الخ.) (NA، وهنا تم استخدام 1.3). تحقق المعلمات المتبقية للتأكد من أنها تعكس ظروف التصوير بشكل صحيح. انقر فوق علامة التبويب "تعيين كافة التحقق" إلى finاليز إعدادات المعلمة.
4. في إطار العملية صورة، انقر فوق "تشغيل" علامة التبويب. تعيين جهة الإخراج (على سبيل المثال، ج). أدخل الأرقام المناسبة في "الإشارة / الضوضاء في قناة" (على سبيل المثال، "12 12 12 12" هو نقطة انطلاق جيدة، في حين أن الإعداد الافتراضي هو "20 20 20 20"). استخدام الإعدادات الافتراضية للمعلمات المتبقية.
5. انقر على "تشغيل قيادة" علامة التبويب لبدء deconvoluting كومة الصورة؛ يمكن أن تستغرق هذه العملية تصل إلى عشرات دقائق لإكمال، اعتمادا على الكمبيوتر.
6. في الإطار الرئيسي، انقر فوق وحدد كومة صورة deconvolved. اختيار القائمة: حفظ باسم لحفظ الصورة deconvolved في شكل ملف صورة ICS (ics. و .ids).
   ملاحظة: كل كومة صورة له ملفين: ملف ICS يحتوي على معلومات رأس وملف هويات يحتوي على معلومات الصورة الخام.
   1. إعادة تسمية ملفات الصور كومة وفقا لتوجهات التصوير (على سبيل المثال، اسم أفقي عرض صورة الصورةالمسامير H.ids وH.ics وأمامي-عرض صورة كومة F.ids وF.ics).

3. ثنائي عرض صورة الجمع

ملاحظة: هذه الخطوة يجمع بين اثنين صورة مداخن لتوليد صور عالية الدقة 3D باستخدام برنامج MIPAV.

1. توليد المصفوفات لمزيج صورة.
   1. بدء تشغيل البرنامج MIPAV. تحميل H و F مداخن صورة عن طريق اختيار القائمة: ملف / فتح صورة (A) من القرص (أو Ctrl-و) /H.ids وF.ids. سوف تظهر نافذة صورتين.
   2. حدد الصورة H بالنقر على الصورة واختيار القائمة: أدوات المرافق / تحويل / RGB / غرايز. سوف تظهر نافذة GrayG، GrayB، والصور GrayR.
   3. إغلاق GrayR وGrayB، وحفظ فقط GrayG على النافذة.
   4. حدد الصورة F بالنقر على الصورة واختيار القائمة: أدوات المرافق / تحويل / RGB / غرايز. سوف تظهر نافذة GrayG1، GrayB1، والصور GrayR1.
   5. إغلاق GrayR1 وGrayB1 والحفاظ على GrayG1 فقط على النافذة. في هذه الخطوة، غرام فقطAYG وGrayG1 هي على النافذة.
   6. حدد GrayG (تمييز)، اختر القائمة: الخوارزميات / تسجيل / محسن صورة التسجيل التلقائي. سوف مربع الحوار "محسن التلقائي صورة التسجيل 3D" يطفو على السطح.
      1. في خيارات الإدخال، تغيير "درجة من الحرية" من الافتراضي "أفيني-12" إلى "محددة إعادة مقياس-9". في "دوران" المفتاح في -105 إلى 105 في "دوران مجموعة أخذ العينات زاوية" (الافتراضي: -30 إلى 30 درجة)، و 10 في "زيادة زاوية الخشنة" (الافتراضي: 15 درجة)، و 3 في "الجميلة زيادة زاوية "(الافتراضي: 6 درجات).
   7. انقر فوق موافق؛ سيتم إنشاء مصفوفة الأول "GrayG_To_GrayG1.mtx" وحفظها في مجلد الصور. إغلاق جميع النوافذ الصورة وانتقل إلى الخطوة التالية. هذه الخطوة سوف يستغرق 15 دقيقة على الأقل.
   8. تحميل H و F مداخن صورة عن طريق اختيار القائمة: ملف / فتح صورة (A) من القرص (أو Ctrl-و) /H.ids وF.ids، كما في الخطوة 3.1.1.
   9. حدد الصورة H بالنقر على الصورة واختيار القائمة: أدوات المرافق / تحويل / RGB / رمادي. فإن "> RGB- رمادي" مربع الحوار يطفو على السطح. انقر فوق موافق؛ سوف تظهر نافذة الصور "HGray". الحفاظ HGray وإغلاق صورة H.
   10. كرر الخطوة 3.1.9 للصورة F. سوف تظهر "FGray" الصور على النافذة. الحفاظ FGray وإغلاق صورة F. فقط HGray وFGray ستترك على النافذة.
   11. حدد الصورة HGray (تمييز) وانتقل إلى القائمة: أدوات الخوارزميات / تحويل / تحويل. سوف مربع الحوار "تحويل / إعادة تجميع عينة عشوائية صورة" يطفو على السطح. انقر على "إعادة تجميع عينة عشوائية" التبويب وتغيير إعادة تشكيله لحجم "HGray" إلى "FGray". بعد ذلك، انقر على "تحويل" التبويب وتحميل "GrayG_To_GrayG1.mtx" عن طريق اختيار "اقرأ مصفوفة من ملف". انقر فوق موافق؛ سوف تظهر نافذة الصورة HGray_transform. إغلاق صورة HGray يترك ذلك إلا HGray_transform وFGray على النافذة.
   12. حدد "HGray_transform & #34؛ صورة (تمييز) وانتقل إلى القائمة: الخوارزميات / تسجيل / محسن التلقائي صورة التسجيل. سوف مربع الحوار "محسن التلقائي صورة التسجيل 3D" يطفو على السطح. في "دوران" المفتاح في -5 إلى 5 في "دوران مجموعة أخذ العينات زاوية" (الافتراضي: -30 إلى 30 درجة)، و 3 في "زيادة زاوية الخشنة" (الافتراضي: 15 درجة)، و 1 في "الجميلة زيادة زاوية "(الافتراضي: 6 درجات). انقر فوق موافق.
       ملاحظة: أفيني مصفوفة (HGray_transform_To_FGray.mtx) سيتم إنشاء وحفظها في مجلد الصور و"HGray_Transform_register" صورة سيتم عرضها على النافذة. وهذه الخطوة تستغرق 40 دقيقة على الأقل.
   13. إغلاق "HGray_transform" الصورة؛ فقط "HGray_Transform_register" و "FGray" ينبغي أن تترك على النافذة.
   14. حدد "HGray_Transform_register" صورة (تمييز) وانتقل إلى القائمة: الخوارزميات / تسجيل / B-المفتاح التسجيل التلقائي 2D / 3D. و"B-المفتاح تسجيل تلقائيعلى 3D كثافة "سوف مربع الحوار يطفو على السطح. اختر" المربعات "في وظيفة التكلفة (الافتراضي هو نسبة الارتباط).
       1. انقر على "تنفيذ بتمريرين التسجيل". في قسم ممر 1، مفتاح في 2 في "أصل التدرج تصغير الخطوة الحجم (وحدات العينة)" (الافتراضي هو 1) والمفتاح في 10 إلى "الحد الأقصى لعدد تكرارات:" (الافتراضي هو 10). في قسم ممر 2، مفتاح في 1 في "أصل التدرج تصغير الخطوة الحجم (وحدات العينة)" (الافتراضي هو 0.5) والمفتاح في 2 في "الحد الأقصى لعدد تكرارات:" (الافتراضي هو 10).
          ملاحظة: مصفوفة نلت، "HGray_transform_register.nlt،" سيتم حفظها في مجلد الصور وسيظهر "HGray_transform_register_registered" صورة على النافذة. وهذه الخطوة تأخذ 5 دقائق على الأقل.
   15. إغلاق كافة الصور الموجودة على النافذة.
2. توليد صورة مرجعية لمزيج صورة.
   ملاحظة: ويقصد هذه الخطوة إلى GENERأكلت صورة أفقية مسجل للمجموعة.
   1. تحميل H وصورة F أكوام عن طريق اختيار القائمة: ملف / فتح صورة (A) من القرص (أو Ctrl-و) /H.ids وF.ids. سوف تظهر صورتين على النافذة.
   2. حدد الصورة H (تمييز) وانتقل إلى القائمة: أدوات الخوارزميات / تحويل / تحويل. سوف مربع الحوار "تحويل / إعادة تجميع عينة عشوائية صورة" يطفو على السطح. انقر على "إعادة تجميع عينة عشوائية" التبويب وتغيير إعادة تشكيله من حجم "H" إلى "واو" بعد ذلك، انقر على "تحويل" التبويب وتحميل "GrayG_To_GrayG1.mtx" عن طريق اختيار "اقرأ مصفوفة من ملف". انقر فوق موافق؛ سوف تظهر الصورة H_transform على النافذة. إغلاق صورة H ولكن يبقى H_transform وF في الإطار.
   3. حدد "H_transform" صورة (تمييز) وانتقل إلى القائمة: أدوات الخوارزميات / تحويل / تحويل. سوف مربع الحوار "تحويل / إعادة تجميع عينة عشوائية صورة" يطفو على السطح. انقر على "إعادة تجميع عينة عشوائية" التبويب وتغيير إعادة تشكيله من حجم "H_transform" إلى "F. & #34؛ بعد ذلك، انقر على "تحويل" التبويب وتحميل "HGray_transform_To_FGray.mtx" عن طريق اختيار "اقرأ مصفوفة من ملف". انقر فوق موافق؛ سوف تظهر "H_transform_transform" صورة على النافذة. إغلاق صورة H_transform. عند هذه النقطة، سوف يترك فقط H_transform_transform وF على النافذة.
   4. حدد "H_transform_transform" صورة (تمييز) وانتقل إلى القائمة: أدوات الخوارزميات / تحويل / تحويل غير الخطية. سوف مربع "B-المفتاح غير الخطية التحول" الحوار يطفو على السطح. المقبل، تحميل "HGray_transform_register.nlt" وانقر فوق موافق. سوف تظهر "H_transform_transform_registered" صورة على النافذة. حفظ الصورة كملف ICS. إغلاق كافة الصور الموجودة على النافذة.
3. الجمع بين أكوام صورة
   ملاحظة: هذه الخطوة هو الجمع بين اثنين من مداخن صورة المكتسبة في التوجهات المتعامدة (الأفقية والأمامية) في واحدة كومة عالية الدقة.
   1. الذهاب إلى القائمة: الإضافات / عام / ذبابة الفاكهة الشبكية ريجistrationl. سوف مربع الحوار "ذبابة الفاكهة الشبكية التسجيل v2.9" يطفو على السطح. تحميل "H.ics" في صورة H "H_transform_transform_registered" من الخطوة 3.2.4 في صورة H-عضو مسجل، "F.ics" في صورة F، "GrayG_To_GrayG1.mtx" من الخطوة 3.1.7 في التحول 1-الأخضر (اختياري )، "HGray_transform_To_FGray.mtx" من الخطوة 3.1.12 في تحويل 2-أفيني، و "HGray_transform_register.nlt" من الخطوة 3.1.14 في تحويل 3-اللاخطية (اختياري).
      1. تحديد الجذر التربيعي (الكثافة ح خ كثافة-F) ولا إعادة مقياس في "إعادة مقياس H إلى واو" إبقاء الخيارات الافتراضية للمعلمات المتبقية. انقر فوق موافق؛ هذه الخطوة سوف يستغرق حوالي 3 دقائق.
         ملاحظة: بعد المعالجة، سيتم إنشاء 3 مجموعات من الصور: combinedImage_sqrRt_trilinear_norescale_ignoreBG.ids (الصورة معاد النهائية)، greenChannelsImage-Gxreg-غراي-Gcomp.IDS (قناة خضراء لH، F، وصورة معاد النهائية)، وredChannelsImage- Rxreg-ري-Rcomp.ids (القناة الحمراء FOص H، F، وصورة معاد النهائية)؛ سيتم تغيير حجم جميع الملفات الإخراج إلى 512 × 512 × 512.
   2. فتح "combinedImage_sqrRt_trilinear_norescale_ignoreBG.ids" في إطار برنامج صورة التصور. حفظ كومة الصورة في شكل نظام الرصد الدولي وإعادة تسمية الملف. وسيتم استخدام هذا الملف صورة معاد للبحث عن المفقودين محوار والتسجيل.

4. بحث عن المفقودين Neurite ونقطة مرجعية تعيين

ملاحظة: هذه الخطوة هي لتتبع neurites التي (4.1) وتعيين نقاط مرجعية للتسجيل (4.2) باستخدام برنامج صورة التصور.

1. تتبع neurites التي
   1. بدء تشغيل البرنامج صورة التصور. فتح ملف الصورة معاد. الذهاب إلى القائمة: تحرير / مشاهدة العرض التعديل وإيقاف القناة مستقبلة للضوء (الأحمر).
   2. تصور الصورة في وضع "تفوق". بدوره على "ستيريو"، واستخدام وضع "رباعية عازلة" لتصور الصور 3D إذا كان الكمبيوتر مكافئuipped مع نظام المجسمة.
   3. الذهاب إلى القائمة: فق / الشعيرات لإضافة خيوط جديدة. انقر على "تخطي إنشاء التلقائي، يدويا تحرير" علامة التبويب.
   4. انقر فوق علامة التبويب "رسم" وحدد "AutoDepth."
   5. حدد "إعدادات"، حدد "الخط"، والمفتاح في عدد بكسل المناسبة لتحسين التصور (يتم استخدام خط 4 بكسل في هذا البروتوكول). اختيار "إظهار التشعبات،" "ابتداء من نقطة"، و "المتفرعة نقاط". تعيين "تقدم الجودة" إلى 100٪.
   6. حدد "رسم" علامة التبويب والبدء في تتبع neurites التي. نبدأ مع محور عصبي ومن ثم الانتقال إلى التشعبات (الشكل 2D). محور عصبي والتشعبات من الخلايا العصبية transmedulla من السهل تمييز.
      ملاحظة: الخلايا العصبية تيم تمتد محور عصبي لها من جسم الخلية والمشاريع على طول الطريق إلى مركز المعالجة البصرية العالي، وlobula. سيقوم النظام تلقائيا تحدد أول خيوط طويلة باعتباره محور عصبي وما تبقى من شعيرات قصيرة كماالتشعبات. إبقاء نقطة الانطلاق في بداية خيوط (عصبي) أثناء البحث عن المفقودين وتأكد من توصيل neurites التي تتبعها. دراسة نقاط المتفرعة ونقطة البداية. إذا لم يتم توصيل التشعبات، وسوف يتم تحديد نقطة بداية جديدة في خيوط غير متصل.
   7. بعد تتبع، انتقل إلى "إعدادات" ازل "ابتداء من نقطة" و "المتفرعة نقطة"، ثم انتقل إلى القائمة: فق / تصدير الكائنات المحددة ../. حفظ خيوط كملف مخترع (* .iv).
2. تعيين نقاط مرجعية
   1. حدد "عرض تعديل العرض" وبدوره على كل القنوات التصوير. في هذا المثال، قناة 1 هي تلطيخ مبصرة وقناة 2 هو الخلايا العصبية Tm20 (GFP).
   2. الذهاب إلى القائمة: فق / قياس. حدد "تحرير" علامة التبويب وتحقق "قناة محددة:" (حدد القناة مبصرة [الأحمر]).
   3. تعيين نقطة مرجعية للطبقة العليا. الذهاب إلى القائمة: / فق / قياس البوياليلة لخلق نقاط القياس الجديدة. بمناسبة بداية طبقة M1 باعتبارها الطبقة العليا. ترتيب النقاط كما يلي: الاستوائية، الأمامي-الاستوائية، الأمامي، الأمامي-بطني، بطني، الخلفية، بطني، الخلفية،-الخلفي الاستوائية، والمركز (الشكل 3F)؛ تحديد مستقبلة للضوء مركز كما هو المرتبطة بالعمليات الأكثر الجذعية.
   4. تعيين طبقات R8 وR7 كما في الخطوة 4.2.3 (الشكل 3G). يجب إنشاء ثلاث نقاط القياس الفردية في خطوات 4.2.3 و 4.2.4.
   5. تصدير إحداثيات نقاط لكل طبقة. انقر على "الإحصاء" علامة التبويب، حدد "تفصيلا"، "القيم المحددة"، و "الوظيفة"؛ وانقر فوق "تصدير الاحصائيات على تبويب العرض لملف". حفظ باسم "قيم مفصولة بفواصل" (* CSV.).
   6. فتح ملفات csv ثلاثة (من خطوات 4.2.3 - 4.2.4) والجمع بين إحداثيات النقاط المرجعية 27 في ملف CSV جديد من النسخ واللصق (الأمر ه هو الأعلى، R8، وR7). رؤية المواد / الجدول المعدات واتباع نسق ملف سبيل المثال.

5. جامدة للجسم وTPS اللاخطية التسجيل

ملاحظة: هذه الخطوة هي لتسجيل آثار محوار (في شكل د) إلى مرجع عمود مجموعة ولإنشاء ملف SWC المسجلين باستخدام برنامج MIPAV. هذا الجزء يتطلب من الملفات التالية: كومة صورة معاد (.ids) من الخطوة 3.3، ملف نقطة مرجعية (CSV) من الخطوة 4.2، ومحوار ملف التتبع خيوط (.iv) من الخطوة 4.1.

1. الذهاب إلى القائمة: الإضافات / عام / DrosophilaStandardColumnRegistration. سوف نافذة "DrosophilaStandardColumnRegistration v6.6.1" يطفو على السطح.
2. تحميل ملفات الصور (.ids)، ملف النقاط المرجعية (CSV)، وملف خيوط (.iv).
3. حدد 9 نقاط لكل طبقة.
4. تحديد موقف من الخلايا العصبية المصورة (LV / RD أو RV / LD).
5. حدد "تسجيل جامدعلى وTPS "و" تسجيل جامد "لغير الخطية والتسجيل جامدة الجسم، على التوالي.
6. الاختيار "إنشاء ملف SWC" لتوليد الناتج الملفات التالية: ملف تتبع محوار مسجل في شكل SWC (انظر المواد الخاصة / معدات لتعريف)، ملف الرابع مسجلة (.iv)، بتنسيق من محوار موحد (النص)، إحداثيات تحول (النص)، وصورة مشتركة (.ids).
7. تغيير اسم ملف SWC. تطبيق اختصار الموقع إلى نهاية اسم الملف (الخطوة 1.7). على سبيل المثال، استخدام "Tm20_3_RV.swc" لTm20 الخلايا العصبية رقم 3 تقع في النصف البطنية من النخاع الصحيح.

6. توحيد لتكوين بزر الماوس الأيمن بطني

ملاحظة: هذه الخطوة هي لتحويل آثار محوار (في شكل SWC) إلى RV القياسية (بزر الماوس الأيمن بطني) التكوين باستخدام برنامج نصي مخصص "RV_standardization.m." هنا، وكتب السيناريو باللغة مصفوفة المختبر. اليجب أن تكون أسماء الملفات SWC مساهمة في الشكل التالي: "NeuronName _ _ عدد .swc التكوين" (على سبيل المثال، Tm20_3_LV.swc).

1. فتح البرنامج النصي "RV_standardization.m".
2. تحرير المعلمات التالية في قسم "إدخال المستخدم":
   1. اكتب أسماء من الخلايا العصبية دون ترقيم (على سبيل المثال، TM2، Tm20، وما إلى ذلك) في "neuron_names."
      ملاحظة: الافتراضي في "file_end_in" هي "_ * SWC،" الذي يبحث عن الملفات ذات الأسماء التي تحتوي على ( "*" هو البدل مطابقة أي عدد من الأحرف) "_ * SWC". الافتراضي "swc_file_end_out" هو "_f.swc"، والتي سوف تضيف "_f" إلى نهاية اسم الملف بعد التوحيد.
   2. حدد الدليل حيث الملفات SWC هي في "directory_in". حدد الدليل حيث سيذهب ملفات موحدة في "directory_swcout".
3. تشغيل البرنامج النصي.
4. Optional: استخدام Vaa3D ¹⁴ لتصور ملفات SWC والتحقق من صحة عملية التحويل.

7. حساب الجذعية التشعب وإنهاء الترددات

ملاحظة: يستخدم هذه الخطوة جامدة للجسم تسجيل ملفات SWC لحساب المقدرات كابلان ماير لاحتمال أن شريحة شجيري سيبلغ طول معين دون إنهاء. يستخدم هذا البرنامج النصي وظيفتين Dendritic_Tree_Toolbox: extractDendriticSegmentLengthDistribution وestimateDendriticSegmentLengthProbability.

1. فتح البرنامج النصي "Branch_term_P.m".
2. تحرير المعلمات التالية في قسم "إدخال المستخدم":
   1. تحديد مسار الملفات SWC جامدة هيئة مسجلة في "pathToSWCFiles" (على سبيل المثال، / Rigid_Registered_swc /). تحديد المسار الذي سوف يعقد في إخراج الرسومات في "pathToOutput." تحديد اسم الخلايا العصبية أو أنواع العصبية في "neuron_names" (على سبيل المثال، TM2، تيم20، الخ).
3. تشغيل البرنامج النصي. مخرجات هي منحنى تقدير كابلان ماير لالمتفرعة شجيري وإنهاء الخدمة.
   ملاحظة: اختياري: تطبيق طريقة تركيب وظيفة لاستخراج من كابلان ماير المقدرون احتمال المحلي أن الجزء شجيري سوف تتفرع أو إنهاء.

8. قطعة أرض توزيع إنهاء طبقة معينة من الجذعية العرش

ملاحظة: هذه الخطوة المؤامرات توزيع محطات الجذعية في النخاع طبقات مختلفة مثل رسم بياني شريطي. ويمكن تطبيق هذا إلى الخلايا العصبية واحد، وهي مجموعة من الخلايا العصبية، أو مجموعة من الخلايا العصبية. يستخدم البرنامج النصي وظيفة extractDistributionAlongAxis من Dendritic_Tree_Toolbox.

1. فتح البرنامج النصي "Layer_term.m".
2. تحرير المعلمات التالية في قسم "إدخال المستخدم":
   1. حدد الدليل الذي يحتوي على الخطية مسجل ملفات SWC في "pathToSWCFiles" (على سبيل المثال، / Non_linear_Registered_swc /). حدد الدليل لإخراج الرسومات في "pathToOutput." تحديد اسم الخلايا العصبية أو أنواع العصبية في "neuron_names" (على سبيل المثال، TM2، Tm20، وما إلى ذلك).
3. تشغيل البرنامج النصي البرنامج التعليمي. الإخراج هو رسم بياني لنسبة العقد محطة في طبقات النخاع محددة.

9. مؤامرة إسقاط اتجاه مستو من التشعبات

ملاحظة: هذه الخطوة المؤامرات الاتجاهات إسقاط مستو من التشعبات باعتباره مؤامرة القطبية. يستخدم البرنامج النصي وظيفة extractAngularDistribution من Dendritic_Tree_Toolbox.

1. فتح البرنامج النصي "Planar_proj.m."
2. تحرير المعلمات التالية في قسم "إدخال المستخدم".
   1. حدد الدليل الذي يحتوي على الخطية ملفات SWC مسجلة في "pathToSWCFiles" (على سبيل المثال، / Non_linear_Registered_swc /). حدد الدليل لإخراج الرسوم البيانية في "pathToOutput." تحديد اسمالخلايا العصبية أو أنواع العصبية في "neuron_names" (على سبيل المثال، TM2، Tm20، وما إلى ذلك).
3. تشغيل البرنامج النصي. الإخراج هو مؤامرة القطبية من الاتجاهات إسقاط مستو.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

باستخدام الإجراء التصوير المزدوج عرض المعروضة هنا، تم تصوير دماغ الذبابة التي تحتوي على المسمى قليلة الخلايا العصبية Tm20 في اتجاهين متعامدين. قبل التصوير، كانت ملطخة الدماغ مع الأجسام المضادة الأولية والثانوية المناسبة لتصور GFP ومستقبلة للضوء الم?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

هنا، وتبين لنا كيفية صورة وتحليل العرش الجذعية من الخلايا العصبية النخاع ذبابة الفاكهة. ويصف الجزء الأول، ثنائي رأي التصوير، وdeconvolution والجمع بين اثنين من مداخن صورة إلى كومة صورة عالية الدقة. القسم الثاني، تتبع التغصنات والتسجيل، ويصف تتبع وتسجيل التشعبات من ا?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
Huygens Professional	Scientific Volume Imaging	version 16.05	for image deconvolution (https://svi.nl).  commercial software
MIPAV		version 7.3.0	for image recombination and registration (http://mipav.cit.nih.gov/); freeware
MIPAV plugin: PlugInDrosophila RetinalRegistration.class			freeware
MIPAV plugin: PlugInDrosophilaStandard ColumnRegistration.class			freeware
Imaris	Bitplane		for tracing neurites and assigning reference points for image registration (http://www.bitplane.com); commercial software
Vaa3D			for visualizing swc files (https://github.com/Vaa3D/release/releases/); freeware
Matlab	Mathworks	R2014b	for morphometric analysis of dendrites (http://www.mathworks.com); commercial software
Matlab toolbox: TREES1.14		v1.14	for analyzing dendritic morphometric parameters (http://www.treestoolbox.org/download.html); freeware
Matlab toolbox: Dendritic_Tree_Toolbox		v1.0	For calculating morphometric parameters (https://science.nichd.nih.gov/confluence/display/snc/Data+collections+for+imagines+combination+and+standardize+column+registration). Freeware
Name	Company	Catalog number	Comments
Sample files
SWC file definition			http://www.neuronland.org/NLMorphologyConverter/MorphologyFormats/SWC/Spec.html
The codes and sample files for image combination and registration			https://science.nichd.nih.gov/confluence/display/snc/Data+collections+for+imagines+combination+and+standardize+column+registration
Reference point example			https://science.nichd.nih.gov/confluence/download/attachments/117216914/points.csv?version=1&modificationDate= 1471880596000&api=v2
Name	Company	Catalog number	Comments
Computer system
MS Windows Windows 7 x64 or Macintosh OS X 10.7 or later			3GHz 64-bit quad-core processor, 16G RAM (minimal)
Optional: Quadro4000  (or above) graphic card	Nvidia		for stereographic visualization of dendrites.
Optional: NVIDIA 3D vision2	Nvidia		http://www.nvidia.com/object/3d-vision-main.html
Optional: 120 Hz LCD display for NVIDIA 3D vision2			http://www.nvidia.com/object/3d-vision-system-requirements.html
Name	Company	Catalog number	Comments
Reagents for imaging
24B10 antibody	The Developmental Studies Hybridoma Bank	24B10
GFP Tag Antibody	Thermofisher Scientific	G10362
Goat anti-Rabbit (H+L), Alexa Fluor 488	Thermofisher Scientific	A11034
Goat anti-Mouse (H+L), Alexa Fluor 568	Thermofisher Scientific	A21124
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1000
Mounting Clay	Fisher	S04179
70% glycerol in 1x PBS
Cover glasses, high performance, D = 0.17 mm	Zeiss	474030-9000-000