Анализ Дендритные Морфология в столбцах и слоях

Резюме

Здесь мы покажем , как анализировать дендритных маршрутизацию продолговатого мозга нейронов дрозофилы в столбцах и слоях. Технологический процесс включает в себя метод визуализации двойного просмотра для улучшения качества изображения и вычислительных средств для отслеживания, регистрации дендритные беседок в массив опорного столбца и для анализа дендритных структур в 3D-пространстве.

Аннотация

Во многих регионах центральной нервной системы, таких, как муха оптических роторами и позвоночного коры, синаптические контуры организованы в слои и столбцы для облегчения проводки мозга во время разработки и обработки информации в развитых животных. Постсинаптических нейроны сложные дендритов в моделях типа специфичные в определенных слоях для синапса с соответствующими пресинаптических окончаний. Муха мозговое нейропиля состоит из 10 слоев и около 750 колонн; каждый столбец иннервируют дендриты более 38 типов нейронов продолговатого мозга, которые соответствуют с аксонов терминалов некоторых 7 типов афферентов в моде типоспецифичной. В этом докладе подробно описываются процедуры для изображения и анализа дендритов нейронов продолговатого мозга. Технологический процесс включает в себя три раздела: (I) блок формирования изображения двойного зрения объединяет два конфокальной стеки изображений, собранных в ортогональных направлениях в высоком разрешении 3D изображения дендритов; (II) дендрит отслеживания и регистрации секции следы дендритнуюбеседок в 3D и регистрирует дендритные следы в массив опорного столбца; (III) в разделе дендритных анализ дендритных анализ моделей относительно столбцов и слоев, в том числе уровня конкретных терминации и плоской проекции направления дендритных беседок, и выводит оценки дендритных ветвлений и терминации частот. Протоколы используют пользовательские модули, построенные на открытым исходным кодом MIPAV (Medical Imaging обработки, анализа и визуализации) платформ и пользовательских панелей инструментов в матрице лабораторного языка. Вместе эти протоколы обеспечивают полный рабочий процесс для анализа дендритов маршрутизации продолговатого нейронов Drosophila в слоях и столбцов, чтобы идентифицировать типы клеток, а также для определения дефектов в мутантов.

Введение

Во время развития нейроны сложные дендритов в сложных, но стереотипных разветвленных моделей для формирования синапсы с их пресинаптических партнерами. Дендритные ветвящиеся структуры коррелируют с нейрональной идентичности и функций. Места дендритных беседок определяют тип пресинаптических входов, которые они получают, в то время как дендритные ветвления сложности и размеров поля определяют номер входа. Таким образом, дендритные морфологические свойства являются важнейшими факторами, определяющими для синаптической связности и нейронного вычисления. Во многих регионах сложных мозга, таких , как муха зрительных долей и сетчатки позвоночных, синаптические цепи организованы в виде столбцов и слоев для облегчения обработки информации ^{1, 2.} В такой колонке и слой организации а, пресинаптические нейроны отчетливой аксонов модальность проекта, чтобы прекратить действие в определенном слое (так называемый слой-специфическое нацеливание) и сформировать упорядоченную двумерный массив (так каллеd топографическую карту), в то время как постсинаптические нейроны расширить дендритов соответствующих размеров в отдельных слоях, чтобы получить пресинаптические входы правильных типов и чисел. В то время как аксонов ориентации на слои и колонн были хорошо изучены ^{3, 4,} гораздо меньше известно о том , как дендриты направляются на конкретные слои и расширения соответствующего размера рецептивные поля для формирования синаптических связей с правильными пресинаптических партнерами ^5. Трудность визуализации и количественной оценки дендритные ориентации на слои и колонн затруднило изучение дендритных развития в столбчатых и слоистых структур мозга.

Дрозофилы нейроны мозгового слоя идеальной моделью для изучения дендритов маршрутизации и сборки схемы в столбцах и слоях. Муха мозговое нейропиля организована в виде 3D решетки 10 слоев и примерно 750 колонн. Каждый столбец иннервируют набором афферентов, в том числе рhotoreceptors R7 / R8 и ламинированным нейроны L1 - L5, чьи аксонов терминалы образуют топографические карты в моде ⁶ слоев конкретного. Около 38 типов нейронов продолговатого мозга присутствуют в каждом столбце продолговатом и сложные дендритов в определенных слоях и с соответствующими размерами поля , чтобы принимать входные сигналы от этих афферентов ^7. В синаптические схемы в мозговом были реконструированы на микроскопическом уровне электронов; Таким образом, синаптические партнерства хорошо известны ^{7, 8.} Кроме того, генетические инструменты для маркировки различных типов нейронов продолговатого мозга доступны ^{9, 10, 11.} Изучив три типа transmedulla (Tm) нейронов (Tm2, ТМ9 и TM20), ранее мы определили два типа клеток специфических дендритных атрибуты: (I) Tm нейроны проецируются дендриты либо в переднем или заднем направлении (плоская ProjНаправление прогиб), в зависимости от типов клеток и (II) дендриты нейронов продолговатого мозга заканчиваются в определенных слоях продолговатого мозга в моде камерного типа специфических (окончание слоя конкретного) ^12. Planar направление проекции и прекращение слоя конкретных достаточно, чтобы дифференцировать эти три типа Tm нейронов, в то время как мутации, которые нарушают Tm ответов на слой и столбцов киев влияют на различные аспекты этих атрибутов.

Здесь мы представляем полный рабочий процесс для изучения дендритов кучность продолговатого мозга нейронов дрозофилы в столбцах и слоях (рисунок 1). Во-первых, мы покажем способ визуализации двойного зрения, которая использует специализированное программное обеспечение, чтобы объединить два конфокальной изображения стеки для создания высококачественных изотропные изображения. Этот метод требует только обычные конфокальной микроскопии для создания высококачественных изображений, которые позволяют для надежного отслеживания дендритных ветвей, не прибегая к сверхвысокого разрешения микроскопии, такойs STED (стимулированное излучение Истощение) или структурное освещение. Во-вторых, мы представляем метод для отслеживания дендритные беседок и регистрации полученных следов аксонов в массив опорного столбца. В-третьих, мы покажем вычислительные методы для извлечения информации о направлении плоской проекции и окончания дендритов слоя конкретных, а также для получения оценок для дендритных ветвлений и терминации частот. Вместе эти методы позволяют для характеристики дендритных моделей в 3D, классификации типов клеток на основе дендритных морфологией, а также выявление потенциальных дефектов в мутантов.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Примечание: Протокол содержит три раздела: двойного просмотра изображений (разделы 1 - 3), дендритов трассировку и регистрацию (разделы 4 - 6) и дендритов анализ (разделы 7 - 9) (Рисунок 1). Коды и примеры файлов представлены в таблице материалов / оборудования.

1. Dual-Image Acquisition

Примечание: Этот шаг предназначен для получения двух изображений штабеля нейроне интерес в двух ортогональных (горизонтальной и фронтальной) ориентации.

1. Приготовьте летать мозги , которые содержат редко меченых нейронов мозгового вещества (~ 10 клеток / лепестка мозга) с мембраной GFP маркером (mCD8GFP), как описано ранее ^12. Пятно мозг с кроличьими анти-GFP (для Мозговое нейрон дендритов) и мыши (mAb24B10 для фоторецепторных аксонов), первичных антител и флуоресцентных вторичными антителами (Alexa 488 анти-кроличьего и Alexa 568 антитела против мышиных), как описано ранее13. Очистить мозг в 70% глицерина в 1x PBS.
2. Для того, чтобы смонтировать мозг в горизонтальной ориентации (2А рис, Б), передать глицерин-очищенный муха мозг капли 20 мкл antifade монтажной среды в центре слайда.
3. Приложить небольшие участки глины на 4-х углов покровное, чтобы предотвратить покровное от дробления образца мозга во время монтажа.
   Примечание: Глиняные пластыри обеспечивают амортизацию, чтобы предотвратить покровное от дробления образца. Каждая глина патч должен быть около 1 мм в диаметре.
4. Под микроскопом рассекает, поместите мозги в вентральной положении вверх и поместите покровное на вершине, чтобы обеспечить мозг. С помощью выпуклой спинной поверхности мозга в качестве ориентира для определения ориентации образца мозга (рис 2А).
5. Получить первый стек изображения (горизонтальный вид) с помощью конфокальной микроскопии. Использование высокой NA линзы объектива (например, 63x 1,3 NA глицерин или масло погружения OBJEctive линзы) и 2.5X цифровой зум (размер пикселя 0,105 мкм на пиксель, число усреднения 2). Приобретать более 180 оптических секций (512 х 512 пикселей), чтобы покрыть продолговатый нейропиля с размером шага 0,2 мкм.
6. Перемонтируйте мозг, как описано в пунктах 1.3 - 1.4, но выровнять мозг в переднем положении вверх (вид спереди).
7. Acquire второго стека изображений (фронтальный вид) того же нейроне, как описано на стадии 1.5.
   Примечание: Нахождение один и тот же нейрон может быть сложным, когда существуют многочисленные нейроны, меченные в зрительном доле. Для того, чтобы определить те же нейроны от обеих ориентаций, более низкого увеличения изображения стеки из обоих взглядов может потребоваться (например, использовать зум 0,7 и размер шага 0,45 мкм для приобретения стеки изображений с низким разрешением). Если изображение больше, чем 512 х 512, изображение должно быть обрезана до 512 х 512 до совмещения изображений, а также размер пикселя должен держать на 0,105 мкм на пиксель в то время визуализации большое поле. Потеря сигналаявляется потенциальной проблемой для глубоких тканей. Если сигнал слабый, изображение вентральный половина мозга. Для уменьшения фотообесцвечивание во время сканирования, использовать в качестве низкой мощности лазера, насколько это возможно. Используйте индикатор диапазона для проверки передержки до приобретения стеки изображения. Если возможно, используйте конфокальной микроскопии оснащены детекторами GaAsP.
8. Определить и записать местоположение нейроном интерес по отношению к продолговатом нейропиля (правый / левый [R / L] и спинным / вентральной [D / V]). Проверьте, если образец перемещается во время получения изображения путем анализа стека изображений.
   Примечание: Образец движущихся часто происходит из-за неправильного монтажа. Если происходит перемещение образца, стек изображения не может быть использован для регистрации и должны быть отброшены. Повторно установите образец и приобрести стеки изображения из того же нейроне.

2. Изображение Деконволюция

Примечание: шаг деконволюции использует программное обеспечение изображения деконволюции для восстановления полученных изображений, которые разлагаются путем размыванияи шум. Хотя этот шаг не является обязательным, он значительно улучшает качество изображения. Рекомендуется использовать деконволюции стеки изображения для регистрации изображений и комбинации в разделе 3.

1. Запустите программу деконволюции в интерактивном режиме. Загрузите стопку изображения (в LSM или конкретного микроскопического формата), выбрав Меню: Файл / Открыть (или Ctrl-O) в главном окне.
2. Нажмите, чтобы выбрать загруженный стек изображения и выберите Меню: Ops, чтобы открыть рабочее окно изображения. Используйте алгоритм по умолчанию Классический максимального правдоподобия Оценка (CMLE).
3. В операционном окне изображения, перейдите на вкладку "Параметры". Введите соответствующие параметры для объектива иммерсионной среды, вложение среды и числовой апертурой (например, масло, глицерин и др.) (Например, иммерсионное масло и др.) (NA; здесь, 1.3 использовалась). Проверьте остальные параметры, чтобы убедиться, что они правильно отражают условия формирования изображения. Перейдите на вкладку "Установить все проверено" плавникАлизе настройки параметров.
4. В операционном окне изображения, перейдите на вкладку "Операция". Назначение выходного назначения (например, в). Введите соответствующие номера в "сигнал / шум на канал" (например, "12 12 12 12" является хорошей отправной точкой, в то время как значение по умолчанию "20 20 20 20"). Использовать параметры по умолчанию для остальных параметров.
5. Перейдите на вкладку "Run Command", чтобы начать deconvoluting стек изображения; этот процесс может занять до нескольких десятков минут, чтобы закончить, в зависимости от компьютера.
6. В главном окне программы, нажмите и выберите деконволюции стека изображений. Выберите Меню: Сохранить как для сохранения деконволюции изображения в формате ICS изображения (.ics и .ids).
   Примечание: Каждый стек изображение имеет два файла: файл содержит ИКС информацию заголовка и файл идентификаторами содержит информацию исходного изображения в.
   1. Переименовать файлы стека изображения в соответствии с ориентацией изображения (например, название горизонтального вида изображения sГвозди H.ids и H.ics и лобно-вид стека изображения F.ids и F.ics).

3. Двойной вид изображения Комбинация

Примечание: Этот шаг объединяет два изображения стеки для создания высокого разрешения 3D-изображений с помощью программного обеспечения MIPAV.

1. Создание матриц для комбинации изображений.
   1. Запустите программу MIPAV. Загрузите изображения стеки H и F, выбрав Меню: Файл / Открыть изображение (A) с диска (или Ctrl-F) /H.ids и F.ids; окно покажет два изображения.
   2. Выберите H изображение, нажав на изображение и выберите Меню: Инструменты Утилиты / преобразования / RGB / Grays; окно покажет GrayG, GrayB и Грайр изображения.
   3. Закрыть Грайр и GrayB, только держа GrayG на окне.
   4. Выберите F изображение, нажав на изображение и выберите Меню: Утилиты / Conversion Tools / RGB / Серых. В окне появится GrayG1, GrayB1 и GrayR1 изображения.
   5. Закрыть GrayR1 и GrayB1 и держать только GrayG1 на окне. На данном этапе, только GrАЙГ и GrayG1 находятся на окне.
   6. Выберите GrayG (выделения), выберите Меню: Алгоритмы / регистрация / Оптимизированный автоматическую регистрацию изображения; кнопку «3D Оптимизированный Автоматическая регистрация изображения" диалоговое окно появится.
      1. В опции ввода, измените "степеней свободы" от дефолта "аффинно-12" до "Удельная Rescale-9". В "Вращения," ключ введен -105 до 105 в "диапазоне угла поворота выборки" (по умолчанию: от -30 до 30 градусов), 10 в "Грубый приращения угла" (по умолчанию: 15 градусов), и 3 в "Fine угол приращения "(по умолчанию: 6 градусов).
   7. Нажмите кнопку ОК; первая матрица "GrayG_To_GrayG1.mtx" будет создан и сохранен в папке изображения. Закройте все окна изображения и перейти к следующему шагу; этот шаг займет по меньшей мере 15 мин.
   8. Загрузите изображения стеки H и F, выбрав Меню: Файл / Открыть изображение (A) с диска (или Ctrl-F) /H.ids и F.ids, как в шаге 3.1.1.
   9. Выберите H изображение, нажав на изображение и выберите Меню: Инструменты Утилиты / преобразования / RGB / серый цвет; К "RGB-> Серый" диалоговое окно появится. Нажмите кнопку ОК; окно будет показывать "HGray" изображения. Держите HGray и закройте изобр.
   10. Повторите шаг 3.1.9 для F изображения; образы "FGray" появится в окне. Держите FGray и закройте F изображение; только HGray и FGray будут оставлены на окне.
   11. Выберите HGray изображение (выделения) и перейдите в меню: Алгоритмы / Инструменты преобразования / преобразования. Диалоговое окно "Transform / Resample Image" выскочит. Перейдите на вкладку "Интерполяция" и изменить частоты дискретизации до размера "HGray" до "FGray". Затем перейдите на вкладку "Transform" и нагрузки "GrayG_To_GrayG1.mtx", выбрав "Считать матрицу из файла." Нажмите кнопку ОК; окно будет показывать изображение HGray_transform. Закройте HGray изображение таким образом, только HGray_transform и FGray оставляют на окне.
   12. Выберите "HGray_transform & #34; изображение (выделить) и перейдите в меню: Алгоритмы / Регистрация / Оптимизированная Автоматическая регистрация изображения. "3D Оптимизированный Автоматическая регистрация изображения" диалоговое окно появится. В "Вращения" ключом от -5 до 5 в "диапазоне угла поворота выборки" (по умолчанию: от -30 до 30 градусов), 3 в "Грубый приращения угла" (по умолчанию: 15 градусов), и 1 в "Fine угол приращения "(по умолчанию: 6 градусов). Нажмите кнопку ОК.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Матрица аффинных (HGray_transform_To_FGray.mtx) будет создан и сохранен в папке изображения, и изображение "HGray_Transform_register" будет отображаться в окне. Этот шаг займет по меньшей мере 40 мин.
   13. Закройте "HGray_transform" изображение; только "HGray_Transform_register" и "FGray" следует оставить на окне.
   14. Выберите "HGray_Transform_register" изображение (выделения) и перейдите в меню: Алгоритмы / Регистрация / B-сплайн Автоматическая регистрация 2D / 3D. "B-Spline Автоматическая Регистрацияна 3D интенсивности "диалоговое окно появится. Выберите" наименьших квадратов "в функции затрат (по умолчанию коэффициент корреляции).
       1. Нажмите кнопку "Выполнить двухпроходным регистрацию". В разделе Pass 1, введите 2 в "Gradient Descent Минимизировать размер шага (единицы выборки)" (по умолчанию 1) и ключ в 10 в "Максимальное количество повторов:" (по умолчанию 10). В разделе Pass 2, введите 1 в "Gradient Descent Минимизировать размер шага (единицы выборки)" (по умолчанию 0.5) и ключ в 2-х в "Максимальное количество повторов:" (по умолчанию 10).
          ПРИМЕЧАНИЕ: NLT матрица, "HGray_transform_register.nlt," будут сохранены в папке изображения, и изображение "HGray_transform_register_registered" будет отображаться в окне. Этот шаг займет по меньшей мере 5 мин.
   15. Закройте все изображения в окне.
2. Создание опорного изображения для комбинации изображений.
   Примечание: Этот шаг предназначен для Generели зарегистрированный горизонтальный изображение для комбинации.
   1. Нагрузка H и F изображений стеки, выбрав меню: Файл / Открыть изображение (A) с диска (или Ctrl-F) /H.ids и F.ids; два изображения будут отображаться в окне.
   2. Выберите изображение H (выделения) и перейдите в меню: Алгоритмы / Инструменты преобразования / преобразования; диалоговое окно "Transform / Resample Image" выскочит. Перейдите на вкладку "Интерполяция" и изменить частоты дискретизации от размера "H" к "Ф." Затем перейдите на вкладку "Transform" и нагрузки "GrayG_To_GrayG1.mtx", выбрав "Read матрицу из файла." Нажмите кнопку ОК; H_transform изображение появится в окне. Закройте H изображение, но сохранить H_transform и F в окне.
   3. Выберите "H_transform" изображение (выделения) и перейдите в меню: Алгоритмы / Инструменты преобразования / преобразования; диалоговое окно "Transform / Resample Image" выскочит. Перейдите на вкладку "Интерполяция" и изменить частоты дискретизации от размера "H_transform" до "F. & #34; Затем перейдите на вкладку "Transform" и нагрузки "HGray_transform_To_FGray.mtx", выбрав "Read матрицу из файла." Нажмите кнопку ОК; образ "H_transform_transform" появится в окне. Закройте изображение H_transform; на данный момент, только H_transform_transform и F будут оставлены на окне.
   4. Выберите "H_transform_transform" изображение (выделения) и перейдите в меню: Алгоритмы / Инструменты преобразования / преобразования нелинейных; «нелинейный преобразование B-Spline" диалоговое окно появится. Далее, нагрузка "HGray_transform_register.nlt" и нажмите кнопку OK; образ "H_transform_transform_registered" появится в окне. Сохранить изображение как файл мика. Закройте все изображения в окне.
3. Объединение стеки изображений
   Примечание: Этот шаг, чтобы объединить два изображения стеки, полученные в ортогональных направлениях (по горизонтали и фронтальной) в один стек с высокой разрешающей способностью.
   1. Выберите Меню: Плагины / Generic / Drosophila сетчатке Регistrationl; диалоговое окно "Drosophila сетчатке Регистрация v2.9" появится. Загрузить "H.ics" в изображении H, "H_transform_transform_registered" из стадии 3.2.4 в изображение H-Зарегистрировано "F.ics" в изображение F, "GrayG_To_GrayG1.mtx" с шага 3.1.7 в трансформации 1-зеленый (опционально ), "HGray_transform_To_FGray.mtx" из стадии 3.1.12 трансформации 2-аффинных и "HGray_transform_register.nlt" из стадии 3.1.14 в трансформации 3-Нелинейная (по желанию).
      1. Выберите SQRT (Intensity-H х Интенсивность-F) и не Rescale в "Rescale H до F." Держите параметры по умолчанию для остальных параметров. Нажмите кнопку ОК; этот шаг займет около 3 мин.
         Примечание: После обработки, будет генерироваться 3 набора изображений: combinedImage_sqrRt_trilinear_norescale_ignoreBG.ids (конечная рекомбинируют изображение), greenChannelsImage-Gxreg-Гы-Gcomp.IDS (зеленый канал для H, F, и окончательный рекомбинируют изображение), и redChannelsImage- Rxreg-Ry-Rcomp.ids (красный канал FOR H, F, и окончательный рекомбинируют изображение); все выходные файлы будут изменены до 512 х 512 х 512.
   2. Open "combinedImage_sqrRt_trilinear_norescale_ignoreBG.ids" под программное обеспечение визуализации изображения. Сохранение стека изображений в формате ИСМ и переименовать файл; этот файл рекомбинируют изображение будет использоваться для отслеживания аксонов и регистрации.

4. нейритов Трассировка и реферирование Назначение

Примечание: Этот шаг должен проследить невриты (4.1) и назначить опорные точки для регистрации (4.2) с помощью программного обеспечения визуализации изображения.

1. Трассировка невриты
   1. Запустите программное обеспечение визуализации изображения. Откройте файл рекомбинированную изображения. Перейти к меню: Редактировать / Показать Настройка дисплея и выключить фоторецепторов канал (красный).
   2. Визуализируйте изображение в режиме "перегнать". Включите "стерео" и использовать режим "Quad Buffer" для визуализации 3D-изображений, если компьютер эквuipped с системой Stereograph.
   3. Перейти к меню: Surpass / Нити для добавления новых нитей. Нажмите кнопку "Пропустить автоматическое создание, редактирование вручную" на вкладке.
   4. Перейдите на вкладку "Draw" и выберите "AutoDepth."
   5. Выберите "Настройки" установите флажок "Линия" и ключ в соответствующее число пикселей для лучшей визуализации (4-пиксельный линия используется в данном протоколе). Отметьте опцию "Show дендритов", "Начиная с точки" и "точки ветвления". Установить "качество рендеринга" до 100%.
   6. Выберите вкладку "рисовать" и начать отслеживание невриты. Начните с аксона , а затем перейти к дендритов (рис 2D). Аксон и дендриты нейронов transmedulla легко дифференцировать.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Tm нейрон расширяет аксона от тела клетки и проекты вплоть до высшей визуальной обработки центра, lobula. Система будет автоматически определять первую длинную нить как аксон, а остальные короткие нити, какдендриты. Держите начальную точку в начале нити (аксона) во время трассировки и убедитесь, что прорисованные невриты связаны. Изучите точки ветвления и начальную точку. Если дендриты не подключены, новая точка начала будет определяться в неподключенном нити.
   7. После трассировки, вернитесь в раздел "Настройки" снимите флажок "начального пункта" и "точки ветвления", и перейдите в меню: Surpass / Экспорт выбранных объектов ../. Сохранить нить как файл изобретателя (* .iv).
2. Назначение опорных точек
   1. Выберите "Показать экран настройки" и включите на обоих каналах визуализации. В этом примере канал 1 является фоторецептор Окрашивание и канал 2 является TM20 нейрон (GFP).
   2. Перейти к меню: Surpass / измерения. Выберите вкладку "Изменить" и установите флажок "конкретного канала:" (выберите фоторецептора канал [красный]).
   3. Назначение опорных точек для верхнего слоя. Выберите Меню: / Surpass / Пои ИзмерениеNTS для создания новых точек измерения. Отметьте начало слоя M1 в качестве верхнего слоя. Порядок точек выглядит следующим образом : экваториальный, передне-экваториальный, передней, передне-вентральной, вентральной, задней-вентральной, задний, задне-экваториальный, и в центре (рис 3F); определяется центр фоторецептор, как один, связанный с наиболее дендритных процессов.
   4. Назначают слои R8 и R7 , как на этапе 4.2.3 (рисунок 3G). Три отдельные точки измерения должны быть созданы на этапах 4.2.3 и 4.2.4.
   5. Экспорт координат точек для каждого слоя. Перейдите на вкладку "Статистика", выберите пункт "Детальный", "Конкретные значения" и "установки"; и нажмите кнопку "Экспорт статистики на вкладке Отображение в файл." Сохранить как ", разделенных запятыми значения" (* .csv).
   6. Откройте три CSV файлов (от шагов, 4.2.3 - 4.2.4) и объединить координаты 27 опорных точек в новый файл CSV путем копирования и вставки (тысе заказ Top, R8 и R7). Смотрите материалы / оборудование Стол и следовать формату примера файла.

5. твердого тела и TPS Нелинейная регистрации

Примечание: Этот шаг должен зарегистрировать следы нейритов (в формате IV) в массив опорного столбца и для создания зарегистрированного файла SWC с помощью программы MIPAV. В этом разделе необходимо следующие файлы: рекомбинировавши стека изображений (.ids) со стадии 3.3, точка отсчета файла (.csv), начиная с шага 4.2 и аксонов файл трассировки нити (.iv) с шага 4.1.

1. Выберите Меню: Плагины / Generic / DrosophilaStandardColumnRegistration. Окно "DrosophilaStandardColumnRegistration v6.6.1" появится.
2. Загрузите файлы изображений (.ids), то опорные точки файлов (CSV), а файл нити (.iv).
3. Выберите 9 точек на один слой.
4. Выберите положение изображаемого нейроне (LV / RD или RV / LD).
5. Выберите "Жесткая Регистрацияна и TPS "и" жесткой "Регистрация в нелинейной и регистрации твердого тела, соответственно.
6. Установите флажок "Создать SWC файл" для создания следующих выходных файлов: зарегистрированный аксонов файл трассировки в МЖК формате (см конкретные материалы / Оборудование для определения), зарегистрированный файл IV (.iv), координаты стандартизированной нейритов (.txt), преобразованные координаты (.txt) и комбинированное изображение (.ids).
7. Измените имя файла SWC. Применить сокращение местоположения до конца имени файла (шаг 1.7). Например, используйте "Tm20_3_RV.swc» для TM20 нейрон № 3, расположенной в вентральной половине правого продолговатого мозга.

6. Стандартизация в правой вентральной Конфигурация

Примечание: Этот шаг заключается в преобразовании аксонов следы (в формате SWC) в стандартной конфигурации RV (правой вентральной) с помощью пользовательского сценария "RV_standardization.m." Здесь, сценарий был написан в матрицу лаборатории языка.Имена файлов SWC ввода должны быть в следующем формате: "NeuronName _ _ Номер конфигурации .swc" (например, Tm20_3_LV.swc).

1. Откройте "RV_standardization.m" сценарий.
2. Измените следующие параметры в разделе «ввод данных пользователем":
   1. Введите имена нейронов без нумерации (например, ТМ2, TM20 и т.д.) в "neuron_names."
      Примечание: по умолчанию в "file_end_in" является "_ * МЖК,.", Который ищет файлы с именами, содержащими ( "*" является подстановочным соответствие с любым количеством символов) "_ * МЖК.". По умолчанию "swc_file_end_out" является "_f.swc", который добавит "_F" в конце имени файла после стандартизации.
   2. Укажите каталог, в котором МЖК файлы находятся в "directory_in". Укажите каталог, в котором стандартизованные файлы будут идти в "directory_swcout".
3. Запуск сценария.
4. Оptional: Используйте Vaa3D ¹⁴ визуализировать SWC файлы и проверять преобразование.

7. Вычислить дендритных ветвлений и нагрузочного Частоты

Примечание: Этот шаг использует жесткое тело зарегистрировано SWC файлы для расчета оценок Каплана-Мейера для вероятности того, что дендритные сегмент достигнет заданной длины, не выключая. Этот скрипт использует два Dendritic_Tree_Toolbox функции: extractDendriticSegmentLengthDistribution и estimateDendriticSegmentLengthProbability.

1. Откройте "Branch_term_P.m" сценарий.
2. Измените следующие параметры в разделе «ввод данных пользователем":
   1. Укажите путь к жесткому тела зарегистрированных SWC файлов в "pathToSWCFiles" (например, / Rigid_Registered_swc /). Укажите путь, который будет содержать вывод графики в "pathToOutput." Укажите имя нейронов или нервных типов в "neuron_names" (например, Tm2, Tm20 и т.д.).
3. Запуск сценария; выходы оценка кривой Каплана-Мейера для дендритных разветвлений и прекращения.
   Примечание: Необязательно: Примените метод функций облегающие извлечь из Каплана-Мейера оценок метода локального вероятность того, что дендритные сегмент будет отделение или прекратить.

8. Участок распределения слоя конкретной прекращении дендритных Беседки

Примечание: Этот шаг участков распределение дендритных терминалов в разных слоях мозгового вещества в виде гистограммы. Это может быть применен к одному нейрону, группа нейронов или групп нейронов. Скрипт использует функцию extractDistributionAlongAxis из Dendritic_Tree_Toolbox.

1. Откройте "Layer_term.m" сценарий.
2. Измените следующие параметры в разделе «ввод данных пользователем":
   1. Укажите каталог, содержащий нелинейные зарегистрированы SWC файлы в "pathToSWCFiles" (например, / Non_linear_Registered_swc /). Укажите каталог для вывода графики в "pathToOutput." Укажите имя нейронов или нервных типов в "neuron_names" (например, Tm2, TM20 и т.д.).
3. Запуск сценария урока. Выход гистограмма доли конечных узлов в отдельных слоях продолговатого мозга.

9. Участок планарной проекции Направление дендритов

Примечание: Этот шаг участков планарного направления проекции дендритов как полярный сюжет. Скрипт использует функцию extractAngularDistribution из Dendritic_Tree_Toolbox.

1. Откройте сценарий "Planar_proj.m."
2. Измените следующие параметры в разделе «ввод данных пользователем".
   1. Укажите каталог , который содержит нелинейные зарегистрированные SWC файлы в "pathToSWCFiles" (например, / Non_linear_Registered_swc /). Укажите каталог для графического вывода в "pathToOutput." Укажите имянейроны или нервные типы в "neuron_names" (например, Tm2, TM20 и т.д.).
3. Запуск сценария; выход представляет собой полярный график плоских направлений проекции.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Используя методику визуализации двойного просмотра, представленный здесь, муха мозг, содержащий скудно меченые нейроны TM20 изображался в двух ортогональных направлениях. До визуализации, мозг был окрашен с соответствующими первичными и вторичными антителами для виз...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Здесь мы покажем , как образ и анализировать дендритные беседок из продолговатого мозга нейронов дрозофилы. Первая секция, двойного зрения формирования изображения, описывает деконволюции и комбинацию из двух стопок изображений в стек изображений с высоким разрешением. Второй р?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
Huygens Professional	Scientific Volume Imaging	version 16.05	for image deconvolution (https://svi.nl).  commercial software
MIPAV		version 7.3.0	for image recombination and registration (http://mipav.cit.nih.gov/); freeware
MIPAV plugin: PlugInDrosophila RetinalRegistration.class			freeware
MIPAV plugin: PlugInDrosophilaStandard ColumnRegistration.class			freeware
Imaris	Bitplane		for tracing neurites and assigning reference points for image registration (http://www.bitplane.com); commercial software
Vaa3D			for visualizing swc files (https://github.com/Vaa3D/release/releases/); freeware
Matlab	Mathworks	R2014b	for morphometric analysis of dendrites (http://www.mathworks.com); commercial software
Matlab toolbox: TREES1.14		v1.14	for analyzing dendritic morphometric parameters (http://www.treestoolbox.org/download.html); freeware
Matlab toolbox: Dendritic_Tree_Toolbox		v1.0	For calculating morphometric parameters (https://science.nichd.nih.gov/confluence/display/snc/Data+collections+for+imagines+combination+and+standardize+column+registration). Freeware
Name	Company	Catalog number	Comments
Sample files
SWC file definition			http://www.neuronland.org/NLMorphologyConverter/MorphologyFormats/SWC/Spec.html
The codes and sample files for image combination and registration			https://science.nichd.nih.gov/confluence/display/snc/Data+collections+for+imagines+combination+and+standardize+column+registration
Reference point example			https://science.nichd.nih.gov/confluence/download/attachments/117216914/points.csv?version=1&modificationDate= 1471880596000&api=v2
Name	Company	Catalog number	Comments
Computer system
MS Windows Windows 7 x64 or Macintosh OS X 10.7 or later			3GHz 64-bit quad-core processor, 16G RAM (minimal)
Optional: Quadro4000  (or above) graphic card	Nvidia		for stereographic visualization of dendrites.
Optional: NVIDIA 3D vision2	Nvidia		http://www.nvidia.com/object/3d-vision-main.html
Optional: 120 Hz LCD display for NVIDIA 3D vision2			http://www.nvidia.com/object/3d-vision-system-requirements.html
Name	Company	Catalog number	Comments
Reagents for imaging
24B10 antibody	The Developmental Studies Hybridoma Bank	24B10
GFP Tag Antibody	Thermofisher Scientific	G10362
Goat anti-Rabbit (H+L), Alexa Fluor 488	Thermofisher Scientific	A11034
Goat anti-Mouse (H+L), Alexa Fluor 568	Thermofisher Scientific	A21124
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1000
Mounting Clay	Fisher	S04179
70% glycerol in 1x PBS
Cover glasses, high performance, D = 0.17 mm	Zeiss	474030-9000-000