열 및 레이어에 수지상 형태학 분석

요약

여기, 우리는 열 및 레이어 초파리 수질 신경 세포의 수지상 라우팅을 분석하는 방법을 보여줍니다. 워크 플로우는 추적 기준 열 배열 수지상 아버를 등록하기위한 3 차원 공간에서 수지상 구조를 분석하기위한 이미지 품질과 연산 툴을 개선하기 위해 이중 - 뷰 영상 법을 포함한다.

초록

이러한 플라이 눈 돌출부와 척추 피질과 같은 중추 신경계의 여러 영역에서 시냅스 회로 개발 동물 개발 및 정보 처리 동안 뇌 배선을 용이하게하는 층과 열이 구성되어있다. 특정 레이어 유형 특정 패턴의 정교한 수상 돌기 시냅스 후 뉴런은 적절한 시냅스 터미널 시냅스합니다. 플라이 수질의 neuropil 10 층과 약 750 컬럼으로 구성되어; 각 열은 유형 특정 방식으로 구 심성의 일부 7 종류의 축삭 단자와 일치 수질 뉴런의 38 이상 종류의 수상 돌기에 의해 신경 지배된다. 이 보고서는 이미지의 절차를 자세히 설명하고 수질 뉴런의 수상 돌기를 분석 할 수 있습니다. 워크 플로우는 세 부분으로 포함한다 : (I) 듀얼 뷰 촬상 부는 돌기 고해상도 3D 이미지에 직교하는 방향에서 수집 개의 공 초점 화상 스택을 결합하는 단계; (ⅱ) 수상 돌기는 추적 및 등록 섹션은 수지상를 추적3D의 아버와 기준 열 배열 수지상 트레이스 레지스터; (ⅲ) 수지상 분석 부는 수지상 정자 층 특정 종단 및 평면 투영 방향을 포함하여 열 및 층에 대하여 돌기 패턴을 분석하고, 수지상 분지와 종단의 주파수 추정치를 유도한다. 프로토콜은 매트릭스 실험실 언어의 오픈 소스 MIPAV (의료 영상 처리, 분석 및 시각화) 플랫폼 및 사용자 정의 도구 상자에 내장 된 사용자 정의 플러그인을 사용한다. 함께, 이러한 프로토콜은 세포 유형을 확인하고, 돌연변이 체의 결함을 결정하기 위해, 레이어 및 열들 초파리 수질 뉴런의 수지상 경로를 분석하는 전체 워크 플로우를 제공한다.

서문

개발하는 동안, 복잡하지만 틀에 박힌 분기 패턴에 신경 정교한 수상 돌기들은 시냅스 파트너와 시냅스를 형성한다. 수지상 분기 패턴은 신경 정체성과 기능의 상관 관계. 수지상 복잡성 및 필드 크기는 입력 된 숫자를 관리하면서 수지상 분지 아버의 위치는, 그들이받는 시냅스 입력의 종류를 결정한다. 따라서, 수지상 형태 학적 특성은 시냅스 연결 및 신경 계산을위한 중요한 결정이다. 이러한 비행 광학 로브와 척추 동물의 망막과 같은 복잡한 뇌의 많은 지역에서 시냅스 회로는 정보 처리 ^{(1), (2)를} 용이하게하기 위해 열과 층으로 구성되어 있습니다. 이러한 열과 층 조직에서는 뚜렷한 양상 프로젝트 축삭의 시냅스 전 뉴런 특정 층 (소위 계층 특정 타겟팅)에서 종료하고 규칙적인 2 차원 배열을 형성하는 (소위 칼레D 지형도), 시냅스 후 뉴런이 특정 계층에 적절한 크기의 돌기를 확장하면서 정확한 종류와 숫자의 시냅스 입력을받을 수 있습니다. 층 및 컬럼에 타겟팅 축삭 잘 ^3,4-를 연구 하였지만, 훨씬는 덴 드라이트가 특정 계층에 전달하고 올바른 연접 파트너 ⁵ 시냅스 연결을 형성하는 수용 필드를 적절히 확장 크기 방법에 대해 공지되어있다. 이미징 및 층과 열을 대상으로 정량화 수지상의 어려움은 기둥과 적층 뇌 구조에서 수지상 개발의 연구를 방해하고있다.

초파리 수질 신경 세포는 열 및 레이어 수상 라우팅 및 회로 어셈블리를 공부에 이상적인 모델이다. 플라이 수질의 neuropil는 3D 10 층의 격자 약 750 열로 구성되어있다. 각 열은 페이지를 포함하여 구 심성의 집합에 의해 신경 지배한다그 축삭 터미널 계층 별 패션 ^(6)의 지형도를 형성 L5 - hotoreceptors R7 / R8과 얇은 신경 L1. 수질 신경 세포의 약 38 종류가이 구 심성 ^(7)로부터 입력을받을 때마다 수질 항목과 특정 계층에 적절한 필드 크기와 정교한 수상 돌기에 존재한다. 수질의 시냅스 회로는 전자 현미경 수준에서 재구성되었다; 따라서, 시냅스 협력이 잘 ^{8 7} 설정됩니다. 또한, 수질 신경의 여러 유형의 레이블을 유전 도구 ^{9, 10, 11} 가능하다. transmedulla의 세 가지 유형 (TM) 뉴런 (TM2, TM9 및 Tm20)를 검사하여, 우리는 이전에 두 개의 세포 형 특정 수지상 특성을 확인했다 (ⅰ) Tm은 뉴런이 중 전방 또는 후방 방향으로 돌기 프로젝트를 (평면 PROJection 방향) 상기 세포 유형에 따라 및 (ii)의 수질 신경 돌기가 셀 타입 별 패션 (계층 별 종단) ^(12)에 특정 수질 레이어 종료. 층 및 열 단서 Tm은 반응을 방해 돌연변이가 이러한 속성의 독특한 측면에 영향을 미치는 반면, 평면 형상 돌기 방향과 레이어 별 종단은, Tm은 뉴런의 세 가지 유형을 구별하기에 충분하다.

여기, 우리는 열 및 레이어 (그림 1)에서 초파리 수질 신경 세포의 수지상 패턴을 조사하기위한 완벽한 워크 플로우를 제시한다. 첫째, 두 개의 공 초점 화상을 결합하는 맞춤형 소프트웨어를 사용하는 듀얼 뷰 촬상 방법은 고품질의 이미지를 생성 등방성 스택을 나타낸다. 이 방법은, 초 - 해상도 현미경에 의존하지 않고, 수지상 분기 안정적인 추적을 허용 고품질 이미지를 생성하는데 전용 종래 공 초점 현미경을 필요 이러한의 STED (유도 방출 고갈) 또는 구조적 조명. 둘째, 수지상 아버 트레이싱 및 기준 컬럼 배열 얻어진 돌기 추적을 등록하기위한 방법을 제시한다. 셋째, 수지상 분지와 종단 주파수에 대한 추정치를 유도뿐만 아니라, 평면 형상 돌기 방향과 수지상 층 특정 종단에 대한 정보를 추출하기위한 계산 방법을 나타낸다. 함께, 이러한 방법들은 3D 수지상 모폴로지에 기초하여 세포 형태의 분류에 돌기 패턴의 특성과 돌연변이의 잠재적 결함의 식별을 허용한다.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

프로토콜

주 : 듀얼 뷰 영상 (섹션 1-3), 수지상 추적 및 등록 (섹션 4-6)와 수지상 분석 (섹션 7-9) (그림 1) : 프로토콜은 세 개의 섹션이 포함되어 있습니다. 코드 및 예제 파일은 재료 / 장비의 표에 나와 있습니다.

1. 듀얼 이미지 획득

참고 :이 단계는 두 개의 직교 (수평 및 정면) 방향에 관심있는 신경 세포의 두 이미지 스택을 취득하도록 설계되었습니다.

1. 띄엄 띄엄 수질 신경 세포를 표지 포함 플라이 두뇌를 준비합니다 (~ 10 셀 / 뇌 엽) 막 GFP 마커 (mCD8GFP)와 같은 이전 ^{12 설명했다.} 전술 한 바와 같이, (골수 신경 세포의 수상 돌기에 대한) 토끼 방지 GFP 및 (광 수용체 축삭의 경우) 마우스 mAb24B10, 일차 항체, 형광 이차 항체 (알렉사 488 안티 - 토끼와 알렉사 568 항 마우스 항체)와 뇌를 얼룩13. 1X PBS에 70 % 글리세롤의 뇌를 취소합니다.
2. 수평 방향으로 뇌 마운트 (도 2A를, B), 슬라이드의 중심에 antifade 설치 매체의 20 μL 드롭에 글리세롤 삭제 플라이 뇌를 전송합니다.
3. 설치하는 동안 뇌 샘플을 분쇄에서 커버 슬립을 방지하기 위해 커버 슬립의 네 모서리에 점토의 작은 패치를 부착합니다.
   주 : 점토 패치 시료를 분쇄에서 커버 슬립을 방지하는 완충재를 제공한다. 각 클레이 패치는 직경이 약 1mm해야합니다.
4. 해부 현미경, 복부 업 위치에 머리를 놓고 두뇌를 확보하기 위해 상단에 커버 슬립을 배치합니다. 뇌 샘플 (그림 2A)의 방향을 확인하는 랜드 마크로서 뇌의 볼록 등의 표면을 사용합니다.
5. 공 초점 현미경으로 첫 번째 이미지 스택 (가로보기)를 얻습니다. 이러한 63X 1.3 NA 글리세롤이나 기름 침지 OBJE로 (높은 NA 대물 렌즈를 사용하여이 뽑은 렌즈) 및 2.5 배 디지털 줌 (픽셀 크기는 픽셀 당 0.105 μm의이며, 평균 수) 2입니다. 0.2 ㎛의 스텝 크기와 수질의 neuropil을 충당하기 위해 180 개 이상의 광학 부 (512 X 512 픽셀)를 취득.
6. 단계 1.3에 설명 된대로 뇌를 다시 마운트 - 1.4 만, 전방 접속 위치 (정면보기)에서 머리를 맞 춥니 다.
7. 단계 1.5에 기재된 바와 같이, 동일한 뉴런의 제 2 화상 스택 (정면도)를 취득.
   참고 : 광학 엽에 표시된 수많은 신경 세포가있을 때 동일한 뉴런을 찾는 것은 어려울 수 있습니다. 양쪽 방향에서 같은 신경 세포를 식별하기 위해 두보기에서 낮은 배율 이미지 스택 (예를 들어, 0.7의 줌, 저해상도 화상 스택을 획득 0.45 ㎛의 스텝 크기를 사용하여) 요구 될 수도있다. 512 X 512보다 큰 이미지는 이미지는 이미지 조합하기 전에 512 X 512립니다되어야하고, 큰 필드 이미징 동안 픽셀 크기는 픽셀 당 0.105 μm의에 보관해야합니다. 신호의 손실깊은 조직을위한 잠재적 인 문제이다. 신호가 약한 이미지 뇌의 배쪽 절반 인 경우. 스캔 중에 광표백을 줄이고 가능한 한 낮은 레이저 파워를 사용한다. 이미지 스택을 취득하기 전에 과다 노출 확인하기 위해 범위 표시기를 사용합니다. 가능하면 하나로 이루어질 탐지기가 장착 된 공 초점 현미경을 사용합니다.
8. 식별 및 수질의 neuropil (좌 / 우 [R / L]과 지느러미 / 복부 [D / V])에 대한 관심의 신경 세포의 위치를 ​​기록합니다. 샘플 화상 스택을 조사하여 이미지 획득 동안 이동하는지 확인.
   참고 : 샘플 이동은 종종 부적절한 장착 때문이다. 시료의 이동이 발생하면, 화상 스택은 등록을 위해 사용될 수없고 폐기되어야한다. 샘플을 다시 장착 동일한 뉴런으로부터 화상 ​​스택을 획득.

2. 이미지 역대 합

참고 : 디컨 볼 루션 단계는 흐리게에 의해 분해되어 획득 된 영상을 복원 이미지 디컨 볼 루션 소프트웨어를 사용소음. 이 단계는 선택적이지만, 현저히 화상 품질을 향상시킨다. 3 절에 이미지 등록 및 조합에 대한 deconvolved 이미지 스택을 사용하는 것이 좋습니다.

1. 대화 형 모드에서 디컨 볼 루션 프로그램을 시작합니다. 메인 창에 파일 / 열기 (또는 Ctrl-O) : 메뉴를 선택하여 (LSM 또는 특정 현미경 형식) 이미지 스택을로드합니다.
2. 이미지 작업 창을 엽니 다 옵스 :로드 된 이미지 스택을 선택하고 메뉴를 선택하려면 클릭합니다. 기본 클래식 최대 우도 추정 (CMLE) 알고리즘을 사용합니다.
3. 이미지 작업 창에서 "매개 변수"탭을 클릭합니다. (. 등, 예를 들면, 침지 오일 (). 예를 들면, 오일, 글리세린 등) 매체를 삽입 렌즈 액침 매체에 대한 적절한 파라미터를 입력하고, 개구 수 (NA, 여기서, 1.3을 사용 하였다). 제대로 이미징 조건을 반영하고 있는지 확인 나머지 매개 변수를 확인하십시오. 지느러미하기 위해 "모든 검증 설정"탭을 클릭합니다파라미터 설정 ALIZE.
4. 이미지 작업 창에서 "작업"탭을 클릭합니다. 출력 처를 지정 (예를 들면, c). "채널 별 신호 / 노이즈"(기본 설정은 "20 20 20 20"동안 예 : "12 12 12 12"좋은 출발점입니다)에서 해당 번호를 입력합니다. 나머지 매개 변수에 대한 기본 설정을 사용합니다.
5. 이미지 스택을 deconvoluting 시작 "실행 명령"탭을 클릭; 이 과정은 컴퓨터에 따라 완료하는 데 수십 분까지 걸릴 수 있습니다.
6. 주 창에서 클릭하고 deconvolved 이미지 스택을 선택합니다. 메뉴를 선택하십시오 ICS 이미지 파일 형식 (.ics 인 및 .ids)에 deconvolved 이미지를 저장으로 저장합니다.
   참고 : 각각의 이미지 스택은 두 개의 파일이 있습니다 ICS를 파일 헤더 정보를 포함하고 식별자 파일은 원시 이미지 정보가 포함되어 있습니다.
   1. 촬상 방향에 따른 화상 스택 파일의 이름을 변경 (예를 들어, 가로보기 이미지의 이름침 H.ids 및 H.ics과 정면 뷰 이미지 스택 F.ids 및 F.ics).

3. 듀얼 뷰 이미지 조합

주의 :이 단계는 두 이미지가 MIPAV 소프트웨어를 사용하여 고해상도 3D 이미지를 생성하도록 스택을 결합한다.

1. 영상 합성에 대한 매트릭스를 생성하는 단계를 포함한다.
   1. MIPAV 프로그램을 시작합니다. 메뉴를 선택하여 H와 F 이미지 스택을로드 : 디스크 (또는 Ctrl-F) /H.ids 및 F.ids에서 파일 / 이미지 열기 (A)를; 창은 두 개의 이미지를 표시합니다.
   2. 이미지를 클릭하여 H 이미지를 선택하고 메뉴를 선택 유틸리티 / 변환 도구 / RGB / 회색; 창은 GrayG, GrayB 및 GrayR 이미지를 표시합니다.
   3. 닫기 GrayR 및 GrayB 만 창에 GrayG을 유지.
   4. 이미지를 클릭하여 F 이미지를 선택하고 메뉴를 선택 유틸리티 / 변환 도구 / RGB / 회색입니다. 창은 GrayG1, GrayB1 및 GrayR1 이미지를 표시합니다.
   5. GrayR1 및 GrayB1 닫고 창에서만 GrayG1을 유지합니다. 이 단계 만 할머니에서AYG 및 GrayG1 창에 있습니다.
   6. 메뉴 선택 GrayG (강조)를 선택 알고리즘 / 등록 / 최적화 된 자동 이미지 등록; 은 "최적화 된 자동 이미지 등록 3D"대화 상자가 나타납니다.
      1. 입력 옵션에서에 "특정 재조정-9."기본 "아핀-12"에서 "자유도"로 변경 "미세에, 3 :은"거친 각도 증가 "10 (15도 기본값) :"회전 수, "는"회전 각도 샘플링 범위 "에 105 -105의 키 (-30 ~ 30도 기본값)에서 각도 증가 "(기본값 : 6도).
   7. 확인을 클릭; 첫 번째 매트릭스 "GrayG_To_GrayG1.mtx은"생성 및 이미지 폴더에 저장됩니다. 모든 이미지 창을 닫고 다음 단계로 진행; 이 단계는 적어도 15 분 소요됩니다.
   8. 선택 메뉴로 H와 F 이미지 스택을로드 : 디스크 (또는 Ctrl-F) /H.ids 및 F.ids에서 파일 / 이미지 열기 (A)를 단계 3.1.1에서와 같이.
   9. 이미지를 클릭하여 H 이미지를 선택하고 메뉴를 선택 유틸리티 / 변환 도구 / RGB / 회색; 은 "RGB-> 그레이"대화 상자가 나타납니다. 확인을 클릭; 창은 "HGray"이미지를 표시합니다. HGray을 유지하고 H 이미지를 닫습니다.
   10. 은 F 이미지의 단계를 반복 3.1.9; 은 "FGray"이미지가 화면에 표시됩니다. FGray을 유지하고 F 이미지를 닫습니다; 만 HGray 및 FGray 창에 남아있을 것입니다.
   11. HGray 이미지 (하이라이트)를 선택하고 메뉴로 이동합니다 알고리즘 / 변환 도구 / 변환. 은 "/ 리 샘플 이미지를 변환"대화 상자가 나타납니다. 은 "리 샘플"탭을 클릭하고 "FGray"를 "HGray"의 크기로 재 샘플을 변경합니다. 다음으로, 선택하여 "변환"탭 및로드 "GrayG_To_GrayG1.mtx를"클릭 "파일에서 읽기 행렬을." 확인을 클릭; 창은 HGray_transform 이미지를 표시합니다. HGray_transform 및 FGray 그렇게 만이 창에 남아있는 HGray 이미지를 닫습니다.
   12. 은 "HGray_transform & #을 선택(34); 이미지 (하이라이트) 및 메뉴 이동 : 알고리즘 / 등록 / 최적화 된 자동 이미지 등록. 은 "최적화 된 자동 이미지 등록 3D"대화 상자가 나타납니다. 에서 "회전 수"에서 -5 (기본값 : -30 ~ 30도)은 "회전 각도 샘플링 범위"5 열쇠 : "미세, 그리고 1은"거친 각도 증가 "3 (15도 기본값) 각도 증가 "(기본값 : 6도). 확인을 클릭합니다.
       참고 : 아핀 매트릭스 (HGray_transform_To_FGray.mtx)를 생성하고 창에 표시됩니다 이미지 폴더와 "HGray_Transform_register"이미지에 저장됩니다. 이 단계는 적어도 40 분 소요됩니다.
   13. 은 "HGray_transform"이미지를 닫습니다; 전용 "HGray_Transform_register"와 "FGray는"창에 남아 있어야합니다.
   14. 은 "HGray_Transform_register"이미지 (하이라이트)를 선택하고 메뉴로 이동합니다 알고리즘 / 등록 / B 스플라인 자동 등록 2D / 3D를. 은 "B-스플라인 자동 등록 용에-3D 강도 "대화 상자가. 팝업 선택합니다"비용 함수의 최소 제곱을 "(기본값은 상관 관계 비율이다).
       1. "두 단계를 수행하여 등록"을 클릭합니다. 패스 1 섹션에서에 2의 키에 10 (기본값은 1) 및 키 "그라데이션 하강 단계 사이즈 (샘플 단위)을 최소화", "반복의 최대 수"(기본값은 10). 패스이 섹션에서에 1 키로 2 (기본값은 0.5) 및 키 "그라데이션 하강 단계 사이즈 (샘플 단위)을 최소화", "반복의 최대 수"(기본값은 10).
          참고 : NLT 행렬, "HGray_transform_register.nlt은"이미지 폴더에 저장하고 "HGray_transform_register_registered"이미지가 화면에 표시됩니다. 이 단계는 적어도 5 분 소요됩니다.
   15. 창에 모든 이미지를 닫습니다.
2. 영상 합성에 대한 참조 영상을 생성하는 단계를 포함한다.
   참고 :이 단계는 GENER하는 것을 의미한다조합에 대한 등록 된 가로 이미지를 먹었다.
   1. 메뉴를 선택하여로드 H와 F 이미지 스택 : 디스크 (또는 Ctrl-F) /H.ids 및 F.ids에서 파일 / 이미지 열기 (A)를; 두 개의 이미지 창에 표시됩니다.
   2. 가 H 이미지 (하이라이트)를 선택하고 메뉴로 이동합니다 알고리즘 / 변환 도구 / 변환; 은 "/ 리 샘플 이미지를 변환"대화 상자가 나타납니다. 은 "리 샘플"탭을 클릭하고 "F."를 "H"의 크기에서 재 샘플을 변경 다음으로, 선택하여 "변환"탭 및로드 "GrayG_To_GrayG1.mtx를"클릭 "파일에서 매트릭스를 참조하십시오." 확인을 클릭; H_transform 이미지가 화면에 표시됩니다. 가 H 이미지를 닫습니다하지만 창에 H_transform와 F를 유지합니다.
   3. 은 "H_transform"이미지 (하이라이트)를 선택하고 메뉴로 이동합니다 알고리즘 / 변환 도구 / 변환; 은 "/ 리 샘플 이미지를 변환"대화 상자가 나타납니다. 은 "리 샘플"탭을 클릭하고 "F. & #을"H_transform "의 크기에서 재 샘플을 변경(34); 다음으로, 선택하여 "변환"탭 및로드 "HGray_transform_To_FGray.mtx를"클릭 "파일에서 매트릭스를 참조하십시오." 확인을 클릭; 은 "H_transform_transform"이미지가 화면에 표시됩니다. H_transform 이미지를 닫습니다; 이 점에서, 단지 H_transform_transform 및 F 창에 남아있을 것이다.
   4. 은 "H_transform_transform"이미지 (하이라이트)를 선택하고 메뉴로 이동합니다 알고리즘 / 변환 도구 / 비선형 변환; 은 "비선형 B-스플라인 변환"대화 상자가 나타납니다. 다음,로드 "HGray_transform_register.nlt는"하고 확인을 클릭합니다; 은 "H_transform_transform_registered"이미지가 화면에 표시됩니다. 이 ICS 파일로 이미지를 저장합니다. 창에 모든 이미지를 닫습니다.
3. 화상 스택 결합
   주의 :이 단계는 하나의 고해상도 스택에 직교하는 방향 (수평 방향 및 정면)에서 취득한 화상 개의 스택을 결합하는 것이다.
   1. 메뉴로 이동 플러그인 / 일반 / 초파리 망막 등록istrationl; 은 "초파리 망막 등록 V2.9"대화 상자가 나타납니다. (이미지 H-등록 변환 한 - 녹색의 단계 3.1.7에서 "GrayG_To_GrayG1.mtx"이미지 F에서 "F.ics"의 단계 3.2.4에서 옵션 이미지 H, "H_transform_transform_registered"에서 "H.ics"를 업로드 ) "HGray_transform_To_FGray.mtx"변환의 단계 3.1.14에서 변환 2 아핀 단계 3.1.12 및 "HGray_transform_register.nlt"3 - 비선형 (옵션).
      1. SQRT (강도-H X 강도-F) 및 "F.을 재조정 H"없음 재조정을 선택 나머지 매개 변수에 대한 기본 옵션을 유지합니다. 확인을 클릭; 이 단계는 약 3 분 소요됩니다.
         참고 : 처리 한 후, 이미지의 3 세트가 생성됩니다 combinedImage_sqrRt_trilinear_norescale_ignoreBG.ids (최종 재결합 이미지), greenChannelsImage - Gxreg-Gy를-Gcomp.IDS (H, F 녹색 채널, 최종 재결합 이미지), 및 redChannelsImage- Rxreg-Ry가-Rcomp.ids (FO 빨강 채널R H, F, 최종 이미지 재조합); 모든 출력 파일은 512 X 512 X 512 크기가 조정됩니다.
   2. 이미지 시각화 소프트웨어에서 열기 "combinedImage_sqrRt_trilinear_norescale_ignoreBG.ids". 는 IMS 형식의 이미지 스택을 저장하고 파일 이름을 변경; 이 재조합 된 이미지 파일 돌기 추적 및 등록에 사용한다.

4. 신경 돌기 추적 및 참조 포인트 지정

참고 :이 단계는 이미지 시각화 소프트웨어를 사용하여 신경 돌기 (4.1) 추적 및 등록 (4.2)에 대한 기준점을 지정하는 것입니다.

1. 신경 돌기를 추적
   1. 이미지 시각화 소프트웨어를 시작합니다. 재조합 된 이미지 파일을 엽니 다. 메뉴로 이동 편집 /보기 표시 조정 및 광 수용체 채널 (빨간색)를 끄십시오.
   2. "능가"모드에서 이미지를 시각화합니다. "스테레오"켜고 컴퓨터 당량 경우 3D 이미지를 시각화하기 위해 "쿼드 버퍼"모드를 사용stereograph 시스템 uipped.
   3. 메뉴로 이동 새로운 필라멘트를 추가 / 필라멘트를 능가. 탭을 "자동 생성을 건너 뛰기 수동으로 편집"를 클릭합니다.
   4. 은 "그리기"탭을 클릭하고 "AutoDepth을."
   5. "설정"더 나은 시각화를 위해 적절한 화소 수의 "선"과 키를 확인 선택 (4 픽셀 라인은이 프로토콜에 사용된다). "연락처보기 Dendrites에서", "시작 포인트"및 "분기 포인트"를 확인합니다. 설정 100 % "품질 렌더링".
   6. 은 "그리기"탭을 선택하고 신경 돌기를 추적을 시작합니다. 축삭 시작하고 수상 돌기 (그림 2D)로 이동합니다. 축삭과 transmedulla 뉴런의 수상 돌기는 구별하기 쉽다.
      주 : Tm은 신경 세포는 세포체로부터 축색 돌기를 확장하고, 더 높은 시각 처리 센터로 lobula를 모든 방법을 프로젝트. 시스템은 자동 축삭으로서 제 1 긴 필라멘트 나머지 짧은 필라멘트 등을 정의 할수상 돌기. 추적 중에 필라멘트 (축삭)의 시작 부분에 시작점을 유지하고 추적 신경 돌기가 연결되어 있는지 확인합니다. 분기 지점과 시작점을 검사합니다. 수상 돌기가 연결되지 않은 경우, 새로운 시작 포인트는 비 연결된 필라멘트를 정의한다.
   7. 추적 후 위로 "설정", "시작 지점"과 "분기 포인트를,"취소하고 메뉴로 이동합니다 / 내보내기 선택한 객체를 ../ 능가. 발명가 파일로 필라멘트를 저장 (* .iv).
2. 참조 점을 지정
   1. "연락처보기 표시 조정"을 선택하고 두 영상 채널을 켭니다. 이 예에서, 채널 1이 감광체 염색하고 채널 2 Tm20 뉴런 (GFP)이다.
   2. 메뉴로 이동 / 측정을 능가. "편집"탭을 선택하고 "특정 채널 :"(광 수용체 채널 [레드]를 선택합니다).
   3. 최상위 계층에 대한 기준 포인트를 할당한다. 메뉴로 이동 / 능가 / 측정 포이국세청은 새로운 측정 포인트를 만들 수 있습니다. 상부층과 M1 층의 시작을 표시합니다. 다음과 같이 점의 순서는 다음과 같습니다 전방 - 복부, 적도 전방-적도, 전방, 복부, 후방 - 복부, 후방, 후방 - 적도, 그리고 센터 (그림 3 층); 가장 수지상 프로세스와 연관된 하나 중앙 감광체를 정의한다.
   4. 단계 4.2.3 (그림 3G)에서와 R8과 R7 층을 할당합니다. 세 가지 개별 측정 포인트는 단계 4.2.3과 4.2.4에서 작성해야합니다.
   5. 각 층의 점의 좌표를 보냅니다. ""자세한 "특정 값"및 "위치를 선택"통계 "탭을 클릭합니다;" 그리고 "파일로 탭 표시에 수출 통계"를 클릭하십시오. "쉼표로 구분 된 값"으로 저장 (* .csv)로.
   6. (일을하고 복사 및 붙여 넣기하여 새 CSV 파일로 (27) 기준점의 좌표를 결합 - (4.2.4 단계 4.2.3에서) 세 CSV 파일을 엽니 다전자 순서는 맨, R8, 및 R7)입니다. 재료 / 장비의 표를 참조 예제 파일의 형식을 따릅니다.

5. 강성 바디와 TPS 비선형 등록

주의 :이 단계는 상기 기준 열 배열 (IV 형식) 돌기 트레이스를 등록하고 MIPAV 프로그램을 이용하여 등록 된 SWC 파일을 생성하는 것이다. 이 절에는 다음 파일이 필요합니다 단계 3.3에서 재결합 이미지 스택 (.ids)를, 단계 4.2에서 참조 점 파일 (.csv)로하고, 신경 돌기 추적 필라멘트 파일 (.iv) 단계 4.1.

1. 메뉴로 이동 플러그인 / 일반이 / DrosophilaStandardColumnRegistration. 은 "DrosophilaStandardColumnRegistration의 v6.6.1"창이 나타납니다.
2. 이미지 파일 (.ids) 기준점 파일 (.CSV) 및 필라멘트 파일을로드 (.iv).
3. 층마다 9 점을 선택합니다.
4. 영상화 된 신경 세포 (LV / RD 또는 RV / LD)의 위치를 ​​선택합니다.
5. 선택 "강성 등록 용및 TPS "와"각각 비선형 및 강체 등록에 강성 등록 "에.
6. 다음과 같은 출력 파일을 생성하는 "SWC 파일 만들기"를 체크 : (.iv) SWC 형식으로 등록 된 신경 돌기의 추적 파일 (정의에 대한 특정 자재 / 장비 참조), 등록 IV 파일을 표준화 된 신경 돌기 (.txt)로 좌표, 변환 된 좌표 (.txt)로하고, 결합 된 이미지 (.ids).
7. SWC 파일의 이름을 변경합니다. 파일명 (단계 1.7)의 단부에 위치 약어를 적용한다. 예를 들어, 오른쪽 수질의 복부 반에있는 Tm20 신경 # 3 "Tm20_3_RV.swc"를 사용합니다.

마우스 오른쪽 복부 구성 6. 표준화

참고 :이 단계는 사용자 정의 스크립트를 사용하여 표준 RV (오른쪽 복부) 구성 (SWC 형식) 신경 돌기의 흔적을 변환하는 것입니다 "RV_standardization.m." 여기서, 스크립트는 매트릭스 실험실 언어로 작성 하였다. 그만큼입력 SWC 파일의 이름은 다음과 같은 형식이어야합니다 : "NeuronName _ 수 _ 구성 .swc"(예를 들어, Tm20_3_LV.swc).

1. 은 "RV_standardization.m"스크립트를 엽니 다.
2. "사용자 입력"절에서 다음 매개 변수를 편집합니다
   1. 에 (예를 들어, TM2, Tm20 등) 번호없이 뉴런의 이름을 입력합니다 "neuron_names."
      참고 : "file_end_in"의 기본은 이름이 함유 파일을 찾습니다. "_ * SWC,"입니다 ( "*"문자의 번호와 일치하는 와일드 카드) "_ * SWC.". "swc_file_end_out"의 기본은 표준화 한 후 파일 이름의 끝에 "_f"를 추가합니다 "_f.swc,"입니다.
   2. SWC 파일 "directory_in"에있는 디렉토리를 지정합니다. 표준화 된 파일이 "directory_swcout"갈 디렉토리를 지정합니다.
3. 스크립트를 실행합니다.
4. 영형의 선택적인 : 사용 Vaa3D ^(14)는 SWC 파일을 시각화하고 변환을 확인합니다.

7. 계산 수지상 분기 및 종단 주파수

참고 :이 단계는 강체는 수지상 세그먼트가 종료하지 않고 주어진 길이에 도달 할 가능성에 대한 카플란 - 마이어 추정기를 계산하는 SWC 파일을 등록합니다. extractDendriticSegmentLengthDistribution 및 estimateDendriticSegmentLengthProbability :이 스크립트는 두 Dendritic_Tree_Toolbox 기능을 사용합니다.

1. 은 "Branch_term_P.m"스크립트를 엽니 다.
2. "사용자 입력"절에서 다음 매개 변수를 편집합니다
   1. "pathToSWCFiles"의 강체 등록 SWC 파일의 경로를 지정합니다 (예를 들어, / Rigid_Registered_swc /). 의 그래픽 출력을 보유 할 경로 지정 "pathToOutput을." 뉴런 또는 "neuron_names"에 신경 유형의 이름을 지정 (예를 들어, TM2, Tm은20 등).
3. 스크립트를 실행; 출력은 수지상 분기 및 종료에 대한 카플란 - 마이어 추정 곡선이다.
   참고 : 선택 사항 : 카플란 - 마이어는 수상 부문은 분기 또는 종료됩니다 로컬 확률 추정기에서 추출 할 수있는 기능 맞는 방법을 적용합니다.

8. 플롯 돌기 아버의 계층 별 해지 배포

주 :이 단계는 막대 그래프로 가지 수질 레이어 수지상 단말의 분포를 나타내는. 이것은 하나의 신경 세포, 신경 세포, 뉴런 또는 그룹의 그룹에 적용 할 수있다. 이 스크립트는 Dendritic_Tree_Toolbox에서 extractDistributionAlongAxis 함수를 사용합니다.

1. 은 "Layer_term.m"스크립트를 엽니 다.
2. "사용자 입력"절에서 다음 매개 변수를 편집합니다
   1. "pathToSWCFiles"에 비선형 등록 된 SWC 파일이 들어있는 디렉토리를 지정합니다 (예를 들어, / Non_linear_Registered_swc /). 그래픽 출력을위한 디렉토리 지정 "pathToOutput을." "neuron_names"(예를 들어, TM2, Tm20 등)의 신경 세포 또는 신경 형식의 이름을 지정합니다.
3. 튜토리얼 스크립트를 실행합니다. 출력은 특정 수질 레이어 단말 노드의 비율의 히스토그램이다.

9. 플롯 Dendrites에서의 평면 프로젝션 방향

주의 :이 단계는 극성 플롯 같은 덴 드라이트의 평면 투영 방향을 나타내는. 이 스크립트는 Dendritic_Tree_Toolbox에서 extractAngularDistribution 함수를 사용합니다.

1. 스크립트 열기 "Planar_proj.m을."
2. "사용자 입력"절에 다음과 같은 매개 변수를 편집합니다.
   1. "pathToSWCFiles"(예를 들어, / Non_linear_Registered_swc /)에서 비선형에게 등록 된 SWC 파일이 들어있는 디렉토리를 지정합니다. 그래픽 출력을위한 디렉토리 지정 "pathToOutput을." 의 이름을 지정뉴런 또는 "neuron_names"(예를 들어, TM2, Tm20 등)에서 신경 유형.
3. 스크립트를 실행; 출력은 평면 투영 방향의 극성 플롯이다.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

결과

여기에 제시된 듀얼 뷰 촬상 절차를 이용하여, 성기 표지 Tm20 뉴런을 포함하는 플라이 뇌 개의 직교 방향에 묘화 하였다. 촬상에 앞서, 뇌 막 닿는 GFP와 감광체 축삭 시각화 적절한 일차 및 이차 항체로 염색 하였다. 이미징 뇌 먼저 가로 방향으로 장착 하였다 (도 2A, B). GFP 표지 Tm20 신경 및 주변 감광 축삭은 공 초점 레이저 주사 현미경 (도 3a)을 사...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

토론

여기, 우리는 어떻게 이미지에와 초파리 수질 뉴런의 수상 돌기 아버 분석을 보여줍니다. 첫번째 섹션 듀얼 뷰 영상은 고해상도 영상 스택에 디컨 볼 루션 두 화상 스택의 조합을 설명한다. 두 번째 섹션, 수지상 추적 및 등록 기준 열 배열에 수질 뉴런의 수상 돌기의 추적 및 등록에 대해 설명합니다. 세 번째 섹션, 수지상 분석, 수지상 패턴을 분석하는 사용자 정의 스크립트의 사용을 설명...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
Huygens Professional	Scientific Volume Imaging	version 16.05	for image deconvolution (https://svi.nl).  commercial software
MIPAV		version 7.3.0	for image recombination and registration (http://mipav.cit.nih.gov/); freeware
MIPAV plugin: PlugInDrosophila RetinalRegistration.class			freeware
MIPAV plugin: PlugInDrosophilaStandard ColumnRegistration.class			freeware
Imaris	Bitplane		for tracing neurites and assigning reference points for image registration (http://www.bitplane.com); commercial software
Vaa3D			for visualizing swc files (https://github.com/Vaa3D/release/releases/); freeware
Matlab	Mathworks	R2014b	for morphometric analysis of dendrites (http://www.mathworks.com); commercial software
Matlab toolbox: TREES1.14		v1.14	for analyzing dendritic morphometric parameters (http://www.treestoolbox.org/download.html); freeware
Matlab toolbox: Dendritic_Tree_Toolbox		v1.0	For calculating morphometric parameters (https://science.nichd.nih.gov/confluence/display/snc/Data+collections+for+imagines+combination+and+standardize+column+registration). Freeware
Name	Company	Catalog number	Comments
Sample files
SWC file definition			http://www.neuronland.org/NLMorphologyConverter/MorphologyFormats/SWC/Spec.html
The codes and sample files for image combination and registration			https://science.nichd.nih.gov/confluence/display/snc/Data+collections+for+imagines+combination+and+standardize+column+registration
Reference point example			https://science.nichd.nih.gov/confluence/download/attachments/117216914/points.csv?version=1&modificationDate= 1471880596000&api=v2
Name	Company	Catalog number	Comments
Computer system
MS Windows Windows 7 x64 or Macintosh OS X 10.7 or later			3GHz 64-bit quad-core processor, 16G RAM (minimal)
Optional: Quadro4000  (or above) graphic card	Nvidia		for stereographic visualization of dendrites.
Optional: NVIDIA 3D vision2	Nvidia		http://www.nvidia.com/object/3d-vision-main.html
Optional: 120 Hz LCD display for NVIDIA 3D vision2			http://www.nvidia.com/object/3d-vision-system-requirements.html
Name	Company	Catalog number	Comments
Reagents for imaging
24B10 antibody	The Developmental Studies Hybridoma Bank	24B10
GFP Tag Antibody	Thermofisher Scientific	G10362
Goat anti-Rabbit (H+L), Alexa Fluor 488	Thermofisher Scientific	A11034
Goat anti-Mouse (H+L), Alexa Fluor 568	Thermofisher Scientific	A21124
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1000
Mounting Clay	Fisher	S04179
70% glycerol in 1x PBS
Cover glasses, high performance, D = 0.17 mm	Zeiss	474030-9000-000