Analisando dendríticas Morfologia em Colunas e Camadas

Resumo

Aqui, mostramos como analisar roteamento dendrítica de neurônios da medula Drosophila em colunas e camadas. O fluxo de trabalho inclui uma técnica de imagem dual-vista a melhorar a qualidade de imagem e ferramentas computacionais para a detecção, registrar mandris dendríticas para a matriz coluna de referência e para analisar as estruturas dendríticas no espaço 3D.

Resumo

Em muitas regiões do sistema nervoso central, tais como os lóbulos óptica da mosca e do córtex vertebrado, circuitos sinápticos são organizados em camadas e colunas para facilitar a conexão cerebral durante o desenvolvimento e processamento da informação nos animais desenvolvidos. neurônios pós-sinápticos dendritos elaborados nos padrões específicos do tipo em camadas específicas para sinapse com terminais pré-sinápticos apropriados. O neurópilo mosca medula é composta de 10 camadas e cerca de 750 colunas; cada coluna é enervado pelo dendritos de mais de 38 tipos de neurônios da medula, que combinam com os terminais axonal de cerca de 7 tipos de aferentes de uma forma específica do tipo. Este relatório detalha os procedimentos para a imagem e analisar dendrites dos neurónios da medula. O fluxo de trabalho inclui três seções: (i) a secção de imagem dual-view combina duas pilhas de imagens confocal coletadas em orientações ortogonais em um de alta resolução de imagem 3D de dendrites; (Ii) a dendrite rastreamento e secção de registo traça dendríticamandris em 3D e registra traços dendríticas para a matriz coluna de referência; (Iii) a secção de análise dendrítica analisa padrões dendríticas em relação às colunas e camadas, incluindo terminação e de projecção planar direcção específica da camada de mandris dendríticas, e obtém estimativas de ramificação e de terminação frequências dendríticas. Os protocolos utilizam plugins personalizados construídos na MIPAV open-source (Medical Imaging processamento, análise e visualização) da plataforma e personalizadas caixas de ferramentas na linguagem laboratório matriz. Juntos, estes protocolos de fornecer um fluxo de trabalho completo para analisar o encaminhamento dendríticas de medula neurónios de Drosophila em camadas e colunas, para identificar os tipos de células, e para determinar defeitos de mutantes.

Introdução

Durante o desenvolvimento, os neurônios dendritos elaborados em complexos mas estereotipados padrões ramificados para formar sinapses com os seus parceiros pré-sinápticos. padrões de ramificação dendríticas correlacionar com a identidade e as funções neuronais. Os locais de mandris dendríticas determinar o tipo de entradas pré-sinápticos que recebem, enquanto o dendríticas ramificação tamanhos de complexidade e de campo governar o número de entrada. Assim, as propriedades morfológicas dendríticas constituem factores determinantes para a conectividade sináptica e computação neuronal. Em muitas regiões do cérebro complexas, tais como os lóbulos óptica da mosca e a retina dos vertebrados, circuitos sinápticos são organizadas em colunas e camadas para facilitar o processamento de informação ^{1, 2.} Em tal organização coluna e camada, os neurónios pré-sinápticos de distintos axónios projecto modalidade para terminar numa camada específica (os chamados direccionamento específico de camada) e para formar uma matriz bi-dimensional ordenada (de modo-Called mapa topográfico), enquanto os neurônios pós-sinápticos estender dendritos de tamanhos adequados em camadas específicas para receber entradas pré-sinápticas dos tipos e números corretos. Enquanto axonal direcionamento para as camadas e colunas tem sido bem estudada ^{3, 4,} muito menos se sabe sobre como dendritos são encaminhadas para camadas específicas e expandir adequadamente dimensionada campos receptivos para formar conexões sinápticas com os parceiros pré-sinápticos corretos ^5. A dificuldade de imagem e quantificar dendrítica direcionamento para as camadas e colunas tem dificultado o estudo do desenvolvimento dendrítica em estruturas cerebrais colunar e laminados.

Drosophila neurônios da medula é um modelo ideal para o estudo de roteamento dendrítica e montagem de circuito em colunas e camadas. O neurópilo mosca medula é organizado como uma estrutura 3D de 10 camadas e aproximadamente 750 colunas. Cada coluna é inervado por um conjunto de fibras aferentes, incluindo photoreceptors R7 / R8 e neurônios da lâmina L1 - L5, cujos terminais axonal formar mapas topográficos de uma forma específica de camada ^6. Cerca de 38 tipos de neurônios da medula estão presentes em cada coluna de medula e dendrites elaboradas em camadas específicas e com tamanhos de campo adequados para receber as entradas a partir destes aferentes ^7. Os circuitos sinápticos na medula foram reconstruídos no nível do microscópio electrónico; Assim, as parcerias sinápticas estão bem estabelecidos ^{7, 8.} Além disso, as ferramentas genéticas para a marcação de vários tipos de neurónios de medula são disponíveis ^{9, 10, 11.} Ao examinar três tipos de transmedulla (TM) neurônios (Tm2, Tm9 e TM20), já anteriormente identificados dois atributos específicos de células do tipo-dendríticas: (i) neurônios Tm projetam dendrites quer na direcção anterior ou posterior (proj planardirecção exão), dependendo dos tipos de células e (ii) dendrites dos neurónios de medula terminam em camadas específicas da medula de uma forma específica de célula do tipo-(terminação específica de camada) ^12. Planar direção de projeção e terminação específica camadas são suficientes para diferenciar estes três tipos de neurônios Tm, enquanto que mutações que perturbam respostas TM para camada e coluna pistas prejudica aspectos distintos desses atributos.

Aqui, apresentamos um fluxo de trabalho completo para examinar o padrão dendrítica de neurônios da medula Drosophila em colunas e camadas (Figura 1). Em primeiro lugar, vamos mostrar um método de imagem dual-view, que usa software personalizado para combinar dois imagem confocal pilhas para gerar imagens isotrópicas de alta qualidade. Este método necessita apenas de microscopia confocal convencional para gerar imagens de alta qualidade que permitem o rastreio de confiança de ramos dendríticos, sem recorrer à microscopia de super-resolução, tals STED (Emissão Estimulada de Esgotamento) ou iluminação estrutural. Em segundo lugar, apresentamos um método para rastrear mandris dendríticas e para registrar os traços neurite resultantes para uma matriz coluna de referência. Em terceiro lugar, podemos mostrar os métodos computacionais para a extracção de informação sobre a direcção de projecção planar e terminação específica de camada de dendritos, bem como para derivar estimativas para a ramificação e de terminação frequências dendríticas. Juntos, estes métodos permitem a caracterização dos padrões dendríticas em 3D, a classificação de tipos de células com base em morfologias dendríticas, e a identificação de possíveis defeitos em mutantes.

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Protocolo

Nota: O protocolo contém três seções: dual-view de imagem (seções 1 - 3), o rastreamento dendrítica e registo (seções 4 - 6), e análise dendrítica (secções 7 - 9) (Figura 1). Os códigos e arquivos de exemplo são fornecidos na Tabela de materiais / equipamentos.

1. Dual-imagem Acquisition

NOTA: Este passo destina-se a aquisição de duas pilhas de imagens do neurónio de interesse em duas orientações ortogonal (horizontal e frontal).

1. Prepare cérebros mosca que contêm neurónios rotulados escassamente medula (10 ~ células / lóbulo cerebral) com um marcador de GFP membrana (mCD8GFP), como previamente descrito ^12. Manchar o cérebro com anticorpo de coelho anti-GFP (para medula dendritos dos neurónios) e rato mAb24B10 (por axónios fotorreceptoras), os anticorpos primários e anticorpos secundários fluorescentes (Alexa 488 anti-coelho Alexa 568 e anticorpos anti-ratinho), como descrito anteriormente13. Limpar o cérebro em 70% de glicerol em 1x PBS.
2. Para montar o cérebro na orientação horizontal (Figuras 2A, B), transferir o cérebro da mosca limpou-glicerol para uma gota de 20 ul de meio de montagem antifade no centro de uma corrediça.
3. Anexar pequenas manchas de barro nos 4 cantos da lamela para evitar a lamela de esmagamento da amostra do cérebro durante a montagem.
   NOTA: As manchas de barro fornecer amortecimento para evitar a lamela de esmagamento da amostra. Cada mancha de argila deve ser de cerca de 1 mm de diâmetro.
4. Sob um microscópio de dissecação, os cérebros posicionar na posição ventral-se e colocar a lamela em cima para fixar o cérebro. Utilize a superfície dorsal convexa do cérebro como um ponto de referência para identificar a orientação da amostra de cérebro (Figura 2A).
5. Obter a primeira pilha de imagens (vista horizontal) com um microscópio confocal. Usar uma lente objectiva de alta NA (tal como um 63X 1,3 NA glicerol ou imersão em óleo objelente ctive) e 2,5 vezes zoom digital (o tamanho do pixel é 0,105 mm por pixel, o número médio é 2). Adquirir mais de 180 secções ópticas (512 x 512 pixels), para cobrir a neurópilo medula com um tamanho de passo de 0,2 um.
6. Remontar o cérebro como descrito nos passos 1.3 - 1.4, mas alinhar o cérebro na posição anterior-up (vista frontal).
7. Adquirir a segunda pilha de imagens (vista frontal) do mesmo neurônio, como descrito no passo 1.5.
   NOTA: Encontrar o mesmo neurônio pode ser um desafio quando existem numerosos neurónios marcados no lobo óptico. Para identificar os mesmos neurônios a partir de ambas as orientações, inferior ampliação pilhas de imagens de ambos os pontos de vista podem ser necessárias (por exemplo, usar um zoom de 0,7 e um tamanho de passo de 0,45 para adquirir pilhas de imagens de baixa resolução). Se a imagem maior do que 512 x 512, a imagem deve ser cortada para 512 x 512 antes da combinação de imagem e o tamanho do pixel deve manter a 0,105 mm por pixel, enquanto imagiologia do grande campo. A perda do sinalé um problema potencial para o tecido profundo. Se o sinal for fraco, a imagem metade ventral do cérebro. Para reduzir a fotodegradação durante a digitalização, utilize um preço tão baixo a potência do laser possível. Use o indicador de intervalo para verificar se há superexposição antes de adquirir pilhas de imagens. Se possível, use um microscópio confocal equipado com detectores Gaasp.
8. Identificar e registrar a localização do neurônio de interesse em relação ao neurópilo medula (direita / esquerda [R / L] e dorsal / ventral [D / V]). Verifique se a amostra movido durante a aquisição de imagem, examinando a pilha de imagens.
   NOTA: Amostra movimento é muitas vezes devido a montagem incorrecta. Se ocorrer a movimentação da amostra, a pilha de imagem não pode ser utilizado durante o registo e deve ser descartado. Re-montagem da amostra e adquirir pilhas de imagens do mesmo neurônio.

Deconvolution 2. Imagem

NOTA: A etapa de deconvolução usa software imagem deconvolução para restaurar as imagens adquiridas que são degradados por confusãoe ruído. Embora este passo é opcional, que melhora significativamente a qualidade da imagem. Recomenda-se usar pilhas de imagens deconvolved para registro e combinação de imagem na seção 3.

1. Inicie o programa de deconvolução no modo interativo. Carregar a pilha de imagens (em LSM ou o formato microscópico específico), escolhendo Menu: Arquivo / Abrir (ou Ctrl-o) na janela principal.
2. Clique para selecionar a pilha imagem carregada e escolha do menu: Ops para abrir a janela de operação de imagem. Use o algoritmo padrão clássico de Máxima Verossimilhança (CMLE).
3. Na janela de operação a imagem, clique na guia "Parâmetros". Digite os parâmetros apropriados para o meio de lente de imersão, a incorporação de médio e abertura numérica (por exemplo, óleo, glicerina, etc.) (Por exemplo, óleo de imersão, etc.) (NA, aqui, 1.3 foi usado). Verifique os parâmetros restantes para se certificar de que eles refletem corretamente as condições de imagem. Clique na guia "Definir todos verificados" para finalize as definições de parâmetros.
4. Na janela de operação a imagem, clique na guia "Operação". Atribuir um destino de saída (por exemplo, C). Digite números apropriados em "Signal / Noise por canal" (por exemplo, "12 12 12 12" é um bom ponto de partida, enquanto que a configuração padrão é "20 20 20 20"). Use as configurações padrão para os parâmetros restantes.
5. Clique na guia "Executar comando" para iniciar deconvoluting a pilha de imagens; esse processo pode levar até dezenas de minutos para ser concluído, dependendo do computador.
6. Na janela principal, clique e selecione a pilha de deconvolved. Escolha Menu: Salvar como para salvar a imagem deconvolved no formato de arquivo de imagem ICS (.ics e .IDS).
   NOTA: Cada pilha imagem tem dois arquivos: o arquivo ICS contém as informações de cabeçalho eo arquivo ids contém a informação da imagem crua.
   1. Renomear os arquivos de imagem Pilha de acordo com a orientação de imagem (por exemplo, o nome do horizontal-view imagem stachas H.ids e H.ics ea frontal-view imagem Pilha F.ids e F.ics).

3.-view combinação dupla Imagem

Nota: Esta etapa combina imagem Duas pilhas para gerar imagens de alta resolução em 3D usando o software MIPAV.

1. Geração de matrizes para combinação de imagens.
   1. Inicie o programa MIPAV. Carregar as pilhas de imagens H e F, escolhendo Menu: Arquivo / Abrir imagem (A) a partir do disco (ou Ctrl-f) /H.ids e F.ids; a janela irá apresentar duas imagens.
   2. Selecione a imagem H clicando na imagem e escolha Menu: Ferramentas Utilities / Conversão / RGB / Grays; a janela irá mostrar GrayG, GrayB e imagens GrayR.
   3. Fechar GrayR e GrayB, mantendo apenas GrayG na janela.
   4. Selecione a imagem F clicando na imagem e escolha Menu: Ferramentas Utilities / Conversão / RGB / Grays. A janela irá mostrar GrayG1, GrayB1 e imagens GrayR1.
   5. Fechar GrayR1 e GrayB1 e manter apenas GrayG1 na janela. Neste passo, apenas a GrAYG e GrayG1 estão na janela.
   6. Selecione o GrayG (realce), escolha Menu: Algoritmos / Registo / Otimizada de Registro Automático de Imagem; a caixa de diálogo "Optimized Registro Automático Imagem 3D" irá aparecer.
      1. Nas opções de entrada, altere os "graus de liberdade" de default "Affine-12" para "Específico rescale-9". Em "Rotações",-chave -105 a 105 na "faixa de ângulo de amostragem Rotation" (padrão: -30 a 30 graus), 10 no "incremento de ângulo grosseiro" (padrão: 15 graus), e 3 no "Fine ângulo do incremento "(padrão: 6 graus).
   7. Clique em OK; o primeiro Matrix "GrayG_To_GrayG1.mtx" será gerado e salvo na pasta de imagem. Feche todas as janelas de imagem e prossiga para a próxima etapa; esta etapa vai demorar pelo menos 15 min.
   8. Carregar as pilhas de imagens H e F, escolhendo Menu: Arquivo / Abrir imagem (A) a partir do disco (ou Ctrl-f) /H.ids e F.ids, como no passo 3.1.1.
   9. Selecione a imagem H clicando na imagem e escolha Menu: Ferramentas Utilities / Conversão / RGB / cinza; a "> RGB- Gray" caixa de diálogo irá aparecer. Clique em OK; a janela irá mostrar imagens "HGray". Mantenha HGray e fechar a imagem H.
   10. Repita o passo 3.1.9 para a imagem F; as imagens "FGray" aparece na janela. Mantenha FGray e fechar a imagem F; única HGray e FGray será deixado na janela.
   11. Selecione a imagem HGray (realce) e vá para o menu: Ferramentas Algoritmos / transformação / Transform. A caixa de diálogo "Transformações / Resample Imagem" irá aparecer. Clique na guia "Resample" e altere o resample ao tamanho do "HGray" para "FGray". Em seguida, clique na guia "Transform" e de carga "GrayG_To_GrayG1.mtx", seleccionando a "matriz Ler de arquivo." Clique em OK; a janela irá mostrar a imagem HGray_transform. Feche a imagem HGray tão somente HGray_transform e FGray são deixados na janela.
   12. Selecione a opção "HGray_transform & #34; imagem (realce) e vá para o Menu: Algoritmos / Registo / Otimizada de Registro Automático de Imagem. A caixa de diálogo "Optimized Registro Automático Imagem 3D" irá aparecer. Em "Rotações" chave na -5 a 5 na "faixa de ângulo de amostragem Rotation" (padrão: -30 a 30 graus), 3 no "incremento de ângulo grosseiro" (padrão: 15 graus), e 1 na "Fine ângulo do incremento "(padrão: 6 graus). Clique em OK.
       NOTA: The Matrix Affine (HGray_transform_To_FGray.mtx) será gerado e salvo na pasta imagem e a imagem "HGray_Transform_register" será mostrado na janela. Esta etapa vai demorar pelo menos 40 min.
   13. Feche a imagem "HGray_transform"; apenas "HGray_Transform_register" e "FGray" deve ser deixado na janela.
   14. Selecione a imagem "HGray_Transform_register" (destaque) e vá para o Menu: Algoritmos / Registo / B-Spline registro automático 2D / 3D. O "B-Spline Registrati automáticaon-3D intensidade "caixa de diálogo irá aparecer. Selecione" Mínimos Quadrados "na função de custo (o padrão é do Coeficiente de Correlação).
       1. Clique em "Executar de duas passagens de registro". Na seção Passe 1, digite 2 na "Descida Gradiente Minimizar Tamanho do Passo (unidades amostrais)" (o padrão é 1) e introduza 10 no "número máximo de iterações:" (o padrão é 10). Na seção Passe 2, digite 1 na "Descida Gradiente Minimizar Tamanho do Passo (unidades amostrais)" (o padrão é 0,5) e introduza 2 para "número máximo de iterações:" (o padrão é 10).
          NOTA: A matriz NLT ", HGray_transform_register.nlt," será salvo na pasta de imagem e a imagem "HGray_transform_register_registered" será mostrado na janela. Esta etapa vai demorar pelo menos 5 min.
   15. Feche todas as imagens na janela.
2. Gerando a imagem de referência para a combinação de imagem.
   NOTA: Este passo é destinado a Genercomi uma imagem horizontal registrado para combinação.
   1. imagem F carga H e pilhas, escolhendo Menu: Arquivo / Abrir imagem (A) a partir do disco (ou Ctrl-f) /H.ids e F.ids; duas imagens aparece na janela.
   2. Selecione a imagem H (destaque) e vá ao Menu: Ferramentas Algoritmos / transformação / Transform; a caixa de diálogo "Transformações / Resample Imagem" irá aparecer. Clique na guia "Resample" e altere o resample de um tamanho de "H" para "F." Em seguida, clique na guia "Transform" e de carga "GrayG_To_GrayG1.mtx", selecionando "Leia matriz a partir do arquivo." Clique em OK; a imagem H_transform aparece na janela. Feche a imagem H, mas manter H_transform e F na janela.
   3. Selecione a imagem "H_transform" (destaque) e vá para o menu: Ferramentas Algoritmos / transformação / Transform; a caixa de diálogo "Transformações / Resample Imagem" irá aparecer. Clique na guia "Resample" e altere o resample de um tamanho de "H_transform" a "F. & #34; Em seguida, clique na guia "Transform" e de carga "HGray_transform_To_FGray.mtx", selecionando "Leia matriz a partir do arquivo." Clique em OK; a imagem "H_transform_transform" aparece na janela. Feche a imagem H_transform; neste ponto, apenas H_transform_transform e F será deixado sobre a janela.
   4. Selecione a imagem "H_transform_transform" (destaque) e vá para o menu: Ferramentas Algoritmos / Transformação / Transform não-linear; a caixa de diálogo "Nonlinear B-Spline Transformação" irá aparecer. Em seguida, a carga "HGray_transform_register.nlt" e clique em OK; a imagem "H_transform_transform_registered" aparece na janela. Salve a imagem como um arquivo ICS. Feche todas as imagens na janela.
3. Combinando pilhas de imagens
   NOTA: Este passo é combinar duas pilhas de imagens adquiridas em orientações ortogonais (horizontal e frontal) em uma pilha de alta resolução.
   1. Vá ao Menu: Plugins / Generic / Drosophila Retinal Registrationl; a caixa de diálogo "Drosophila Retinal v2.9 Registro" irá aparecer. Carregar "H.ics" à imagem H, "H_transform_transform_registered" a partir do passo 3.2.4 em Imagem H-registrado, "F.ics" à imagem F, "GrayG_To_GrayG1.mtx" a partir do passo 3.1.7 em Transformação 1-Green (opcional ), "HGray_transform_To_FGray.mtx" do passo 3.1.12 em Transformação 2-afim, e "HGray_transform_register.nlt" do passo 3.1.14 em Transformação 3-não-linear (opcional).
      1. Selecione sqrt (Intensity-H x Intensidade-F) e Sem rescale em "Rescale H para F." Mantenha as opções padrão para os parâmetros restantes. Clique em OK; esta etapa levará cerca de 3 min.
         NOTA: Após o processamento, 3 conjuntos de imagens serão geradas: combinedImage_sqrRt_trilinear_norescale_ignoreBG.ids (a imagem final recombinados), greenChannelsImage-Gxreg-Gy-Gcomp.IDS (canal verde para H, F, ea imagem recombinados final), e redChannelsImage- Rxreg-Ry-Rcomp.ids (canal vermelho foR H, F, e a imagem recombinado final); todos os arquivos de saída serão redimensionadas para 512 x 512 x 512.
   2. Abertas "combinedImage_sqrRt_trilinear_norescale_ignoreBG.ids" no âmbito do software de visualização de imagem. Salvar a pilha de imagens no formato IMS e renomeie o arquivo; Este arquivo de imagem recombinados será usado para rastreamento de neurite e registro.

Atribuição 4. Neurite rastreamento e Ponto de referência

NOTA: Este passo é traçar neurites (4.1) e para atribuir pontos de referência para o registo (4.2) usando o software de visualização de imagem.

1. traçando neurites
   1. Inicie o software de visualização de imagem. Abra o arquivo de imagem recombinados. Vá ao Menu: Editar / Show de Ajuste de exibição e desligue o canal de fotorreceptores (vermelho).
   2. Visualize a imagem no modo "Superar". Ligue "stereo" e usar o modo "Quad buffer" para visualizar imagens 3D se o computador é equipped com um sistema stereograph.
   3. Vá ao Menu: Ultrapasse / Filamentos para adicionar novos filamentos. Clique no botão "Ir criação automática, editar manualmente" tab.
   4. Clique na guia "Empate" e selecione "AutoDepth."
   5. Selecione "Configurações", marque a opção "Linha", e digite um número de pixels adequada para melhor visualização (a linha 4-pixel é usado neste protocolo). Marque a opção "Mostrar dendrites", "Começando Point," e "pontos de ramificação". Definir "qualidade de renderização" para 100%.
   6. Selecione a guia "Empate" e iniciar o rastreamento neurites. Comece com o axônio e depois passar para os dendritos (Figura 2D). O axônio e dendritos de neurônios transmedulla são fáceis de diferenciar.
      NOTA: Um neurônio Tm estende seu axônio do corpo celular e projeta todo o caminho para maior centro de processamento visual, o lobula. O sistema irá definir automaticamente o primeiro filamento longo como um axónio e as restantes filamentos curtos quantodendrites. Manter o ponto de partida no início do filamento (axónios) durante o rastreio e certificar-se de que as neurites rastreados estão ligados. Examine os pontos de ramificação e o ponto de início. Se as dendrites não estão conectados, um novo ponto de início será definida no filamento não-conectado.
   7. Após rastreamento, volte para "Configurações", desmarque a opção "Começando Point" e "Ramificação Point," e ir para o Menu: Ultrapasse exportação objectos seleccionados ../ /. Salve o filamento como um arquivo inventor (* .iv).
2. Atribuição de pontos de referência
   1. Selecione "Mostrar Ajuste Display" e ligue ambos os canais de imagem. Neste exemplo, o canal 1 é a coloração de fotorreceptores e o canal 2 é o neurónio TM20 (GFP).
   2. Vá ao Menu: Ultrapasse / Medição. Selecione a guia "Editar" e marque "Canal específico:" (selecionar o canal de fotorreceptores [red]).
   3. Atribuir pontos de referência para a camada superior. Vá ao Menu: / Superar / Medição Points para criar novos pontos de medição. Marcar o início da camada de M1 como uma camada superior. A ordem dos pontos é a seguinte: equatorial, ântero-equatorial, anterior, ântero-ventral, ventral, posterior-ventral, posterior, póstero-equatorial, e do centro (Figura 3F); definir o centro de fotorreceptores como aquele associado com os processos mais dendríticas.
   4. Atribuir as camadas R8 e R7 como no passo 4.2.3 (Figura 3G). Três pontos de medição individuais, deverá ser criado nos passos 4.2.3 e 4.2.4.
   5. Exportar as coordenadas dos pontos para cada camada. Clique na aba "Estatísticas", selecione "detalhada", "valores específicos" e "Posição"; e clique em "Export Estatísticas sobre Tab Display para arquivo." Salvar como "valores separados por vírgula" (* .csv).
   6. Abra os três arquivos CSV (de passos 4.2.3 - 4.2.4) e combinar as coordenadas dos 27 pontos de referência em um novo arquivo CSV por copiar e colar (the ordem é Top, R8 e R7). Veja a Tabela de Materiais / Equipamentos e seguir o formato do arquivo de exemplo.

5. de corpo rígido e Registro TPS Nonlinear

NOTA: Este passo é registrar os traços neurite (em formato iv) para a matriz coluna de referência e gerar um arquivo SWC registrada usando o programa MIPAV. Esta seção requer os seguintes arquivos: a pilha de recombinado (.IDS) do passo 3.3, o arquivo de ponto de referência (.csv) do passo 4.2 e o arquivo de rastreamento filamento neurite (.iv) a partir do passo 4.1.

1. Vá ao Menu: Plugins / Generic / DrosophilaStandardColumnRegistration. A janela "DrosophilaStandardColumnRegistration v6.6.1" irá aparecer.
2. Carregar os arquivos de imagem (.IDS), o arquivo de pontos de referência (.csv), eo arquivo filamento (.iv).
3. Escolha 9 pontos por camada.
4. Seleccione a posição do neurônio com imagens (LV / RD ou RV / LD).
5. Selecione "Registrati rígidasobre e TPS "e" Registro rígida "para não-linear e registro de corpo rígido, respectivamente.
6. Marque a opção "Criar arquivo SWC" para gerar os arquivos seguinte resultado: um arquivo de rastreamento neurite registadas em formato SWC (ver materiais específicos / Equipamentos para a definição), um arquivo de IV registado (.iv), coordenadas da neurite padronizado (.txt), coordenadas transformadas (.txt), e a imagem combinada (.IDS).
7. Mudar o nome do arquivo SWC. Aplicar a abreviatura do local para o fim do nome do ficheiro (passo 1.7). Por exemplo, use "Tm20_3_RV.swc" para TM20 neurônio # 3 localizado na metade ventral da medula direita.

6. Padronização de configuração direito do ventral

NOTA: Este passo é converter os traços neurite (em formato SWC) para configuração de RV padrão (direita-ventral) usando o script personalizado "RV_standardization.m." Aqui, o roteiro foi escrito na linguagem de laboratório matriz. onomes dos arquivos SWC de entrada deve estar no seguinte formato: "NeuronName _ _ Número .swc Configuração" (por exemplo, Tm20_3_LV.swc).

1. Abra o script "RV_standardization.m".
2. Editar os seguintes parâmetros na secção "A entrada do usuário":
   1. Digite os nomes dos neurônios, sem numeração (por exemplo, Tm2, TM20, etc.) em "neuron_names."
      NOTA: O padrão em "file_end_in" é "_ * swc,.", Que procura por arquivos com nomes contendo ( "*" é um wildcard que qualquer número de caracteres) "_ * SWC.". O padrão de "swc_file_end_out" é "_f.swc", que irá adicionar "_f" ao final do nome do arquivo após a padronização.
   2. Especifique o diretório onde os arquivos SWC estão em "directory_in". Especifique o diretório onde os arquivos padronizados vai em "directory_swcout".
3. Executar o script.
4. Optional: Use Vaa3D ¹⁴ para visualizar os arquivos SWC e validar a conversão.

7. Calcular dendríticas ramificação e que encerra Frequencies

NOTA: Este passo utiliza de corpo rígido registrado arquivos SWC para calcular os estimadores de Kaplan-Meier para a probabilidade de que um segmento dendríticas vai chegar a um determinado comprimento sem terminar. Este script usa duas funções Dendritic_Tree_Toolbox: extractDendriticSegmentLengthDistribution e estimateDendriticSegmentLengthProbability.

1. Abra o script "Branch_term_P.m".
2. Editar os seguintes parâmetros na secção "A entrada do usuário":
   1. Especifique o caminho para os arquivos SWC de corpo rígido registada em "pathToSWCFiles" (por exemplo, / Rigid_Registered_swc /). Especifique o caminho que irá realizar a saída gráfica em "pathToOutput." Especifique o nome dos neurônios ou tipos neuronais no "neuron_names" (por exemplo, Tm2, Tm20, etc).
3. Execute o script; as saídas são a curva de estimativa de Kaplan-Meier para a ramificação dendrítica e terminação.
   NOTA: Opcional: Aplique o método de ajuste de função para extrair da Kaplan-Meier estimadores a probabilidade local que o segmento dendríticas vai ramificar ou terminar.

8. traçar a distribuição de Rescisão específico-Layer da dendríticas mandris

NOTA: Este passo representa graficamente a distribuição de terminais dendríticas em diferentes camadas da medula como um gráfico de barras. Isto pode ser aplicado a um neurónio, um grupo de neurónios, ou grupos de neurónios. O script usa a função extractDistributionAlongAxis de Dendritic_Tree_Toolbox.

1. Abra o script "Layer_term.m".
2. Editar os seguintes parâmetros na secção "A entrada do usuário":
   1. Especifique o diretório que contém não-lineares registrado arquivos SWC no "pathToSWCFiles" (por exemplo, / Non_linear_Registered_swc /). Especifique o diretório para a saída de gráficos em "pathToOutput." Especifique o nome dos neurônios ou tipos neuronais em "neuron_names" (por exemplo, Tm2, TM20, etc.).
3. Execute o script tutorial. A saída é um histograma da proporção de nós terminais em camadas específicas da medula.

9. Plot projeção Direcção Planar dos dendritos

NOTA: Este passo traça os rumos projeção plana de dendrites como um lote polar. O script usa a função extractAngularDistribution de Dendritic_Tree_Toolbox.

1. Abra o script "Planar_proj.m."
2. Editar os seguintes parâmetros na secção "A entrada do usuário".
   1. Especifique o diretório que contém o não-linear arquivos SWC registada em "pathToSWCFiles" (por exemplo, / Non_linear_Registered_swc /). Especifique o diretório para saída gráfica em "pathToOutput." Especifique o nome doos neurônios ou tipos neuronais no "neuron_names" (por exemplo, Tm2, TM20, etc.).
3. Execute o script; a saída é um gráfico polar de direções projeção plana.

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Resultados

Usando o procedimento de imagem dupla vista aqui apresentado, uma mosca contendo neurónios do cérebro TM20 escassamente marcado foi fotografada em duas direcções ortogonais. Antes da imagem, o cérebro foi corado com anticorpos primários e secundários apropriados para visualizar GFP e fotorreceptoras axônios membrana-tethered. Para imagiologia, o cérebro foi montado pela primeira vez na orientação horizontal (Figura 2A, B). Um neurónio TM20 marcado com GFP e o...

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Discussão

Aqui, vamos mostrar como imagem e analisar mandris dendríticas dos neurônios da medula Drosophila. A primeira seção, dual-view de imagem, descreve a deconvolução e combinação de duas pilhas de imagens em uma pilha de imagens de alta resolução. A segunda seção, o rastreamento dendrite e registro, descreve a detecção e registo das dendrites dos neurónios da medula para a matriz coluna de referência. A terceira seção, a análise dendrítica, descreve o uso de scripts personalizados para analisar ...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
Huygens Professional	Scientific Volume Imaging	version 16.05	for image deconvolution (https://svi.nl).  commercial software
MIPAV		version 7.3.0	for image recombination and registration (http://mipav.cit.nih.gov/); freeware
MIPAV plugin: PlugInDrosophila RetinalRegistration.class			freeware
MIPAV plugin: PlugInDrosophilaStandard ColumnRegistration.class			freeware
Imaris	Bitplane		for tracing neurites and assigning reference points for image registration (http://www.bitplane.com); commercial software
Vaa3D			for visualizing swc files (https://github.com/Vaa3D/release/releases/); freeware
Matlab	Mathworks	R2014b	for morphometric analysis of dendrites (http://www.mathworks.com); commercial software
Matlab toolbox: TREES1.14		v1.14	for analyzing dendritic morphometric parameters (http://www.treestoolbox.org/download.html); freeware
Matlab toolbox: Dendritic_Tree_Toolbox		v1.0	For calculating morphometric parameters (https://science.nichd.nih.gov/confluence/display/snc/Data+collections+for+imagines+combination+and+standardize+column+registration). Freeware
Name	Company	Catalog number	Comments
Sample files
SWC file definition			http://www.neuronland.org/NLMorphologyConverter/MorphologyFormats/SWC/Spec.html
The codes and sample files for image combination and registration			https://science.nichd.nih.gov/confluence/display/snc/Data+collections+for+imagines+combination+and+standardize+column+registration
Reference point example			https://science.nichd.nih.gov/confluence/download/attachments/117216914/points.csv?version=1&modificationDate= 1471880596000&api=v2
Name	Company	Catalog number	Comments
Computer system
MS Windows Windows 7 x64 or Macintosh OS X 10.7 or later			3GHz 64-bit quad-core processor, 16G RAM (minimal)
Optional: Quadro4000  (or above) graphic card	Nvidia		for stereographic visualization of dendrites.
Optional: NVIDIA 3D vision2	Nvidia		http://www.nvidia.com/object/3d-vision-main.html
Optional: 120 Hz LCD display for NVIDIA 3D vision2			http://www.nvidia.com/object/3d-vision-system-requirements.html
Name	Company	Catalog number	Comments
Reagents for imaging
24B10 antibody	The Developmental Studies Hybridoma Bank	24B10
GFP Tag Antibody	Thermofisher Scientific	G10362
Goat anti-Rabbit (H+L), Alexa Fluor 488	Thermofisher Scientific	A11034
Goat anti-Mouse (H+L), Alexa Fluor 568	Thermofisher Scientific	A21124
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1000
Mounting Clay	Fisher	S04179
70% glycerol in 1x PBS
Cover glasses, high performance, D = 0.17 mm	Zeiss	474030-9000-000