Analyse dendritique Morphologie dans les colonnes et les couches

Résumé

Ici, nous montrons comment analyser dendritique routage des neurones médullaires drosophile dans des colonnes et des couches. Le flux de travail comprend une technique d'imagerie à double vue d'améliorer la qualité de l'image et des outils informatiques pour le traçage, l'enregistrement arborisation dendritique à la matrice de la colonne de référence et pour l'analyse des structures dendritiques dans l'espace 3D.

Résumé

Dans de nombreuses régions du système nerveux central, tels que les mouches lobes optiques et le cortex des vertébrés, des circuits synaptiques sont organisés en couches et des colonnes pour faciliter le câblage du cerveau au cours du développement et de traitement de l'information chez les animaux développés. neurones postsynaptiques dendrites élaborés dans les modèles spécifiques de type dans des couches spécifiques à synapse avec des terminaux présynaptiques appropriés. Le neuropile mouche rachidien est composé de 10 couches et environ 750 colonnes; chaque colonne est innervée par dendrites de plus de 38 types de neurones médullaires, qui correspondent avec les terminaisons axonales de certains types de 7 afférences dans un mode spécifique de type. Ce rapport détaille les procédures à l'image et analyser les dendrites des neurones médullaires. Le flux de travail comprend trois sections: (i) la section d'imagerie à double vue combine deux piles d'images confocale collectées à des orientations orthogonales en une image 3D à haute résolution de dendrites; (Ii) la dendrite traçage et de la section d'enregistrement des traces dendritiquetonnelles en 3D et enregistre des traces dendritiques à la matrice de la colonne de référence; (Iii) la section d'analyse dendritique analyse des motifs dendritiques par rapport à des colonnes et des couches, y compris la terminaison et projection plane direction de tonnelles dendritiques spécifiques de la couche, et calcule les estimations du branchement et de terminaison des fréquences dendritiques. Les protocoles utilisent des plugins personnalisés construits sur le MIPAV open-source (Medical Imaging Processing, l'analyse et la visualisation) plate-forme et personnalisés toolboxes dans la langue de laboratoire de la matrice. Ensemble, ces protocoles fournissent un flux complet pour analyser le routage dendritique des neurones dans les couches médulla de Drosophila et de colonnes, afin d' identifier les types de cellules, et pour déterminer des défauts dans les mutants.

Introduction

Au cours du développement, les neurones dendrites élaborés dans les modèles ramifiés complexes mais stéréotypés pour former des synapses avec leurs partenaires présynaptiques. des motifs de ramification dendritique sont en corrélation avec l'identité et la fonction neuronale. Les emplacements des arbres dendritiques déterminent le type d'entrées présynaptiques qu'ils reçoivent, tandis que le dendritique ramification complexité et sur le terrain tailles régissent le nombre d'entrée. Ainsi, les propriétés morphologiques dendritiques sont des facteurs déterminants pour la connectivité synaptique et calcul neuronal. Dans de nombreuses régions de cerveaux complexes, tels que les mouches lobes optiques et la rétine des vertébrés, des circuits synaptiques sont organisés en colonnes et en couches pour faciliter le traitement des informations ^{1, 2.} Dans une telle organisation de la colonne et de la couche, les neurones présynaptiques d'un distinctes axones du projet de modalité de mettre fin à une couche spécifique (que l'on appelle le ciblage spécifique de la couche) et pour former un tableau à deux dimensions ordonnée (soi-called carte topographique), tandis que les neurones post-synaptiques étendent dendrites de tailles appropriées dans les couches spécifiques pour recevoir des entrées présynaptiques des types et nombres corrects. Alors que axonale ciblage des couches et des colonnes a été bien étudié ^{3, 4,} on sait beaucoup moins sur la façon dont les dendrites sont acheminés vers des couches spécifiques et à développer de manière appropriée dimensionnées champs récepteurs pour former des connexions synaptiques avec les partenaires présynaptiques corrects ^5. La difficulté de l'imagerie et dendritique quantifier le ciblage des couches et des colonnes a entravé l'étude du développement dendritique dans les structures cérébrales colonnaires et stratifiés.

Neurones médullaires drosophile sont un modèle idéal pour étudier le routage dendritique et assemblage de circuits dans les colonnes et les couches. Neuropile mouche rachidien est organisé en un réseau 3D de 10 couches et approximativement 750 colonnes. Chaque colonne est innervé par un ensemble de afférences, y compris photoreceptors R7 / R8 et les neurones de lamina L1 - L5, dont les bornes axonale former des cartes topographiques d'une manière spécifique à la couche ^6. Environ 38 types de neurones médullaires sont présents dans chaque colonne rachidien et dendrites élaborées dans des couches spécifiques et avec des tailles de champs appropriés pour recevoir des entrées de ces afférences ^7. Les circuits synaptiques dans les rachidien ont été reconstruits à l'échelle microscopique électronique; ainsi, les partenariats synaptiques sont bien établis ^{7, 8.} En outre, des outils génétiques pour le marquage de différents types de neurones sont disponibles médulla ^{9, 10, 11.} En examinant les trois types de transmedulla (TM), les neurones (Tm2, et TM9 TM20), nous avons précédemment identifié deux attributs type de cellule spécifique dendritiques: (i) neurones Tm projettent dendrites soit dans la direction antérieure ou postérieure (plane projdirection d'ection), en fonction des types cellulaires et de (ii) dendrites des neurones médulla se terminent dans les couches de la médulla spécifiques de façon type de cellule spécifique (terminaison spécifique couche) ^12. Planar direction de projection et de terminaison spécifique à couche sont suffisantes pour différencier ces trois types de neurones Tm, alors que les mutations qui perturbent les réponses Tm à la couche et de colonne indices affectent aspects distincts de ces attributs.

Ici, nous présentons un flux de travail complet pour l' analyse de la structuration dendritique des neurones médullaires drosophile dans les colonnes et les couches (figure 1). Tout d'abord, nous montrons une méthode d'imagerie à double sens, qui utilise un logiciel personnalisé pour combiner deux images confocal piles pour générer des images isotropes de haute qualité. Cette méthode ne nécessite que la microscopie confocale conventionnelle pour produire des images de haute qualité qui permettent la traçabilité fiable des branches dendritiques, sans avoir recours à la microscopie de super-résolution, une telles STED (émission stimulée Depletion) ou illumination structurelle. Deuxièmement, nous présentons une méthode pour le traçage des tonnelles dendritiques et pour enregistrer les traces de neurites résultant à une matrice de colonne de référence. Troisièmement, nous montrons les méthodes de calcul permettant d'extraire des informations sur la direction de projection plane et la terminaison spécifique de la couche de dendrites, ainsi que pour dériver des estimations pour ramifier et de terminaison de fréquences dendritiques. Ensemble, ces procédés permettent la caractérisation des modèles en 3D dendritiques, la classification des types de cellules sur la base des morphologies dendritiques, ainsi que l'identification des éventuels défauts dans les mutants.

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Protocole

Remarque: Le protocole contient trois sections: double vue imagerie (sections 1 - 3), le traçage et l' enregistrement dendritique (sections 4 - 6), et l' analyse dendritique (sections 7 - 9) (figure 1). Les codes et les fichiers d' exemples sont fournis dans le tableau des matériaux / équipement.

1. Double image Acquisition

REMARQUE: Cette étape est conçue pour l'acquisition de deux piles d'images du neurone d'intérêt dans les orientations deux orthogonale (horizontale et frontale).

1. Préparer les cerveaux de braguette qui contiennent peu de neurones marqués médulla (~ 10 cellules / lobe cérébral) avec un marqueur GFP membrane (mCD8GFP), ¹² comme décrit précédemment. Teindre le cerveau de lapin anti-GFP (pour les dendrites rachidien de neurones) et de la souris mAb24B10 (pour les axones photorécepteurs), les anticorps primaires et des anticorps secondaires fluorescents (Alexa 488 anti-lapin et Alexa 568 Les anticorps anti-souris), comme décrit précédemment13. Effacer le cerveau dans 70% de glycérol dans PBS 1x.
2. Pour monter le cerveau dans l'orientation horizontale (Figures 2A, B), transférer la volée cerveau de glycérol-autorisé à une baisse de 20 pi de antifade milieu de montage dans le centre d'une lame.
3. Attachez de petites parcelles d'argile aux 4 coins de la lamelle pour empêcher la lamelle d'écraser l'échantillon du cerveau pendant le montage.
   NOTE: Les patchs d'argile fournissent un amorti pour empêcher la lamelle de l'écrasement de l'échantillon. Chaque pastille d'argile doit être d'environ 1 mm de diamètre.
4. Sous un microscope de dissection, positionner les cerveaux en position ventrale et placer la lamelle sur le dessus pour fixer le cerveau. Utiliser la surface dorsale convexe du cerveau comme repère pour identifier l'orientation de l'échantillon du cerveau (figure 2A).
5. Obtenir la première pile d'image (vue horizontale) avec un microscope confocal. Utiliser une lentille d'objectif à grande NA (tel qu'un 63X 1,3 NA glycérol ou immersion dans l'huile objelentille ctive) et zoom numérique 2.5X (la taille du pixel est de 0,105 um par pixel, le nombre de la moyenne est de 2). Acquérir plus de 180 sections optiques (512 x 512 pixels) pour couvrir le neuropile rachidien avec une taille de pas de 0,2 pm.
6. Remontez le cerveau comme décrit dans les étapes 1.3 - 1.4, mais aligner le cerveau dans la position antérieure-up (vue frontale).
7. Acquérir la seconde pile d'image (vue frontale) du même neurone, tel que décrit dans l'étape 1.5.
   NOTE: Trouver le même neurone peut être difficile quand il y a de nombreux neurones marqués dans le lobe optique. Pour identifier les mêmes neurones des deux orientations, inférieure grossissement piles d'images à partir de deux points de vue peuvent être nécessaires (par exemple, utiliser un zoom de 0,7, et une taille de pas de 0,45 um pour acquérir l'image basse résolution des piles). Si l'image plus grande que 512 x 512, l'image doit être coupée à 512 x 512 avant combinaison d'image, et la taille de pixel doit garder à 0,105 um par pixel en imagerie du grand champ. La perte du signalest un problème potentiel pour les tissus profonds. Si le signal est faible, l'image de la moitié ventrale du cerveau. Pour réduire photoblanchiment lors de la numérisation, utilisez aussi bas une puissance laser que possible. Utilisez l'indicateur de plage pour vérifier la surexposition avant d'acquérir des piles d'images. Si possible, utilisez un microscope confocal équipé de détecteurs GaAsP.
8. Identifier et enregistrer l'emplacement du neurone d'intérêt par rapport à la neuropile rachidien (droite / gauche [R / L] et dorsale / ventrale [D / V]). Vérifiez si l'échantillon déplacé lors de l'acquisition d'image en examinant la pile d'images.
   REMARQUE: déplacement de l'échantillon est souvent due à un mauvais montage. Si le mouvement de l'échantillon se produit, la pile d'image ne peut pas être utilisé pour l'enregistrement et doit être jeté. Remettre en place l'échantillon, et acquérir des piles d'images à partir du même neurone.

2. image Déconvolution

NOTE: L'étape de déconvolution utilise un logiciel d'image de déconvolution pour restaurer les images acquises qui sont dégradées par le flouet le bruit. Bien que cette étape est facultative, elle améliore considérablement la qualité de l'image. Il est recommandé d'utiliser des piles d'images déconvoluées pour l'enregistrement de l'image et la combinaison à l'article 3.

1. Démarrez le programme de déconvolution dans le mode interactif. Charger la pile d'images (en LSM ou au format microscopique spécifique) en choisissant Menu: Fichier / Ouvrir (ou Ctrl-o) dans la fenêtre principale.
2. Cliquez pour sélectionner la pile d'image chargée et choisissez Menu: Ops pour ouvrir la fenêtre d'opération d'image. Utilisez le classique Estimation du maximum de vraisemblance (CMLE) algorithme par défaut.
3. Dans la fenêtre de commande d'image, cliquez sur l'onglet "Paramètres". Entrez les paramètres appropriés pour le moyen lentille à immersion, milieu d' inclusion, et l' ouverture numérique (par exemple, l' huile, la glycérine, etc.) (Par exemple, l' huile d'immersion, etc.) (NA; ici, 1.3 a été utilisé). Vérifiez les autres paramètres pour vous assurer qu'ils reflètent correctement les conditions d'imagerie. Cliquez sur l'onglet "Définir tout vérifié" à nageoirealize les réglages des paramètres.
4. Dans la fenêtre de commande d'image, cliquez sur l'onglet "Utilisation". Attribuer une destination de sortie (par exemple, c). Entrez les numéros appropriés dans "Signal / bruit par canal" (par exemple, "12 12 12 12" est un bon point de départ, tandis que le réglage par défaut est "20 20 20 20"). Utiliser les paramètres par défaut pour les autres paramètres.
5. Cliquez sur l'onglet "Run Command" pour démarrer déconvolution la pile d'image; ce processus pourrait prendre jusqu'à plusieurs dizaines de minutes pour terminer, en fonction de l'ordinateur.
6. Dans la fenêtre principale, cliquez sur et sélectionnez la pile d'images déconvoluée. Choisissez Menu: Enregistrer sous pour enregistrer l'image déconvoluée dans le format de fichier d'image ICS (.ics et .ids).
   NOTE: Chaque pile d'images a deux fichiers: le fichier ics contient les informations d'en-tête et le fichier ids contient les informations d'image brute.
   1. Renommez les fichiers d' image de la pile en fonction de l'orientation de l' image (par exemple, le nom du horizontal image vue spunaises H.ids et H.ics et le frontal-image vue pile F.ids et F.ics).

3. Double-view Combinaison d'images

Remarque: Cette étape combine deux piles d'images pour générer des images 3D haute résolution en utilisant le logiciel MIPAV.

1. Générer des matrices pour la combinaison de l'image.
   1. Démarrez le programme MIPAV. Charger les H et F piles d'images en choisissant Menu: Fichier / Ouvrir l'image (A) à partir du disque (ou Ctrl-f) /H.ids et F.ids; la fenêtre affiche deux images.
   2. Sélectionnez l'image H en cliquant sur l'image et choisissez Menu: Outils Utilitaires / Conversion / RGB / Grays; la fenêtre affiche GrayG, GrayB et images GrayR.
   3. Et fermer GrayR GrayB, ne gardant GrayG sur la fenêtre.
   4. Sélectionnez l'image F en cliquant sur l'image et choisissez Menu: Outils Utilitaires / Conversion / RGB / Grays. La fenêtre affiche GrayG1, GrayB1 et images GrayR1.
   5. Fermer GrayR1 et GrayB1 et ne garder que GrayG1 sur la fenêtre. A ce stade, seul GrJAJ et GrayG1 sont sur la fenêtre.
   6. Sélectionnez le GrayG (point culminant), choisissez Menu: Algorithmes / Enregistrement / Optimisé Enregistrement automatique de l'image; la boîte de dialogue "Optimisation de l'enregistrement automatique de l'image 3D" apparaîtra.
      1. Dans les Options d'entrée, changer les "degrés de liberté" de défaut "Affine-12" à "spécifique rescale-9." Dans clés -105 à 105 dans la "Plage de rotation angle d'échantillonnage" "Rotations" (liste par défaut: -30 à 30 degrés), 10 dans le "incrément angulaire grossier" (par défaut: 15 degrés), et 3 dans la "fine incrément angulaire "(par défaut: 6 degrés).
   7. Cliquez sur OK; le premier Matrix "GrayG_To_GrayG1.mtx" sera généré et enregistré dans le dossier d'image. Fermez toutes les fenêtres d'image et de passer à l'étape suivante; cette étape prendra au moins 15 min.
   8. Charger les H et F piles d'images en choisissant Menu: Fichier / Ouvrir l'image (A) à partir du disque (ou Ctrl-f) /H.ids et F.ids, comme à l'étape 3.1.1.
   9. Sélectionnez l'image H en cliquant sur l'image et choisissez Menu: Outils Utilitaires / Conversion / RGB / Gris; le "> RGB Gray" boîte de dialogue pop up. Cliquez sur OK; la fenêtre affiche des images "HGray". Gardez HGray et fermer l'image de H.
   10. Répétez l'étape 3.1.9 pour l'image F; les images "FGray" apparaîtront sur la fenêtre. Gardez FGray et fermer l'image F; seulement HGray et FGray seront laissés sur la fenêtre.
   11. Sélectionnez l'image HGray (sélectionner) et allez dans Menu: Outils Algorithmes / Transformation / Transformation. La boîte "Transform / Rééchantillonnage" de dialogue apparaîtra. Cliquez sur l'onglet "Resample" et changer le resample à la taille de "HGray" à "FGray". Ensuite, cliquez sur l'onglet "Transform" et la charge "GrayG_To_GrayG1.mtx" en sélectionnant "Lire la matrice à partir du fichier." Cliquez sur OK; la fenêtre affiche l'image HGray_transform. Fermez l'image HGray afin que HGray_transform et FGray sont laissés sur la fenêtre.
   12. Sélectionnez l'option "HGray_transform & #34; l'image (point culminant) et allez dans Menu: Algorithmes / Enregistrement / Optimisé Enregistrement automatique de l'image. La boîte de dialogue "Optimisation de l'enregistrement automatique de l'image 3D" apparaîtra. Dans "Rotations," clé de -5 à 5 dans la "Plage de rotation angle d'échantillonnage" (par défaut: -30 à 30 degrés), 3 dans le "incrément angulaire grossier" (par défaut: 15 degrés), et 1 dans le "Beaux incrément angulaire "(par défaut: 6 degrés). Cliquez sur OK.
       NOTE: Le Affine Matrix (HGray_transform_To_FGray.mtx) sera générée et enregistrée dans le dossier de l'image et l'image "HGray_Transform_register" sera affiché sur la fenêtre. Cette étape prendra au moins 40 min.
   13. Fermez l'image "HGray_transform"; seulement "HGray_Transform_register" et "FGray" devraient être laissés sur la fenêtre.
   14. Sélectionnez l'image "HGray_Transform_register" (sélectionner) et aller à Menu: Algorithmes / Enregistrement / B-Spline Enregistrement automatique 2D / 3D. Le "B-Spline automatique Registratisur-3D intensité "boîte de dialogue apparaîtra. Sélectionnez" moindres carrés "dans la fonction de coût (la valeur par défaut est Ratio de corrélation).
       1. Cliquez sur "Effectuer deux passes d'enregistrement". Dans la section Col 1, entrez 2 dans "descente de gradient Réduire Étape Taille (unités d'échantillonnage)" (la valeur par défaut est 1) et entrez 10 dans «Nombre maximal de Iterations:" (la valeur par défaut est 10). Dans la section Col 2, entrez 1 dans "Descent Gradient Réduire Étape Taille (unités d'échantillonnage)" (la valeur par défaut est de 0,5) et saisissez 2 dans «Nombre maximal de Iterations:" (la valeur par défaut est 10).
          NOTE: La matrice de NLT, "HGray_transform_register.nlt," sera enregistré dans le dossier de l'image et l'image "HGray_transform_register_registered" sera affiché sur la fenêtre. Cette étape prendra au moins 5 min.
   15. Fermez toutes les images de la fenêtre.
2. Générer l'image de référence pour la combinaison de l'image.
   REMARQUE: Cette étape est destinée à Genermangé une image horizontale enregistrée pour la combinaison.
   1. F l'image de charge H et des piles en choisissant Menu: Fichier / Ouvrir l'image (A) à partir du disque (ou Ctrl-f) /H.ids et F.ids; deux images apparaîtront sur la fenêtre.
   2. Sélectionnez l'image de H (sélectionner) et allez dans Menu: Outils Algorithmes / Transformation / Transformation; la boîte "Transform / Rééchantillonnage" de dialogue apparaîtra. Cliquez sur l'onglet "Resample" et changer le resample à partir d'une taille de "H" à "F." Ensuite, cliquez sur l'onglet "Transform" et la charge "GrayG_To_GrayG1.mtx" en sélectionnant "Lire la matrice à partir du fichier." Cliquez sur OK; l'image H_transform apparaîtra sur la fenêtre. Fermez l'image de H, mais garder H_transform et F dans la fenêtre.
   3. Sélectionnez l'image "H_transform" (sélectionner) et allez dans Menu: Outils Algorithmes / Transformation / Transformation; la boîte "Transform / Rééchantillonnage" de dialogue apparaîtra. Cliquez sur l'onglet "Resample" et changer le resample à partir d'une taille de "H_transform" à "F. & #34; Ensuite, cliquez sur l'onglet "Transform" et la charge "HGray_transform_To_FGray.mtx" en sélectionnant "Lire la matrice à partir du fichier." Cliquez sur OK; l'image "H_transform_transform" apparaît sur la fenêtre. Fermez l'image H_transform; à ce stade, que H_transform_transform et F seront laissés sur la fenêtre.
   4. Sélectionnez l'image "H_transform_transform" (sélectionner) et allez dans Menu: Outils Algorithmes / Transformation / Transformation non linéaire; la case «Transformation non linéaire B-Spline" boîte de dialogue apparaîtra. Ensuite, la charge "HGray_transform_register.nlt" et cliquez sur OK; l'image "H_transform_transform_registered" apparaît sur la fenêtre. Enregistrer l'image sous forme de fichier ics. Fermez toutes les images de la fenêtre.
3. La combinaison de piles d'images
   NOTE: Cette étape consiste à combiner deux piles d'images acquises dans des orientations orthogonales (horizontales et frontales) dans une pile à haute résolution.
   1. Allez dans Menu: Plugins / Générique / Drosophila Retinal Registrationl; la boîte de dialogue "Drosophila Retinal Enregistrement v2.9" pop up. Upload "H.ics" dans l'image H, "H_transform_transform_registered" de l'étape 3.2.4 dans l'image H-enregistré ", F.ics" dans l'image F, "GrayG_To_GrayG1.mtx" de l'étape 3.1.7 dans la transformation 1-Green (optionnel ), "HGray_transform_To_FGray.mtx" de l'étape 3.1.12 dans la transformation de 2-affines, et "HGray_transform_register.nlt" de l'étape 3.1.14 dans la transformation de 3-Nonlinear (en option).
      1. Sélectionnez sqrt (Intensité-H x Intensité-F) et n ° rescale dans «Rescale H à F." Conservez les options par défaut pour les autres paramètres. Cliquez sur OK; cette étape prendra environ 3 min.
         NOTE: Après le traitement, 3 séries d'images sera généré: combinedImage_sqrRt_trilinear_norescale_ignoreBG.ids (l'image finale recombiné), greenChannelsImage-Gxreg-Gy-Gcomp.IDS (canal vert pour H, F, et l'image finale recombiné), et redChannelsImage- Rxreg-Ry-Rcomp.ids (canal rouge for H, F et l'image finale recombinée); tous les fichiers de sortie seront redimensionnées à 512 x 512 x 512.
   2. Ouvrez "combinedImage_sqrRt_trilinear_norescale_ignoreBG.ids" sous le logiciel d'image de visualisation. Enregistrez la pile d'images dans le format ims et renommez le fichier; ce fichier image recombinée sera utilisé pour le traçage des neurites et l'enregistrement.

4. neurites Tracing et Point de référence Affectation

REMARQUE: Cette étape consiste à tracer neurites (4.1) et pour attribuer des points de référence pour l'enregistrement (4.2) à l'aide du logiciel de visualisation d'image.

1. Tracing neurites
   1. Démarrez le logiciel d'image de visualisation. Ouvrez le fichier image recombinée. Allez dans Menu: Modifier / Afficher Réglage de l'affichage et de désactiver le canal de photorécepteur (rouge).
   2. Visualisez l'image en mode "Surpass". Allumez "stéréo" et utiliser le mode "Quad Buffer" pour visualiser des images en 3D si l'ordinateur est equipped avec un système de stéréogramme.
   3. Allez dans Menu: Surpass / Filaments pour ajouter de nouveaux filaments. Cliquez sur le "Passer la création automatique, modifier manuellement" onglet.
   4. Cliquez sur l'onglet "Dessiner" et sélectionnez "AutoDepth."
   5. Sélectionnez "Paramètres" vérifier "Line" et entrez un numéro de pixel approprié pour une meilleure visualisation (une ligne 4-pixel est utilisé dans ce protocole). Cochez la case "Afficher dendrites", "Beginning Point," et "Points de branchement". Set "Qualité de rendu" à 100%.
   6. Sélectionnez l'onglet "Dessiner" et commencer à tracer neurites. Commencez avec l'axone et de passer ensuite aux dendrites (Figure 2D). L'axone et les dendrites des neurones transmedulla sont faciles à différencier.
      NOTE: Un neurone Tm étend son axone du corps cellulaire et projette tout le chemin vers le centre supérieur de traitement visuel, le lobula. Le système définit automatiquement le premier filament pourvu que l'axone et les filaments restants courts quedendrites. Gardez le point de départ au début du filament (axone) pendant le traçage et assurez-vous que les neurites tracés sont connectés. Examiner les points de branchement et le point de départ. Si les dendrites ne sont pas connectés, un nouveau point de départ sera définie au filament non-connecté.
   7. Après avoir tracé, revenir à "Paramètres", décochez "Commençant Point" et "Branching Point," et aller à Menu: Surpass / Export objets sélectionnés ../. Enregistrez le filament comme un fichier inventeur (* .iv).
2. Attribution des points de référence
   1. Sélectionnez "Afficher Réglage de l'affichage" et tourner sur les deux canaux d'imagerie. Dans cet exemple, le canal 1 est la coloration du photorécepteur et le canal 2 est le neurone TM20 (GFP).
   2. Allez dans Menu: Surpass / Mesure. Sélectionnez l'onglet "Modifier" et vérifier "Channel spécifique:" (sélectionner le canal photorécepteur [rouge]).
   3. Attribuer des points de référence pour la couche supérieure. Aller au menu: / Surpass / Mesure Points pour créer de nouveaux points de mesure. Marquer le début de la couche M1 comme une couche supérieure. L'ordre des points est la suivante: équatorial, antéro-équatorial, antérieure, antéro-ventrale, ventrale, postéro-ventrale, postérieure, postérieure-équatoriale, et le centre (Figure 3F); définir le photorécepteur central comme celui qui est associé aux procédés les plus dendritiques.
   4. Attribuer les couches R8 et R7 comme à l' étape 4.2.3 (figure 3G). Trois points de mesure individuels devraient être créés dans les étapes 4.2.3 et 4.2.4.
   5. Exporter les coordonnées des points pour chaque couche. Cliquez sur l'onglet "Statistiques", sélectionnez "détaillée", "valeurs spécifiques" et "Position"; et cliquez sur "Statistiques sur les exportations sur l'onglet Affichage dans le fichier." Enregistrer sous "Comma Separated Values" (* .csv).
   6. Ouvrez les trois fichiers csv (des étapes 4.2.3 - 4.2.4) et de combiner les coordonnées des points de référence 27 dans un nouveau fichier csv en copiant et collant (ee ordre est Top, R8 et R7). Voir la Matériaux / Équipement Table et suivre le format du fichier d'exemple.

5. Rigid-corps et TPS Nonlinear Inscription

REMARQUE: Cette étape consiste à enregistrer les traces de neurites (en format iv) à la matrice de la colonne de référence et pour générer un fichier swc enregistré en utilisant le programme MIPAV. Cet article exige que les fichiers suivants: la pile d'image recombinée (de .ids) de l'étape 3.3, le fichier de point de référence (.csv) de l'étape 4.2, et le fichier neurites trace de filament (.iv) de l'étape 4.1.

1. Allez dans Menu: Plugins / Générique / DrosophilaStandardColumnRegistration. La fenêtre "DrosophilaStandardColumnRegistration de v6.6.1" pop up.
2. Chargez les fichiers image (.ids), le fichier de points de référence (.csv), et le fichier de filament (.iv).
3. Sélectionnez 9 points par couche.
4. Sélectionnez la position du neurone imagé (LV / RD ou RV / LD).
5. Sélectionnez "Rigide Registratisur et TPS »et« Enregistrement rigide »pour non linéaire et l'enregistrement de corps rigide, respectivement.
6. Cochez la case "Créer un fichier SWC" pour générer les fichiers de sortie suivants: un fichier de trace enregistrée de neurites en format swc (voir Matériaux spécifiques / Équipement pour la définition), un fichier IV enregistré (.iv), les coordonnées de l'neurites standardisé (.txt), coordonnées transformées (.txt), et l'image combinée (.ids).
7. Changer le nom du fichier swc. Appliquer l'abréviation de l'emplacement à la fin du nom de fichier (étape 1.7). Par exemple, utiliser «Tm20_3_RV.swc» pour TM20 neurone n ° 3 situé à la moitié ventrale du droit medulla.

6. Normalisation Configuration droit ventral

REMARQUE: Cette étape consiste à convertir les traces de neurites (en format swc) à RV standard (droite-ventral) configuration à l'aide du script personnalisé "RV_standardization.m." Ici, le script a été écrit dans la langue de laboratoire de la matrice. lenoms des fichiers SWC d'entrée doivent être dans le format suivant: "NeuronName _ Nombre _ Configuration .swc" (par exemple, Tm20_3_LV.swc).

1. Ouvrez le script "RV_standardization.m".
2. Modifiez les paramètres suivants dans la section "d'entrée de l'utilisateur":
   1. Tapez les noms des neurones sans numérotation (par exemple, Tm2, TM20, etc.) dans "neuron_names."
      REMARQUE: La valeur par défaut dans "file_end_in" est "_ * swc,.", Qui recherche les fichiers avec des noms contenant ( "*" est un joker correspondant à un nombre quelconque de caractères) "_ * swc.". La valeur par défaut de "swc_file_end_out" est "_f.swc," qui va ajouter "_f" à la fin du nom de fichier après la normalisation.
   2. Spécifiez le répertoire dans lequel les fichiers SWC sont en "directory_in". Spécifiez le répertoire dans lequel les fichiers standardisés vont dans "directory_swcout".
3. Exécutez le script.
4. Optionnel: Utilisez Vaa3D ¹⁴ pour visualiser les fichiers SWC et valider la conversion.

7. Calculer dendritique Branching et Finalisation Fréquences

REMARQUE: Cette étape utilise corps rigide enregistré des fichiers SWC pour calculer les estimateurs de Kaplan-Meier pour la probabilité qu'un segment dendritique atteindra une longueur donnée sans terminer. Ce script utilise deux fonctions Dendritic_Tree_Toolbox: extractDendriticSegmentLengthDistribution et estimateDendriticSegmentLengthProbability.

1. Ouvrez le script "Branch_term_P.m".
2. Modifiez les paramètres suivants dans la section "d'entrée de l'utilisateur":
   1. Spécifiez le chemin d'accès aux fichiers SWC corps rigides enregistrés dans "pathToSWCFiles" (par exemple, / Rigid_Registered_swc /). Indiquez le chemin qui contiendra la sortie du graphique dans "pathToOutput." Indiquez le nom des neurones ou des types de neurones dans "neuron_names" (par exemple, Tm2, Tm20, etc.).
3. Exécutez le script; les sorties sont la courbe d'estimation de Kaplan-Meier pour ramification dendritique et la terminaison.
   NOTE: En option: Appliquer la méthode de la fonction ajustée pour extraire de la méthode de Kaplan-Meier estimateurs la probabilité locale que le segment dendritique branche ou résilier.

8. Tracer la distribution de résiliation spécifique à la couche d'dendritiques Arbors

REMARQUE: Cette étape trace la distribution des terminaux dendritiques dans les différentes couches de médullaires sous forme de graphique à barres. Ceci peut être appliqué à un neurone, un groupe de neurones ou groupes de neurones. Le script utilise la fonction extractDistributionAlongAxis de Dendritic_Tree_Toolbox.

1. Ouvrez le script "Layer_term.m".
2. Modifiez les paramètres suivants dans la section "d'entrée de l'utilisateur":
   1. Spécifiez le répertoire qui contient non linéaires enregistré des fichiers SWC dans "pathToSWCFiles" (par exemple, / Non_linear_Registered_swc /). Spécifiez le répertoire pour la sortie graphique dans "pathToOutput." Indiquez le nom des neurones ou des types de neurones dans "neuron_names" (par exemple, Tm2, TM20, etc.).
3. Exécutez le script d'apprentissage. La sortie est un histogramme de la proportion des noeuds terminaux dans les couches de la médulla spécifiques.

9. Terrain Projection Direction Planar de dendrites

REMARQUE: Cette étape trace les directions de projection planes de dendrites comme un tracé polaire. Le script utilise la fonction extractAngularDistribution de Dendritic_Tree_Toolbox.

1. Ouvrez le script "Planar_proj.m."
2. Modifiez les paramètres suivants dans la section "d'entrée de l'utilisateur".
   1. Spécifiez le répertoire qui contient les fichiers non linéaire swc enregistrés dans "pathToSWCFiles" (par exemple, / Non_linear_Registered_swc /). Spécifiez le répertoire pour la sortie graphique dans "pathToOutput." Indiquez le nom deles neurones ou les types de neurones dans neuron_names "» (par exemple, Tm2, TM20, etc.).
3. Exécutez le script; la sortie est un tracé polaire de directions de projection planes.

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Résultats

À l'aide du double point de vue technique d'imagerie présenté ici, un cerveau de mouche des neurones contenant TM20 faiblement marquées a été imagée dans deux directions orthogonales. Avant l'imagerie, le cerveau a été coloré avec des anticorps primaires et secondaires appropriés pour la visualisation de GFP et photorécepteurs axones membrane attachée. Pour l' imagerie, le cerveau est monté d' abord dans le sens horizontal (figure 2A, B).

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Discussion

Ici, nous montrons comment l' image et analyser arborisation dendritique des neurones médullaires drosophile. La première section, dual-view imagerie, décrit la déconvolution et la combinaison de deux piles d'images en une image pile à haute résolution. La deuxième section, le traçage de dendrites et de l'enregistrement, décrit le traçage et l'enregistrement des dendrites des neurones médullaires à la matrice de la colonne de référence. La troisième section, l'analyse dendriti...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
Huygens Professional	Scientific Volume Imaging	version 16.05	for image deconvolution (https://svi.nl).  commercial software
MIPAV		version 7.3.0	for image recombination and registration (http://mipav.cit.nih.gov/); freeware
MIPAV plugin: PlugInDrosophila RetinalRegistration.class			freeware
MIPAV plugin: PlugInDrosophilaStandard ColumnRegistration.class			freeware
Imaris	Bitplane		for tracing neurites and assigning reference points for image registration (http://www.bitplane.com); commercial software
Vaa3D			for visualizing swc files (https://github.com/Vaa3D/release/releases/); freeware
Matlab	Mathworks	R2014b	for morphometric analysis of dendrites (http://www.mathworks.com); commercial software
Matlab toolbox: TREES1.14		v1.14	for analyzing dendritic morphometric parameters (http://www.treestoolbox.org/download.html); freeware
Matlab toolbox: Dendritic_Tree_Toolbox		v1.0	For calculating morphometric parameters (https://science.nichd.nih.gov/confluence/display/snc/Data+collections+for+imagines+combination+and+standardize+column+registration). Freeware
Name	Company	Catalog number	Comments
Sample files
SWC file definition			http://www.neuronland.org/NLMorphologyConverter/MorphologyFormats/SWC/Spec.html
The codes and sample files for image combination and registration			https://science.nichd.nih.gov/confluence/display/snc/Data+collections+for+imagines+combination+and+standardize+column+registration
Reference point example			https://science.nichd.nih.gov/confluence/download/attachments/117216914/points.csv?version=1&modificationDate= 1471880596000&api=v2
Name	Company	Catalog number	Comments
Computer system
MS Windows Windows 7 x64 or Macintosh OS X 10.7 or later			3GHz 64-bit quad-core processor, 16G RAM (minimal)
Optional: Quadro4000  (or above) graphic card	Nvidia		for stereographic visualization of dendrites.
Optional: NVIDIA 3D vision2	Nvidia		http://www.nvidia.com/object/3d-vision-main.html
Optional: 120 Hz LCD display for NVIDIA 3D vision2			http://www.nvidia.com/object/3d-vision-system-requirements.html
Name	Company	Catalog number	Comments
Reagents for imaging
24B10 antibody	The Developmental Studies Hybridoma Bank	24B10
GFP Tag Antibody	Thermofisher Scientific	G10362
Goat anti-Rabbit (H+L), Alexa Fluor 488	Thermofisher Scientific	A11034
Goat anti-Mouse (H+L), Alexa Fluor 568	Thermofisher Scientific	A21124
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1000
Mounting Clay	Fisher	S04179
70% glycerol in 1x PBS
Cover glasses, high performance, D = 0.17 mm	Zeiss	474030-9000-000