Sütunlar ve Katmanlar dendritik Morfoloji Analizi

Özet

Burada, sütunlar ve katmanlar halinde Drosophila medulla nöronların dendritik yönlendirmesini nasıl analiz edileceğini göstermektir. iş akışı, izleme referans sütun dizisine dendritik milleri tescili için ve 3 boyutlu uzayda dendritik yapıların analizi için görüntü kalitesi ve hesaplama araçlarını geliştirmek için bir çift görünümü görüntüleme tekniği içerir.

Özet

Böyle sinek optik loblar ve omurgalı korteks gibi merkezi sinir sistemi, birçok bölgesinde, sinaptik devreler gelişmiş hayvanlarda geliştirme ve bilgi işleme sırasında beyin kablolama kolaylaştırmak için katmanları ve sütunlar halinde düzenlenir. Belirli katmanlarda tip spesifik desen ayrıntılı dendritler postsinaptik nöronlar uygun presinaptik terminalleri ile sinaps için. Uçucu medulla nöropil 10 katman ve yaklaşık 750 sütun oluşmaktadır; her sütun bir tip spesifik biçimde afferentleri bazı 7 tip aksonal terminalleri ile maç medulla nöronların 38 üzerinde türleri, dendritler tarafından innerve edilir. Bu rapor görüntüye prosedürleri ayrıntıları ve medulla nöronların dendritler analiz. iş akışı üç bölümden oluşmaktadır: (i) çift görüntüleme görüntüleme bölümü dendritler bir yüksek çözünürlüklü 3 boyutlu görüntü içine dik yönlerde toplanan iki konfokal görüntü yığınları birleştirir; (Ii) dendrit izleme ve kayıt bölümü dendritik izleri3D milleri ve referans sütun dizisine dendritik izlerini kaydeder; (Iii) dendritik analiz bölümü dendritik milleri tabaka özel sonlandırma ve düzlemsel projeksiyon yönü de dahil olmak üzere sütun ve katmanlar, açısından dendritik desenleri analiz ve dendritik dallanma ve sonlandırma frekanslarının tahminleri türemiştir. protokoller matris laboratuvar dilinde açık kaynak MIPAV (Tıbbi Görüntüleme İşleme, Analiz ve Görselleştirme) platformu ve özel toolbox üzerine inşa özel eklentileri kullanmaktadır. Birlikte, bu protokoller hücre türlerini tanımlamak için, ve mutantlar kusurları tespit etmek, katmanlar ve sütunlarda Drosophila medulla nöronların dendritik yönlendirme analiz etmek tam bir iş akışı sağlar.

Giriş

gelişimi sırasında, karmaşık ama basmakalıp dallı desenleri nöronlar ayrıntılı dendrit kendi presinaptik ortakları ile sinaps oluşturur. Dendritik dallanma desen nöronal kimlik ve işlevleri ile ilişkilidir. dendritik karmaşıklığı ve saha boyutları giriş numarasını yöneten dallanma sırasında dendritik milleri yerleri, aldıkları presinaptik girdilerin türünü belirlemek. Böylece, dendritik morfolojik özellikleri sinaptik bağlantı ve nöronal hesaplanması için kritik belirleyicidir. Böyle sinek optik loblar ve gözdeki gibi karmaşık beyinleri, birçok bölgesinde, sinaptik devreler bilgi işlem ^{1, 2} kolaylaştırmak için sütun ve katmanlar halinde organize edilir. Böyle bir sütun ve katman organizasyonda, farklı bir yöntem proje akson presinaptik nöronlar belirli bir katmana (sözde katman özel hedefleme) sona erdirme ve düzenli bir iki boyutlu bir dizi oluşturmak için (yani-called topografik harita), postsinaptik nöronlar belirli katmanlarında uygun boyutlarda dendrit uzatmak ise doğru tip ve sayıları presinaptik girişler almak için. Katmanlara ve sütunlara hedefleme aksonal iyi ^{3, 4} çalışılmıştır olsa da, çok daha az dendritler belirli katmanlara yönlendirilir ve doğru presinaptik ortaklarla ⁵ ile sinaptik bağlantıları oluşturmak üzere açık alanları uygun genişletmek boyutlandırılır nasıl bilinir. görüntüleme ve katmanlar ve sütunlar hedefleyen nicel dendritik zorluk sütunlu ve lamine beyin yapılarında dendritik gelişim çalışma engellemiştir.

Drosophila medulla nöronlar sütunlar ve katmanlar halinde dendritik yönlendirme ve devre düzeneğinin çalışmak için ideal bir model vardır. Sinek medulla neuropil 3D 10 katmanları kafes ve yaklaşık 750 sütun olarak düzenlenmiştir. Her sütun p dahil afferentleri bir dizi, innerve edilirolan aksonal terminaller katman özgü moda ⁶ topografik haritalar oluşturan L5, - hotoreceptors R7 / R8 ve lamina nöronlar L1. Medulla nöronların yaklaşık 38 çeşit bu afferentleri ⁷ girdileri almak için her medulla sütun ve belirli katmanlarda ve uygun alan boyutlarıyla ayrıntılı dendritler mevcuttur. medulla sinaptik devreler elektron mikroskobik düzeyde yeniden inşa edilmiştir; böylece, sinaptik ortaklıklar ^{iyi 8 7} kurulur. Ayrıca, medulla nöronların çeşitli etiketleme genetik araçlar ^{9, 10, 11} mevcuttur. transmedulla üç tip (Tm) nöronlar (Tm2, Tm9 ve TM20) inceleyerek, daha önce iki hücre türüne özgü dendritik özelliklerini belirledik: (i) Tm nöronlar ya ön veya arka yönde dendritler proje (düzlemsel projection yönü), hücre tipine bağlı olarak ve (ii) medulla nöronlarının dendritleri hücre türüne özgü bir şekilde (tabakaya özgü sonlandırma) ¹² belirli medulla tabakalarını sonlanır. tabaka ve kolon ipuçlarına Tm yanıtları bozan mutasyonlar bu niteliklerin farklı yönlerini etkileyen ise düzlemsel projeksiyon yönü ve katman özgü sonlandırma, Tm nöronların bu üç tip ayırt etmek için yeterlidir.

Burada, sütunlar ve katmanlar (Şekil 1) Drosophila medulla nöronların dendritik desenlendirme incelemek için tam bir iş akışı sunuyoruz. İlk olarak, iki konfokal görüntü birleştirmek için özelleştirilmiş bir yazılım kullanan bir çift görünümü görüntüleme yöntemi, yüksek kaliteli izotropik görüntüleri oluşturmak için yığınlarının göstermektedir. Bu yöntem, süper çözünürlük mikroskobu başvurmadan, dendritik dalların güvenilir izleme izin yüksek kaliteli görüntüler oluşturmak için sadece konvansiyonel konfokal mikroskopi gerektirir böyle birs STED (Uyarılmış Emisyon tükenmesi) veya yapısal aydınlatma. İkincisi, biz dendritik milleri izlemek için ve bir referans sütun dizisi elde edilen nörit izlerini kayıt için bir yöntem mevcut. Üçüncü olarak, dendritik dallanma ve sonlandırma frekanslar için tahmin yürütülürken yanı sıra, düzlemsel projeksiyon yönü ve dendritler tabaka özgü fesih hakkında bilgi ayıklamak için hesaplama yöntemleri göstermektedir. Birlikte, bu yöntemler, 3D, dendritik morfolojileri göre hücre tiplerinin sınıflandırılması dendritik desen karakterizasyonu ve mutant potansiyel kusurların belirlenmesine izin verir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Not: Çift-view görüntüleme (bölümler 1-3), dendritik izleme ve kayıt (bölümler 4-6), ve dendritik analizi (bölümler 7-9) (Şekil 1): protokol üç bölümden oluşmaktadır. Kodlar ve örnek dosyalar Malzemeleri / Ekipman Tablo verilmektedir.

1. Çift görüntü Edinme

Not: Bu adım, iki dik (yatay ve frontal) yönlerde ilgi nöron iki görüntü yığınlarını elde etmek için tasarlanmıştır.

1. Seyrek medulla nöronlar etiketli içeren sinek beyinleri hazırlayın (~ 10 hücre / beyin lobu) bir membran GFP işaretleyici (mCD8GFP) ile, daha önce ¹² nitelendirdi. Daha önce tarif edildiği gibi, (medülla nöron dendritler için) tavşan anti-GFP ve (fotoreseptör aksonlar için) fare mAb24B10, primer antikor ve floresan ikincil antikorlarla (Alexa 488, anti-tavşan ve Alexa 568, anti-fare antikorları) ile beyin Leke13. 1x PBS içinde% 70 gliserol beyin temizleyin.
2. Yatay yön beyin monte etmek için (Şekil 2A, B), bir slayt merkezinde antifade montaj orta bir 20 uL damla gliserol temizlenir uçucu beyin aktarın.
3. Montaj sırasında beyin örneği kırma lamel önlemek için lamel 4 köşelerinde küçük kil yamaları takın.
   NOT: Kil yamalar örnek kırma lamel önlemek için yastıklama sağlar. Her Toprak yama çapı yaklaşık 1 mm olmalıdır.
4. bir mikroskop altında, ventral-yukarı pozisyonda beyinleri konumlandırmak ve beyin sabitlemek için üstüne lamel yerleştirin. Beyin örnek (Şekil 2A) yönünü belirlemek için bir işaret olarak beyin konveks dorsal yüzeyini kullanın.
5. Bir konfokal mikroskop ile ilk görüntü yığınını (yatay görünüm) edinin. Böyle bir 63X 1.3 NA gliserol veya yağ daldırma obje olarak (yüksek-NA objektif lens kullanmakctive lens) ve 2.5X dijital zoom (piksel boyutu piksel başına 0.105 mikron olduğu; ortalama sayı) 2 'dir. 0.2 um adım büyüklüğü ile medulla neuropil kapsayacak şekilde 180'den fazla optik bölümleri (512 x 512 piksel) edinin.
6. adımlarda 1.3 açıklandığı gibi beyin yeniden bağlayın - 1.4, ancak ön-yukarı konumda (önden görünüm) beyin hizalayın.
7. Adım 1.5 açıklandığı gibi, aynı nöronun ikinci görüntü yığınını (önden görünüm) kazanır.
   NOT: Optik lobda etiketli sayısız nöronlar olduğunda aynı nöron bulma zor olabilir. Her iki yönelimleri aynı nöronlar belirlemek için, her iki görüşlerinden düşük büyütmeli görüntü yığınlarının (örneğin, 0.7 zoom ve düşük çözünürlüklü görüntü yığınlarını elde etmek için 0.45 um bir adım boyutunu kullanmak) gerekli olabilir. 512 x 512 daha büyük görüntü, görüntü görüntü birleşmesi öncesinde 512 x 512 kırpılması gerekir ve büyük bir alan görüntüleme sırasında piksel boyutu piksel başına 0.105 mikron tutmak olursa. sinyalin KaybıDerin doku için potansiyel bir sorundur. sinyal zayıf, görüntü beynin ventral yarısı ise. , Tarama sırasında photobleaching azaltmak mümkün olduğunca düşük bir lazer güç kullanmak. görüntü yığınlarını almadan önce aşırı maruz kalma kontrol etmek için aralık göstergesini kullanın. Mümkünse, GaAsP dedektörleri ile donatılmış bir konfokal mikroskop kullanın.
8. Belirlemek ve medulla nöropilde (sağ / sol [R / L] ve dorsal / ventral [D / V]) göre ilgi nöron konumunu kaydetmek. Örnek Görüntü yığını inceleyerek görüntü alımı sırasında hareket olmadığını kontrol edin.
   NOT: Örnek hareketli genellikle yanlış montaj kaynaklanmaktadır. örnek hareketi olursa, görüntü yığını kayıt için kullanılamaz ve atılmalıdır. örnek yeniden monte ve aynı nöron görüntü yığınlarını kazanır.

2. Görüntü Dekonvolüsyon

NOT: Dekonvolüsyonun adım bulanık tarafından bozulmuş olan edinilmiş görüntüleri geri görüntü Dekonvolüsyonun yazılımını kullanıyorve gürültü. Bu adım isteğe bağlı olmakla birlikte, görüntü kalitesini önemli ölçüde artırır. Bölüm 3 görüntü kaydı ve kombinasyon için deconvolved görüntü yığınlarını kullanılması tavsiye edilir.

1. Etkileşimli modda Dekonvolüsyonun programını başlatın. ana penceresinde Dosya / Aç (veya Ctrl-o): Menü seçerek (EKK veya belirli mikroskobik formatında) görüntü yığınını yükleyin.
2. Görüntü işlem penceresini açmak için Ops: Yüklenen görüntü yığını seçin ve Menü seçmek için tıklayın. Varsayılan Klasik Maksimum Olabilirlik Tahmini (CMLE) algoritması kullanır.
3. Görüntü işlem penceresinde, "Parametreler" sekmesini tıklayın. (., Vb gibi, daldırma yağı) (. Örneğin, yağ, gliserin, vb) gömme orta, objektif daldırma ortamı için uygun parametreleri girin ve sayısal açıklık (NA, burada, 1.3 kullanılmıştır). onlar doğru görüntüleme koşullarını yansıttığından emin olmak için kalan parametrelerini kontrol edin. yüzgeç "tüm doğrulanmış Set" sekmesini tıklayınparametre ayarlarını alize.
4. Görüntü işlem penceresinde, "Operasyonu" sekmesini tıklayın. Bir çıkış hedefi atama (örneğin, c). "Kanal başına Sinyal / Gürültü" (varsayılan ayar "20 20 20 20" ise, örneğin, "12 12 12 12", iyi bir başlangıç noktasıdır) uygun numaralarını girin. Kalan parametreler için varsayılan ayarları kullanın.
5. Görüntü yığını karmaşıklığını aydınlatmak başlamak için "Run Command" sekmesini tıklayın; Bu süreç bilgisayara bağlı tamamlamak dakika onlarca sürebilir.
6. Ana pencerede, tıklayın ve deconvolved görüntü yığını seçin. Menü seçin: ICS görüntü dosya biçimi (.ics ve .ids) 'de deconvolved görüntü kaydetmek için Kaydet.
   NOT: Her görüntü yığını iki dosya vardır: ics dosyası başlık bilgilerini içerir ve kimlikleri dosya ham görüntü bilgilerini içerir.
   1. Görüntüleme yönüne göre görüntü yığını dosyaları yeniden adlandırmak (örneğin, yatay görüş görüntü s adçiviler H.ids ve H.ics ve frontal-görünüm görüntü yığını F.ids ve F.ics).

3. Çift görünüm Görüntü Kombinasyon

Not: Bu adım, iki resim MIPAV yazılımını kullanarak yüksek çözünürlüklü 3D görüntüler oluşturmak için yığınlarının bir araya getirir.

1. görüntü kombinasyonu için matrisler oluşturuluyor.
   1. MIPAV programını başlatın. Menü seçerek H ve F görüntü yığınlarını yükleyin: Disk (veya Ctrl-f) /H.ids ve F.ids Dosya / Aç görüntü (A); Pencere iki görüntü gösterecektir.
   2. Görüntüyü tıklayarak H görüntüyü seçin ve Menü seçin: Kamu Hizmetleri / Dönüşüm Araçları / RGB / Grays; Pencere GrayG, grayb ve GrayR görüntüleri gösterecektir.
   3. Yakın GrayR ve grayb, sadece pencerede GrayG tutmak.
   4. tıklayarak görüntüyü F görüntüyü seçin ve Menü seçin: Kamu Hizmetleri / Dönüşüm Araçları / RGB / Griler. Pencere GrayG1, GrayB1 ve GrayR1 görüntüleri gösterecektir.
   5. GrayR1 ve GrayB1 yakın ve pencere tek GrayG1 tutun. Bu aşamada yalnızca GRAtAYG ve GrayG1 penceresinde bulunmaktadır.
   6. Menü seçin GrayG (vurgu) seçin: Algoritmalar / Kayıt / Optimize Otomatik Görüntü Kaydı; "Optimize Otomatik Görüntü Kaydı 3D" iletişim kutusu açılacaktır.
      1. Girdi Seçenekleri 'nde, "Belirli rescale-9." Varsayılan "Afin-12" den "özgürlük Dereceleri" değiştirmek "Fine, ve 3:" Kaba açı artış "10 (15 derece varsayılan):" Dönmeler "," Dönüş açısı örnekleme aralığında "105'e -105 anahtar (-30 ila 30 derece varsayılan) açısı artışı "(varsayılan: 6 derece).
   7. Tamam'a tıklayın; İlk Matrix "GrayG_To_GrayG1.mtx" oluşturulur ve görüntü klasörüne kaydedilir. tüm görüntü pencerelerini kapatın ve bir sonraki adıma geçin; Bu adım en az 15 dakika sürer.
   8. seçerek Menü ile H ve F görüntü yığınlarını yükleyin: Disk (veya Ctrl-f) /H.ids ve F.ids, Dosya / Aç görüntü (A) adım 3.1.1 deki gibi.
   9. Görüntüyü tıklayarak H görüntüyü seçin ve Menü seçin: Kamu Hizmetleri / Dönüşüm Araçları / RGB / Gri; "RGB-> Gri" iletişim kutusu açılacaktır. Tamam'a tıklayın; Pencere "HGray" görüntüleri gösterecektir. HGray tutun ve H görüntü kapatın.
   10. F görüntü için yineleyin 3.1.9; "FGray" görüntüleri penceresinde görünecektir. FGray tutun ve F görüntüsünü kapatmak; Sadece HGray ve FGray penceresinde bırakılacaktır.
   11. HGray görüntü seçin (vurgulayın) ve Menü gidin: Algoritmalar / Dönüşüm araçları / Transform. "/ Yeniden Örnekle Image Transform" iletişim kutusu açılacaktır. "Yeniden Örnekle" sekmesini tıklayın ve "FGray" için "HGray" boyutuna resample değiştirin. Sonraki seçerek "Transform" sekmesini ve yük "GrayG_To_GrayG1.mtx" klik "Dosyadan oku matrisi." Tamam'a tıklayın; Pencere HGray_transform görüntü gösterecektir. HGray_transform ve FGray yani sadece pencerenin bırakılan HGray görüntüyü kapatın.
   12. "HGray_transform & # seç34; görüntü (vurgulayın) ve Menü gidin: Algoritmalar / Kayıt / Optimize Otomatik Görüntü Kaydı. "Optimize Otomatik Görüntü Kaydı 3D" iletişim kutusu açılacaktır. In "Dönmeler," -5 (varsayılan: -30 ila 30 derece) "Dönüş açısı örnekleme aralığında" içinde 5 anahtarı: "Fine, ve 1," Kaba açı artış "3 (15 derece varsayılan) açısı artışı "(varsayılan: 6 derece). Tamam'a tıklayın.
       NOT: Afin Matrix (HGray_transform_To_FGray.mtx) oluşturulur ve pencere gösterilecektir görüntü klasörü ve "HGray_Transform_register" görüntü kaydedilir. Bu adım en az 40 dakika sürer.
   13. "HGray_transform" imajını kapatın; Sadece "HGray_Transform_register" ve "FGray" penceresinde bırakılmalıdır.
   14. "HGray_Transform_register" görüntü seçin (vurgulayın) ve Menü gidin: Algoritmalar / Kayıt / B-Spline Otomatik Kayıt 2D / 3D. "B-Spline Otomatik Kayıt olon-3D yoğunluğu "iletişim kutusu. açılır seçin edecek" Maliyet fonksiyonu En Küçük Kareler "(varsayılan korelasyon oranı ise).
       1. "İki-geçiş yapın kayıt" tıklayın. Geçiş 1 bölümünde, skoru 2 anahtar içine 10 (varsayılan 1) ve anahtarı "Gradient Descent Adım Boyutu (örnek birimleri) Minimize" "maksimum yineleme sayısını:" (varsayılan 10). Geçiş 2 bölümünde, içine 1 anahtar içine 2'de (varsayılan 0.5) ve anahtarı "Gradient Descent Adım Boyutu (örnek birimleri) Minimize" "maksimum yineleme sayısını:" (varsayılan 10).
          NOT: NLT matrisi, "HGray_transform_register.nlt," görüntü klasörüne kaydedilir ve "HGray_transform_register_registered" görüntü penceresinde gösterilecektir. Bu adım en az 5 dakika sürer.
   15. penceresinde tüm görüntüleri kapatın.
2. görüntü kombinasyonu için referans görüntü oluşturuluyor.
   Not: Bu adım bir hidro içindirkombinasyon için kayıtlı yatay görüntü yedik.
   1. Menü seçerek yük H ve F görüntü yığınları: Disk (veya Ctrl-f) /H.ids ve F.ids gelen Dosya / Aç görüntü (A); İki resim penceresinde görünecektir.
   2. H görüntüsü (vurgu) seçin ve Menü gidin: Algoritmalar / Dönüşüm araçları / Transform; "/ Yeniden Örnekle Image Transform" iletişim kutusu açılacaktır. "Yeniden Örnekle" sekmesini tıklayın ve "F" ile "H" bir boyutu resample değiştirmek Sonraki seçerek "Transform" sekmesini ve yük "GrayG_To_GrayG1.mtx" klik "Dosyadan matrisi okuyun." Tamam'a tıklayın; H_transform görüntü penceresinde belirecektir. H görüntüsünü kapatın ama penceresinde H_transform ve F tutun.
   3. "H_transform" görüntü seçin (vurgulayın) ve Menü gidin: Algoritmalar / Dönüşüm araçları / Transform; "/ Yeniden Örnekle Image Transform" iletişim kutusu açılacaktır. "Yeniden Örnekle" sekmesini tıklayın ve "F. & # Için" H_transform "bir boyutu resample değiştirmek34; Sonraki seçerek "Transform" sekmesini ve yük "HGray_transform_To_FGray.mtx" klik "Dosyadan matrisi okuyun." Tamam'a tıklayın; "H_transform_transform" görüntü penceresinde belirecektir. H_transform görüntüyü kapatın; Bu noktada, sadece H_transform_transform ve F penceresinde bırakılacaktır.
   4. "H_transform_transform" görüntü seçin (vurgulayın) ve Menü gidin: Algoritmalar / Dönüşüm araçları / doğrusal olmayan Dönüşümü; "Doğrusal Olmayan B-Spline Dönüşüm" iletişim kutusu açılacaktır. Sonraki yük "HGray_transform_register.nlt" ve Tamam'a tıklayın; "H_transform_transform_registered" görüntü penceresinde belirecektir. Bir ICS dosyası olarak kaydedin. penceresinde tüm görüntüleri kapatın.
3. görüntü yığınlarını birleştiren
   Not: Bu adım bir yüksek çözünürlüklü yığını içine dik yönlerde (yatay ve frontal) edinilen iki görüntü yığınlarını birleştirmektir.
   1. Menü gidin: Eklentiler / Genel / Drosophila Retina Registrationl; "Drosophila Retina Kayıt v2.9" iletişim kutusu açılacaktır. (Resim H-Kayıtlı Dönüşüm 1-Green adım 3.1.7 den, "GrayG_To_GrayG1.mtx" Görüntü F, "F.ics" adım 3.2.4 İsteğe bağlı görüntü H, "H_transform_transform_registered" in "H.ics" Yükle ), "HGray_transform_To_FGray.mtx" Dönüşüm adım 3.1.14 den Dönüşüm 2-affine adım 3.1.12 ve "HGray_transform_register.nlt" 3-Doğrusal Olmayan) (opsiyonel.
      1. Sqrt (Yoğunluk-Y x Şiddeti-F) ve "F Rescale H" Hayır Rescale seçin Kalan parametreler için varsayılan seçenekleri tutun. Tamam'a tıklayın; Bu adım yaklaşık 3 dakika sürer.
         NOT: işlendikten sonra, görüntülerin 3 set oluşturulur: combinedImage_sqrRt_trilinear_norescale_ignoreBG.ids (son recombined resim), greenChannelsImage-Gxreg-Gy-Gcomp.IDS (H, F yeşil kanal ve nihai recombined görüntü) ve redChannelsImage- Rxreg-Ry-Rcomp.ids (fo kırmızı kanalR, H, F, ve son rekombine resim); tüm çıkış dosyaları 512 x 512 x 512 boyutuna getirilecektir.
   2. görüntü görselleştirme yazılımı altında Aç "combinedImage_sqrRt_trilinear_norescale_ignoreBG.ids". ims biçiminde görüntü yığını kaydedin ve dosyayı yeniden adlandırın; Bu recombined görüntü dosyası nörit izleme ve kayıt için kullanılacaktır.

4. Nörit İzleme ve Referans Noktası Atama

NOT: Bu adım görüntü görselleştirme yazılımı kullanarak neurites (4.1) iz ve kayıt (4.2) için referans noktaları atamak etmektir.

1. neurites izleme
   1. görüntü görselleştirme yazılımını başlatın. recombined görüntü dosyasını açın. Menü gidin: Düzen / Göster Ekran Ayarı ve fotoreseptör kanalı (kırmızı) kapatın.
   2. "Aşmak" modunda görüntü gözünüzde canlandırın. "Stereo" açın ve bilgisayar eq ise 3D görüntüleri görselleştirmek için "Quad Tampon" modunu kullanınBir stereograph sistemi ile uipped.
   3. Menü git: Yeni filamentler eklemek / filamentler Aşmak. sekmesi ", otomatik oluşturmayı atla elle düzenlemek" tıklayın.
   4. "Beraberlik" sekmesine tıklayın ve "AutoDepth."
   5. "Ayarlar" Daha iyi görünüm için uygun bir piksel sayısı "Çizgi" ve anahtarı işaretleyin (4 piksel hattı Bu protokolde kullanılır). "Göster Dendritlerin", "Başlangıç ​​Noktası" ve "Dallanma Noktaları" seçeneğini işaretleyin. Set% 100 "Kalite Render".
   6. "Beraberlik" sekmesini seçin ve neurites izleme başlar. Akson ile başlayın ve daha sonra dendritler (Şekil 2B) hareket ettirin. Akson ve transmedulla nöronların dendritler ayırt etmek kolaydır.
      NOT: Bir Tm nöron hücresi vücuttan akson uzatır ve yüksek görsel işleme merkezi lobula tüm yol projeleri. Sistem otomatik olarak akson olarak ilk uzun flaman ve kalan kısa filamentler olarak tanımlayacağızdendritler. izleme sırasında filamanın (akson) başında başlangıç ​​noktasını tutmak ve takip neurites bağlandığından emin olun. dallanma noktaları ve başlangıç ​​noktasını inceleyin. dendritler bağlı değilse, yeni bir başlangıç ​​noktası olmayan bağlı filaman olarak tanımlanacaktır.
   7. izleme sonra, geri dönmek "Ayarlar", "Başlangıç ​​Noktası" ve "dallanma noktası," işaretini kaldırın ve Menü gidin: / İhracat Seçilen nesneleri ../ Aşmak. bir mucit dosyası olarak filamanın kaydedin (* .iv).
2. referans noktaları atama
   1. "Show Ekran Ayarı" i seçin ve her iki görüntüleme kanalları açın. Bu örnekte, kanal 1 fotoreseptör boyama ve kanal 2 TM20 nöron (GFP).
   2. Menü gidin: / Ölçüm Aşmak. "Düzen" sekmesini seçin ve kontrol "belirli Kanal:" (fotoreseptör kanalı [kırmızı] seçin).
   3. üst tabaka için referans noktaları atayın. Menü gidin: / Aşmak / Ölçüm PoiNTS yeni ölçüm noktaları oluşturmak için. bir üst tabaka olarak M1 tabakasının başlangıcını işaretlemek. Aşağıdaki gibi puan sırası şöyledir: ön-ventral, ekvatoral ön-ekvator, ön, ventral posterior-ventral posterior posterior-ekvator ve merkezi (Şekil 3F); En dendritik süreçleri ile ilişkili olarak merkezi fotoreseptör tanımlar.
   4. Adım 4.2.3 (Şekil 3G) gibi R8 ve R7 katmanları atayın. Üç ayrı ölçüm noktaları adımlar 4.2.3 ve 4.2.4 oluşturulmalıdır.
   5. Her katman için noktaların koordinatlarını ihracat. "" Ayrıntılı "Spesifik Değerler" ve "Position seçin," İstatistik "sekmesini tıklayın;" ve "Dosya Sekme Ekranında İhracat İstatistikleri" ı tıklayın. "Virgülle ayrılmış değerler" olarak kaydet (* .csv).
   6. (Th ve kopyalama ve yapıştırma yeni bir csv dosyasına 27 referans noktalarının koordinatlarını birleştiren - (4.2.4 adım 4.2.3 itibaren) üç CSV dosyaları açmake sipariş Top, R8 ve R7) 'dir. Malzemeleri / Ekipman Tabloya bakınız ve örnek bir dosya biçimini izleyin.

5. Sert cisim ve TPS Doğrusal Olmayan Kayıt

Not: Bu adım, referans sütun dizisi (iv formatında) nörit izlerini kaydetmek ve MIPAV programını kullanarak kayıtlı bir swc dosyası oluşturmak için. Bu bölümde aşağıdaki dosyaları gerektirir: Adım 3,3 rekombine görüntü yığınını (.ids), aşama 4,2 referans noktası dosyası (.csv) ve nörit iz filament dosyası (.iv) adım 4.1.

1. Menü gidin: Eklentiler / Genel / DrosophilaStandardColumnRegistration. "DrosophilaStandardColumnRegistration v6.6.1" penceresi açılacaktır.
2. görüntü dosyaları (.ids), referans noktaları dosyası (.csv), ve filament dosya yükleyin (.iv).
3. kat başına 9 puan seçin.
4. görüntülü nöron (LV / RD veya RV / LD) konumunu seçin.
5. Seç "Sert Üye olve TPS "ve" sırasıyla doğrusal olmayan ve katı cisim kayıt, için sert Kayıt "konulu.
6. Aşağıdaki çıkış dosyaları oluşturmak için "SWC dosyası oluştur" seçeneğini işaretleyin: (.iv) swc biçiminde bir kayıtlı nörit izleme dosyası (tanım için özel malzemeler / Ekipman bakınız), kayıtlı IV dosyası, standart neurite (.txt) koordinatları, dönüştürülmüş koordinatları (.txt), ve kombine görüntü (.ids).
7. swc dosyasının adını değiştirin. dosya adı (adım 1.7) sonuna kadar konumu kısaltmasını uygulayın. Örneğin, sağ medulla ventral yarısında bulunan TM20 nöron # 3 "Tm20_3_RV.swc" kullanın.

Sağ ventral Yapılandırma 6. Standardizasyon

Not: Bu adım, özel komut dosyası kullanarak standart RV (sağ-ventral) yapılandırmaya (swc biçiminde) nörit izlerini dönüştürmek "RV_standardization.m." Burada, senaryo matrisi laboratuvar dilinde yazılmış.giriş swc dosya adları aşağıdaki biçimde olmalıdır: "NeuronName _ Numara _ Yapılandırma .swc" (örneğin, Tm20_3_LV.swc).

1. "RV_standardization.m" komut dosyasını açın.
2. "Kullanıcı girişi" bölümünde aşağıdaki parametreleri düzenleyin:
   1. (Örneğin, TM2, TM20, vs.) numaralandırma olmadan nöronların adlarını yazın "neuron_names."
      NOT: "file_end_in" varsayılan adları içeren dosyaları arar ". _ * Swc," dır ( "*" karakter herhangi bir sayı eşleşen bir joker olan) "_ * swc.". "Swc_file_end_out" varsayılan standardizasyon sonra dosya adının sonuna "_F" katacak "_f.swc" dir.
   2. swc dosyaları "directory_in" olan dizini belirtin. standardize dosyaları "directory_swcout" gidecek dizini belirtin.
3. komut dosyasını çalıştırın.
4. Optional: Kullanım Vaa3D ¹⁴ swc dosyaları görselleştirmek ve dönüşüm doğrulamak için.

7. hesaplayın Dendritik dallanma ve Sonlandırma Frekanslar

Not: Bu adım rijit cisim bir dendritik segmenti sonlandırma olmadan belirli bir uzunluğa ulaşacak olasılık Kaplan-Meier tahmin edicileri hesaplamak için swc dosyaları kayıtlı kullanır. extractDendriticSegmentLengthDistribution ve estimateDendriticSegmentLengthProbability: Bu komut iki Dendritic_Tree_Toolbox işlevlerini kullanır.

1. "Branch_term_P.m" komut dosyasını açın.
2. "Kullanıcı girişi" bölümünde aşağıdaki parametreleri düzenleyin:
   1. "PathToSWCFiles" rijit cisim kayıtlı swc dosyalarının yolunu belirtin (örneğin, / Rigid_Registered_swc /). grafik çıkışını yapacak yolu belirtin "pathToOutput." Nöronlar veya "neuron_names" nöral tip adını belirtin (örneğin, TM2, Tm20, vs.).
3. komut dosyasını çalıştırın; çıkışlar dendritik dallanma ve fesih için Kaplan-Meier tahmini eğrisi vardır.
   NOT: İsteğe bağlı: Kaplan-Meier dendritik bölüm şube veya sona erer yerel olasılık tahminlerini kullanmayı ayıklamak için fonksiyon uydurma yöntemi uygulayın.

8. Konu dendritik milleri ve Katman-spesifik Fesih Dağılımı

Not: Bu adım, bir çubuk grafik gibi farklı medulla katmanları dendritik terminalleri dağılımını çizer. Bu, bir nöronun, nöronlar ya da nöron grupları grubuna uygulanabilir. komut Dendritic_Tree_Toolbox gelen extractDistributionAlongAxis işlevini kullanır.

1. "Layer_term.m" komut dosyasını açın.
2. "Kullanıcı girişi" bölümünde aşağıdaki parametreleri düzenleyin:
   1. "PathToSWCFiles" doğrusal olmayan kayıtlı swc dosyaları içeren dizini belirtin (örneğin, / Non_linear_Registered_swc /). grafik çıkışı için dizini belirtin "pathToOutput." "Neuron_names" (örneğin, TM2, TM20, vs.) nöronların veya nöral tip adını belirtin.
3. öğretici komut dosyasını çalıştırın. Çıktı özel medulla katmanları terminal düğüm orantılı bir histogram olduğunu.

9. Parsel Dendritler düzlemsel Projeksiyon Yönü

Not: Bu adım, bir kutup arsa olarak dendritler düzlemsel projeksiyon yön çizer. komut Dendritic_Tree_Toolbox gelen extractAngularDistribution işlevini kullanır.

1. Senaryoyu aç "Planar_proj.m."
2. "Kullanıcı girişi" bölümünde aşağıdaki parametreleri düzenleyin.
   1. "PathToSWCFiles" (örneğin, / Non_linear_Registered_swc /) doğrusal olmayan kayıtlı swc dosyaları içeren dizini belirtin. grafik çıkışı için dizini belirtin "pathToOutput." adını belirtinnöronlar ya da "neuron_names" (örneğin, TM2, TM20, vb) nöral türleri.
3. komut dosyasını çalıştırın; Çıktı düzlemsel projeksiyon yönde bir kutup komplodur.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Burada sunulan çift görüntüleme görüntüleme prosedürü kullanarak, seyrek etiketli TM20 nöron içeren bir sinek beyin iki dik yönde görüntülendi. görüntüleme öncesi, beyin, zara bağlı GFP ve fotoreseptör aksonlar görselleştirmek için uygun birincil ve ikincil antikor ile boyandı. Görüntüleme için, beyin birinci yatay yönde monte edilmiştir (Şekil 2A, B). GFP-etiketli TM20 nöron ve çevresindeki fotoreseptör aksonlar konfokal mikroskop

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Burada, nasıl görüntü ve Drosophila medulla nöronların dendritik milleri analiz göstermektedir. Birinci bölüm, çift görüntüleme görüntüleme, yüksek çözünürlüklü görüntü yığını haline dekonvulasyon ve iki görüntü yığınlarının kombinasyonunu açıklar. İkinci bölüm, dendrit izleme ve kayıt, referans sütun dizisine medulla nöronların Dendritlerin izleme ve kayıt açıklar. Üçüncü bölüm, dendritik analizi, dendritik kalıpları analiz etmek için özel komut kulla...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
Huygens Professional	Scientific Volume Imaging	version 16.05	for image deconvolution (https://svi.nl).  commercial software
MIPAV		version 7.3.0	for image recombination and registration (http://mipav.cit.nih.gov/); freeware
MIPAV plugin: PlugInDrosophila RetinalRegistration.class			freeware
MIPAV plugin: PlugInDrosophilaStandard ColumnRegistration.class			freeware
Imaris	Bitplane		for tracing neurites and assigning reference points for image registration (http://www.bitplane.com); commercial software
Vaa3D			for visualizing swc files (https://github.com/Vaa3D/release/releases/); freeware
Matlab	Mathworks	R2014b	for morphometric analysis of dendrites (http://www.mathworks.com); commercial software
Matlab toolbox: TREES1.14		v1.14	for analyzing dendritic morphometric parameters (http://www.treestoolbox.org/download.html); freeware
Matlab toolbox: Dendritic_Tree_Toolbox		v1.0	For calculating morphometric parameters (https://science.nichd.nih.gov/confluence/display/snc/Data+collections+for+imagines+combination+and+standardize+column+registration). Freeware
Name	Company	Catalog number	Comments
Sample files
SWC file definition			http://www.neuronland.org/NLMorphologyConverter/MorphologyFormats/SWC/Spec.html
The codes and sample files for image combination and registration			https://science.nichd.nih.gov/confluence/display/snc/Data+collections+for+imagines+combination+and+standardize+column+registration
Reference point example			https://science.nichd.nih.gov/confluence/download/attachments/117216914/points.csv?version=1&modificationDate= 1471880596000&api=v2
Name	Company	Catalog number	Comments
Computer system
MS Windows Windows 7 x64 or Macintosh OS X 10.7 or later			3GHz 64-bit quad-core processor, 16G RAM (minimal)
Optional: Quadro4000  (or above) graphic card	Nvidia		for stereographic visualization of dendrites.
Optional: NVIDIA 3D vision2	Nvidia		http://www.nvidia.com/object/3d-vision-main.html
Optional: 120 Hz LCD display for NVIDIA 3D vision2			http://www.nvidia.com/object/3d-vision-system-requirements.html
Name	Company	Catalog number	Comments
Reagents for imaging
24B10 antibody	The Developmental Studies Hybridoma Bank	24B10
GFP Tag Antibody	Thermofisher Scientific	G10362
Goat anti-Rabbit (H+L), Alexa Fluor 488	Thermofisher Scientific	A11034
Goat anti-Mouse (H+L), Alexa Fluor 568	Thermofisher Scientific	A21124
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1000
Mounting Clay	Fisher	S04179
70% glycerol in 1x PBS
Cover glasses, high performance, D = 0.17 mm	Zeiss	474030-9000-000