A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
* These authors contributed equally
في هذا العمل، نحن تقرير أسلوب جديد لدراسة تفاعلات البروتين البروتين استخدام بيوسينسور كوندوكتيميتريك على أساس تكنولوجيا β-lactamase الهجين. ويعتمد هذا الأسلوب على الإفراج عن البروتونات عند التحلل من β-لاكتامس.
أجهزة استشعار العوامل البيولوجية تزداد أهمية وتنفيذها في مختلف الميادين مثل الكشف عن مسببات المرض والتشخيص الجزيئي، والرصد البيئي، ومراقبة سلامة الأغذية. وفي هذا السياق، استخدمنا lactamases بيتا كمراسل كفاءة الإنزيمات في عدة دراسات التفاعل البروتين-بروتين. وعلاوة على ذلك، تشجع قدرتها على قبول الملاحق من الببتيدات أو منظم البروتينات/المجالات بشدة استخدام هذه الإنزيمات لتوليد بروتينات تشيميريك. في دراسة أجريت مؤخرا، ونحن إدراج جزء من جسم مجال واحد في بلاب Bacillus ليتشينيفورميس β-lactamase. يتم تعريف هذه المجالات الصغيرة، وتسمى أيضا نانوبوديس، كنطاقات مستضد ملزمة للأجسام المضادة واحد في سلسلة من الإبليات. وتظهر مثل الأجسام المضادة المشتركة لسلسلة مزدوجة، الانتماءات عالية والخصوصيات لأهدافها. معارضها البروتين تشيميريك الناتجة من تقارب عالية ضد هدفه مع الاحتفاظ بالنشاط β-lactamase. وهذا يوحي أن تظل مويتيس نانوبودي و β-lactamase الوظيفية. في هذا العمل، نحن تقرير بروتوكول مفصل الذي يجمع بين نظامنا β-lactamase الهجين للتكنولوجيا بيوسينسور. ويمكن الكشف عن ملزمة محددة من نانوبودي إلى هدفها بفضل مقياس كوندوكتيميتريك للبروتونات الصادرة عن نشاط الإنزيم الحفاز.
أجهزة استشعار العوامل البيولوجية هي الأجهزة التحليلية التي تجمع تفاعل الحيوي جزيئي مع أجهزة إرسال الإشارات الفيزيائية أو الكيميائية المشار إليها كمحولات الطاقة1. يمكن تفسير الإشارات المسجلة وتحويلها إلى رصد التفاعلات بين الشركاء المعطل تداولها ومجانا. معظم أجهزة استشعار العوامل البيولوجية تنطوي على استخدام جسم مضاد للكشف عن تحليلها مثل الهرمونات أو علامات الممرض مختلفة2. تنسيقات استشعار مختلفة يمكن استخدامها، وتشمل هذه الأجهزة المستندة إلى كتلة أو مغناطيسية، بصرية أو الكهروكيميائية. هذه الأخيرة هي من بين الأكثر شيوعاً المستخدمة في أجهزة الاستشعار، وتعمل عن طريق تحويل حدث ملزم إلى إشارة كهربائية. الأداء والحساسيات جميع هذه الأجهزة المستندة إلى جسم تعتمد بشدة على أساسا معلمتين من معلمات: ط) نوعية الجسم والثاني) خصائص النظام المستخدمة لتوليد إشارة2.
الأجسام المضادة هي بروتينات dimeric كتلة عالية-الجزيئية (150 – 160 كاتشين) التي تتألف من اثنين من سلاسل ثقيلة واثنين من سلاسل خفيفة. واستقرت بالتفاعل بين السلاسل الخفيفة والثقيلة معظمها التفاعلات مسعور، فضلا عن سندات ثنائي كبريتيد مصانة. ويشمل كل سلسلة متغير مجال الذي يتفاعل مع مستضد أساسا عبر ثلاث مناطق هايبرفاريابل اسمه "مكملة تحديد المناطق" (CDR1-2-3). وعلى الرغم من العديد من التطورات في هذا المجال، التعبير على نطاق واسع من أجسام كاملة الطول مع أنظمة تعبير منخفضة التكلفة (مثل كولاي) غالباً ما يؤدي إلى إنتاج بروتينات غير مستقرة ومجمعة. وهذا السبب في مختلف أجزاء جسم قد تم إجراء هندسة عكسية مثل متغير واحد-سلسلة الأجزاء3 (سكففس ≈ كاتشين 25). وهي تتألف من مجالات متغير واحد على التوالي الثقيلة وسلاسل خفيفة واحدة مرتبطة تساهميا بتسلسل الأحماض الأمينية اصطناعية. بيد أن هذه الشظايا غالباً ما تعرض استقرار فقراء ولديهم ميل لتجميع، نظراً لأنها تعرض جزء كبير من مناطقها مسعور ل المذيبات4. وفي هذا السياق، يبدو أن سلسلة واحدة الكامليد جسم الشظايا، يشار إلى نانوبوديس أو فحص، بدائل ممتازة سكففس. تتوافق هذه المجالات إلى مجالات متغير من الأجسام المضادة أحادية السلسلة الكامليد. على النقيض من الأجسام المضادة التقليدية، الأجسام المضادة الكامليد تخلو من سلاسل خفيفة وتحتوي فقط على اثنين من سلاسل ثقيلة5. ولذلك، نانوبوديس هي أصغر جسم أحادي الأجزاء (12 كاتشين) قادرة على ربط مستضد مع تقارب مماثل للأجسام المضادة التقليدية6. وباﻹضافة إلى ذلك، فإنها تعرض تحسين الاستقرار والقابلية للذوبان في مقارنة بغيرها طول الأجسام المضادة أو أجزاء جسم. أخيرا، أحجام صغيرة وعلى الحلقات CDR3 الموسعة يسمح لهم بالاعتراف بخفي [ابيتوبس] وربط إنزيم مواقع نشطة7،8. في الوقت الحاضر، هذه المجالات التي تحظى باهتمام كبير وتضافرت للتكنولوجيا بيوسينسور. على سبيل المثال، هوانغ وآخرون. وقد وضعت بيوسينسور على أساس نانوبودي للكشف والتحديد الكمي للبشرية مستضد البروستات محددة (PSA)9.
كما ذكر أعلاه، هو معياراً هاما في فحوصات biosensor كفاءة النظام المستخدمة لتوليد إشارة كهربائية. ولهذا السبب، المستندة إلى إنزيم أجهزة الاستشعار الكهروكيميائية تجتذب اهتماما متزايداً، وقد استخدمت على نطاق واسع لمختلف التطبيقات مثل الرعاية الصحية والسلامة الغذائية، والرصد البيئي. أجهزة الاستشعار هذه تعتمد على التحلل الحفاز من الركازة بإنزيم لتوليد الإشارة الكهربائية. وفي هذا السياق، عرضت β-لاكتاماسيس أن تكون أكثر تحديداً، وأكثر حساسية وأسهل في التنفيذ تجريبيا من العديد من الإنزيمات الأخرى مثل الفوسفاتيز القلوية أو الفجل البيروكسيديز10. Β-lactamases هي الإنزيمات التي المسؤولة عن مقاومة الجراثيم للمضادات الحيوية بيتا لاكتام التي هيدروليزينج لهم. وهم أحادي، ومستقرة جداً، والكفاءة، وصغيرة الحجم. وعلاوة على ذلك، تولد الملاحق المجال/الببتيد إلى β-lactamases البروتينات تشيميريك ثنائية-الوظائف التي عرضت أن تكون أدوات فعالة لدراسة تفاعلات البروتين-يجند. في الواقع، أظهرت دراسات أجريت مؤخرا أن إدراج أجزاء جسم متغير في نتائج β-lactamase TEM1 في بروتين تشيميريك التي ما زالت قادرة على ربط مع تقارب عالية على مستضد المستهدفة به. من المثير للاهتمام، والربط مستضد أبدى للحث على تنظيم نشاط الحفاز TEM111،12اللوستيريك. وعلاوة على ذلك، أظهرت أننا في العديد من الدراسات أن الإدراج المجال البروتين في حلقة متساهلة من Bacillus ليتشينيفورميس بلاب β-lactamase يولد البروتينات تشيميريك الوظيفية التي مناسبة تماما لرصد تفاعلات البروتين-يجند13 ،14. ونحن مؤخرا إدراج نانوبودي، اسمه كاب-Lys3، في هذا الموقع الإدراج المتساهلة بلاب15. وأبدى هذا نانوبودي لربط lysozyme الدجاجة-البيض-أبيض (هول) وكبح النشاط الأنزيمي16. لقد أظهرنا أن البروتين الهجين الذي تم إنشاؤه، اسمه بلاب-كاب-Lys3، الاحتفاظ خصوصية عالية/تقارب ضد هول بينما ظل النشاط β-lactamase بدون تغيير. ثم أننا بنجاح الجمع بين التكنولوجيا الهجينة β-lactamase إلى biosensor الكهروكيميائية وأظهر أنه يعتمد التفاعل بين بلاب-كاب-Lys3 وهول معطلة في قطب كمية الإشارات الكهربائية التي تم إنشاؤها. وفي الواقع، يدفع التحلل من المضادات الحيوية بيتا لاكتام بلاب بيان بروتون التي يمكن تحويلها إلى إشارة كهربائية كمية. هذا المزيج من التكنولوجيا الهجينة β-lactamase مع biosensor الكهروكيميائية سريعة وحساسة، الكمية، ويتيح قياس الإشارات التي تم إنشاؤها في الوقت الحقيقي. ويرد وصف هذه المنهجية هنا.
1-إعداد نموذج البروتين
2. فحوصات بيوسينسور
التصميم والهندسة للبروتين تشيميريك بلاب-كاب-Lys3
ويمثل الرقم 1 إدراج Lys3 سيارة الأجرة في حلقة متساهلة من الفئة أ بالب β-lactamase من Bacillus ليتشينيفورميس. وأجرى الإدراج بين بقايا Asp198 و Lys199. وعرض موقع انقسام ثرومبين على كل جانب من Lys3 سيارة أجرة. ا?...
في هذا العمل نقدم طريقة فونكتيوناليزي نانوبودي استخدام بلاب β-lactamase بروتين الناقل ونظهر أن يمكن أن ننفذ البروتين الهجين الناتجة بنجاح في مقايسة استشعار فرق الجهد. الجانب الابتكار الرئيسي لعملنا مقارنة بغيرها فحوصات بيوسينسور هو اقتران التساهمية الجزء الأجسام المضادة للنشاط الأنزيمي ال?...
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
يعترف أصحاب المنطقة الفالونية لبلجيكا في إطار مشاريع البحوث سينسوتيم ونانوتيك وكذلك الوطنية الأموال للبحث العلمي (F.R.S.-F.N.R.S) لتقديم الدعم المالي.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Reagents | |||
KH2PO4 | Sigma-Aldricht | V000225 | |
K2HPO4 | Sigma-Aldricht | 1551128 | |
NaCl | Sigma-Aldricht | S7653 | |
Tris–HCl | Roche | 10812846001 | |
EDTA | Sigma-Aldricht | E9884 | |
KCl | Sigma-Aldricht | P9541 | |
Na2HPO4 | Sigma-Aldricht | NIST2186II | |
2-mercaptoethanol | Sigma-Aldricht | M6250 | |
alanine | Sigma-Aldricht | A7627 | |
HClO4 | Fluka | 34288 | 1M HClO4 solution, distributor : Sigma-Aldricht |
casein hydrolysate | Sigma-Aldricht | 22090 | |
benzylpenicillin sodium | Sigma-Aldricht | B0900000 | |
hen egg white lysozyme | Roche | 10837059001 | |
heptane | Sigma-Aldricht | 246654 | |
methanol | Sigma-Aldricht | 322415 | |
ammonium hydroxide solution | Sigma-Aldricht | 380539 | 28% NH3 in H2O, purified by double-distillation (concentrated?) |
Laboratory consumables | |||
6-well plate | Greiner Bio-One | 657165 | CELLSTAR 6-Well Plate |
Equipment | |||
pH meter | WTW | 1AA110 | Lab pH meter inoLab pH 7110 |
vacuum and filtration system | Nalgene | NALG300-4100 | Filter holders with receiver, distributor : VWR |
potentiometric sensor chips | manufactured by Yunus and colleagues (ref 16) | ||
PGSTAT30 Autolab | Metrohm Autolab | discontinued, succesor Autolab PGSTAT302N | |
digital multimeter, METRAHit 22M | Gossen Metrawatt | discontinued, successor Metrahit Base |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved