El uso de un análisis de biosensores conductimétricos β-lactamase-base para detectar las interacciones biomoleculares

Resumen

En este trabajo se presenta un nuevo método para estudiar las interacciones de la proteína-proteína usando un biosensores conductimétricos basados en la tecnología híbrida de β-lactamasa. Este método se basa en la liberación de protones al producirse la hidrólisis de β-lactámicos.

Resumen

Biosensores son cada vez más importante y puesto en ejecución en varios campos tales como la detección de patógenos, diagnóstico molecular, monitoreo ambiental y control de la seguridad alimentaria. En este contexto, usamos β-lactamasas como enzimas reportero eficaz en varios estudios de interacción de proteínas. Además, su capacidad para aceptar las inserciones de péptidos o dominios de proteínas estructurados fuertemente alienta el uso de estas enzimas para generar proteínas quiméricas. En un estudio reciente, inserta un fragmento de anticuerpo único dominio en el Bacillus licheniformis BlaP β-lactamase. Estos dominios pequeños, también llamados nanobodies, se definen como los dominios de unión a antígeno de anticuerpos de cadena única de camélidos. Como el común de los anticuerpos de doble cadena, presentan alta afinidad y especificidad para sus blancos. La proteína quimérica resultante exhibió una alta afinidad contra su destino conservando la actividad de β-lactamasa. Esto sugiere que las moléculas nanobody y β-lactamasa siguen siendo funcionales. En el presente trabajo, se presenta un protocolo detallado que combina nuestro sistema híbrido de β-lactamasa a la tecnología de biosensores. La unión específica de la nanobody a su objetivo puede ser detectada gracias a una medición conductimétricos de los protones liberados por la actividad catalítica de la enzima.

Introducción

Biosensores son dispositivos analíticos que combinan una interacción bio-molecular con dispositivos de señalización físicos o químicos denominados transductores¹. Las señales registradas se pueden interpretar y convertidas para monitorear las interacciones entre las partes inmovilizadas y libres. La mayoría de los biosensores incluyen el uso de un anticuerpo para detectar analitos tales como hormonas o patógeno diferentes marcadores². Formatos de sensor diferente pueden utilizarse e incluyen biosensores basados en la masa, magnéticos, ópticos o electroquímicos. Estos últimos están entre los más comúnmente usados sensores y funcionan mediante la conversión de un evento de enlace en una señal eléctrica. Las actuaciones y sensibilidades de todos los biosensores basados en anticuerpos son fuertemente dependientes en básicamente dos parámetros: i) la calidad de los anticuerpos y ii) las características del sistema utilizado para generar la señal².

Los anticuerpos son proteínas dimérica masa molecular alta (150-160 kDa) que se componen de dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras. La interacción entre las cadenas pesadas y ligeras sobre todo se estabiliza por interacciones hidrofóbicas, así como un enlace de disulfuro conservado. Cada cadena incluye un dominio variable que interactúa con el antígeno esencialmente a través de tres regiones hipervariables denominado regiones determinación complementarias (CDR1-2-3). A pesar de numerosos avances en el campo, la expresión a gran escala de anticuerpos completos con sistemas de expresión de bajo costo (por ejemplo, e. coli) a menudo conduce a la producción de proteínas inestables y agregadas. Por esta razón varios fragmentos de anticuerpos han sido diseñados como fragmentos de cadena simple variable³ (ScFvs ≈ 25 kDa). Consisten en los dominios variables de respectivamente una pesada y una cadenas ligeras que son covalente por una secuencia de aminoácido sintético. Sin embargo, estos fragmentos a menudo mostrar una estabilidad pobre y tienen la tendencia a agregado, dado que expone gran parte de sus regiones hidrofóbicas al solvente⁴. En este contexto, fragmentos de anticuerpos de camélidos de cadena única, denominadas nanobodies o VHHs, parecen ser excelentes alternativas de ScFvs. Estos dominios corresponden a los dominios variables de anticuerpos de cadena simple de camélidos. En contraste con anticuerpos convencionales, camélidos anticuerpos están desprovistos de las cadenas ligeras y sólo contienen dos cadenas pesadas⁵. Por lo tanto, nanobodies son el más pequeño monomérica fragmentos de anticuerpos (12 kDa) capaces de unirse a un antígeno con una afinidad similar a la de anticuerpos convencionales⁶. Además, presentan mayor estabilidad y solubilidad en comparación con otros anticuerpos completos o fragmentos de anticuerpos. Por último, sus pequeños tamaños y sus extendidos lazos CDR3 les permiten reconocer epítopes crípticos y se unen a la enzima sitios activos^7,8. Hoy en día, estos dominios están recibiendo considerable atención y se han combinado a la tecnología de biosensores. Por ejemplo, Huang et al. han desarrollado un biosensor basado en nanobody para la detección y cuantificación de antígeno específico de la próstata humana (PSA)⁹.

Como mencionado por encima, un parámetro importante en los ensayos de biosensor es la eficiencia del sistema utilizado para generar la señal eléctrica. Por esta razón, base enzimática biosensores electroquímicos han atraído cada vez más y se han utilizado ampliamente para diversas aplicaciones tales como salud, seguridad alimentaria y vigilancia del medio ambiente. Estos biosensores se basan en la hidrólisis catalítica de un substrato por una enzima para generar la señal eléctrica. En este contexto, β-lactamasas fueron demostrados para ser más específicos, más sensibles y fáciles de aplicar experimentalmente que muchas otras enzimas tales como fosfatasa alcalina o peroxidasa de rábano picante¹⁰. Β-lactamasas son enzimas que son responsables de la resistencia bacteriana a los antibióticos β-lactámicos por les hidrolización. Son monoméricos, muy estable, eficiente y de pequeño tamaño. Por otra parte, las inserciones de dominio/péptido en β-lactamasas generan proteínas quiméricas bifuncional que mostraron ser eficientes herramientas para el estudio de las interacciones proteína-ligando. De hecho, estudios recientes han demostrado que la inserción de fragmentos variables de anticuerpos en los resultados de β-lactamasa TEM1 en una proteína quimérica que sigue siendo capaz de unirse con alta afinidad a su antígeno de la blanco. Curiosamente, el atascamiento del antígeno fue demostrado para inducir la regulación alostérica de la actividad catalítica de TEM1^11,12. Además, hemos demostrado en varios estudios que la inserción de dominio de proteína en forma permisiva de bucle de la β-lactamasa de Bacillus licheniformis BlaP genera proteínas quiméricas funcionales que se adaptan bien a monitorizar las interacciones proteína-ligando^{13 ,14}. Recientemente hemos insertado un nanobody, denominado taxi-Lys3, en este sitio de inserción permisiva de BlaP¹⁵. Este nanobody fue demostrado para enlazar a la lisozima de clara de huevo de gallina (HEWL) y para inhibir su actividad enzimática¹⁶. Demostramos que la proteína híbrida generada, llamada BlaP-cAb-Lys3, conserva una especificidad alta / afinidad contra HEWL mientras que la actividad de β-lactamasa se mantuvo sin cambios. Luego con éxito combina la tecnología híbrida de β-lactamasa para un biosensor electroquímico y demostró que la cantidad de señal eléctrica generada era dependiente de la interacción entre BlaP-cAb-Lys3 y HEWL inmovilizada en un electrodo. De hecho, hidrólisis de β-lactámicos por BlaP inducen una liberación de protones que se puede convertir en una señal eléctrica cuantitativa. Esta combinación de la tecnología híbrida de β-lactamasa con un biosensor electroquímico es rápida, sensible y cuantitativo y permite la medición en tiempo real de la señal generada. Esta metodología se describe en este documento.

Protocolo

1. preparación de la muestra de proteína

1. Producir y purificar la proteína híbrida BlaP-cAb-Lys3 como se informó en nuestro anterior estudio¹⁵. Almacenar la proteína en 50 m m tampón fosfato pH 7,4 con la siguiente composición: 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na₂HPO₄ , 8 g de NaCl y 0.24 g de KH₂PO₄ disueltos en 800 mL de agua destilada el pH de la solución a 7.4 antes de fijan ajustar el volumen final de la solución a 1 L. filtro esterilizar la solución de proteína.
2. Preparar una solución de reserva de lisozima (HEWL) de huevo de gallina. Disolver 100 mg (40.000 unidades/mg) de HEWL comercialmente comprado en 10 mL de solución salina buffer fosfato (PBS ver paso 2.1.1). Esterilizar la solución de la proteína por filtración utilizando filtros con un corte de 0.22 μm.

2. biosensor ensayos

1. Preparación de la solución y buffer
   1. Preparar 50 mM PBS disolviendo 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na₂HPO₄y 0.24 g de KH₂PO₄ en 800 mL de agua destilada. Ajustar a pH 7,4 con 1 N HCl o NaOH N 1 antes de ajustar el volumen de la solución a 1 L. filtro esterilizar y almacenar a 4 ° C.
   2. Preparar una solución de saturación/bloqueo disolviendo 3 g de hidrolizado de caseína en 100 mL de PBS, preparado como se describió anteriormente (ver paso 2.1.1). Filtro de esterilizar y almacenar a 4 ° C.
   3. Preparar una solución vinculante disolviendo 1 g de hidrolizado de caseína en 100 mL de PBS, preparado como se describió anteriormente (ver paso 2.1.1). Filtro de esterilizar y almacenar a 4 ° C.
   4. Preparar una solución de lavado (0,1% Tween - PBS) mediante la adición de 100 μL de Tween 20 (100%) en 100 mL de PBS, preparado como se describió anteriormente (ver paso 2.1.1). Almacenar a 4 ° C.
   5. Preparar una solución de preparación del electrodo (1% Tritón X-100-PBS) Añadir 1 mL de Tritón X-100 (100%) en 100 mL de PBS, preparado como se describió anteriormente (ver paso 2.1.1). Almacenar a 4 ° C.
   6. Preparar una solución de regeneración de electrodos (3, 5 M KCl) disolviendo 26 g de KCl en agua destilada hasta un volumen final 100 mL. Filtro esterilizado y almacenar a 4 ° C.
   7. Preparar una solución de NaCl de 5 mM por disolución 0,29 g de NaCl en agua destilada hasta un volumen final de 1 L. filtro esterilizar y almacenar a 4 ° C. Luego, prepare una solución de detección (4 mM bencilpenicilina) disolviendo 26,7 mg de benzilpenicilina en 20 mL de solución de NaCl de 5 mM. Filtro de esterilizar y almacenar a-20 ° C.
2. Regeneración y preparación del sensor
   Nota: La polianilina cubierta sensor chips fueron desarrollados y proporcionados amablemente por el Dr. P. Bogaerts, Dr. S. Yunus y Prof. Y. Glupczynski (católico Universidad de Louvain-la-Neuve - CHU Mont-Godinne). La descripción del sensor así como los protocolos de la polimerización de electro de polianilina usados para sintetizar estos sensores se detallan en su anterior trabajo¹⁷. Brevemente, este sistema utiliza sensores reutilizables de ocho fichas individuales que fueron fabricados por técnicas de clásicos del circuito impreso (PWB). Fichas individuales se componen de tres electrodos redondos puntos. La superior es el electrodo de trabajo el cual polianilina fue sintetizado con electro. El medio es el electrodo de referencia y el electrodo inferior constituye el contraelectrodo. Tanto, la referencia y los electrodos de contador son funcionalizados con amalgama de Ag/AgCl sólido sobre la capa de carbón.
   1. Realizar 3 lavados de los electrodos sumergiendo las puntas en los pocillos de una placa de 96 pocillos con 300 μL/pocillo de solución de preparación del electrodo (ver de 1% Tritón X-100-PBS, paso 2.1.5.). Realizar cada lavado durante 2 min con mezcla suave a temperatura ambiente.
   2. Enjuague los electrodos sumergiendo las puntas en los pocillos de una placa de 96 pocillos con 300 μL/pocillo de agua destilada por 2 min con mezcla suave a temperatura ambiente.
   3. Regenerar los electrodos sumergiendo las puntas en los pocillos de una placa de 96 pocillos con 300 μL/pocillo de la solución de regeneración (3.5 M KCl, ver paso 2.1.6) durante la noche a 4 ° C o 1 h a temperatura ambiente.
   4. Realizar 3 lavados de los electrodos sumergiendo las puntas en los pocillos de una placa de 96 pocillos con 300 μL/pocillo de solución salina buffer fosfato (vea el paso 2.1.1.). Realizar cada lavado durante 2 minutos con una mezcla suave a temperatura ambiente.
3. Vinculante el análisis realizado en el sensor
   1. Capa HEWL sobre la superficie PANI (polianilina) del electrodo depositando una gota de 15 μl de 40 μg/mL HEWL preparado en PBS sobre la superficie del electrodo. Incubar durante una noche a 4 ° C o 1 hora a temperatura ambiente.
   2. Realizar tres lavados de los electrodos con una solución buffer fosfato (ver paso 2.1.1) sumergiendo las piezas de electrodo de los chips de sensores en los pocillos de una placa de 96 pocillos con 300 μL/pocillo de solución salina buffer fosfato. Realizar cada lavado durante 2 min con mezcla suave a temperatura ambiente.
   3. Saturar los electrodos mediante la adición de una gota de 50 μl de la solución de bloqueo (ver paso 2.1.2) sobre la superficie del electrodo. Incubar durante 1 h a temperatura ambiente. A continuación, lave tres veces como se describe en el anterior paso (ver paso 2.3.2).
   4. Diluir la solución BlaP-cAb-Lys3 a 20 μg/mL en solución de encuadernación (véase el paso 2.1.3) y aplique una gota de 15 μl de esta solución diluida en los electrodos. Incubar 10 min a temperatura ambiente. Después de la reacción antígeno-nanobody, lave tres veces como se describe en el paso anterior utilizando la solución de lavado (ver paso 2.1.4). Luego enjuague el electrodo una vez con PBS (ver paso 2.1.1).
   5. Para la detección, enchufe la viruta del sensor a través de la parte del circuito de cobre a un multímetro digital. A continuación, iniciar la respuesta del sensor mediante la aplicación de una gota de 50 μl de la solución de detección (ver paso 2.1.7) hacia los electrodos positivos y la aplicación de una gota de 50 μl de solución de NaCl al 5 mM sobre los electrodos negativos (ver paso 2.1.7). Incubar durante 30 min a temperatura ambiente. Monitor de la conductancia con un multímetro digital.
      Nota: El multímetro fue proporcionado por el Dr. P. Bogaerts, Dr. S. Yunus y Prof. Y. Glupczynski (Universidad Católica de Lovaina-la-nueva - CHU Mont-Godinne. Este potenciostato está controlado por ordenador mediante un puerto USB y analiza simultáneamente las ocho diversas virutas del sensor. El software creado por Yunus y colaboradores¹⁷ crea un trazado en tiempo real que representa la medición de la diferencia de conductancia entre los electrodos de referencia y muestra contra el tiempo.

Resultados

Diseño e ingeniería de la proteína quimérica BlaP-cAb-Lys3

La figura 1 representa la inserción de cabina Lys3 en un bucle permisiva de la BalP clase A β-lactamase del bacilo licheniformis. La inserción se realizó entre residuos Asp198 y Lys199. Un sitio de la hendidura de la trombina fue introducido a cada lado de la cabina-Lys3. Las células transformadas con un plásmido de expresión constitutiva codificando la ...

Discusión

En este trabajo presentamos un método para funcionalizar un nanobody utilizando la BlaP β-lactamasa como una proteína portadora y mostramos que podemos implementar con éxito la proteína híbrida resultante en un ensayo de sensor potenciométrico. El aspecto de innovación principal de nuestro trabajo en comparación con otros ensayos de biosensor es el acoplamiento covalente de la parte del anticuerpo a la actividad enzimática que genera la señal eléctrica. Esta tecnología de inserción de proteína llamada pres...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
KH2PO4	Sigma-Aldricht	V000225
K2HPO4	Sigma-Aldricht	1551128
NaCl	Sigma-Aldricht	S7653
Tris–HCl	Roche	10812846001
EDTA	Sigma-Aldricht	E9884
KCl	Sigma-Aldricht	P9541
Na2HPO4	Sigma-Aldricht	NIST2186II
2-mercaptoethanol	Sigma-Aldricht	M6250
alanine	Sigma-Aldricht	A7627
HClO4	Fluka	34288	1M HClO4 solution, distributor : Sigma-Aldricht
casein hydrolysate	Sigma-Aldricht	22090
benzylpenicillin sodium	Sigma-Aldricht	B0900000
hen egg white lysozyme	Roche	10837059001
heptane	Sigma-Aldricht	246654
methanol	Sigma-Aldricht	322415
ammonium hydroxide solution	Sigma-Aldricht	380539	28% NH3 in H2O, purified by double-distillation (concentrated?)
Laboratory consumables
6-well plate	Greiner Bio-One	657165	CELLSTAR 6-Well Plate
Equipment
pH meter	WTW	1AA110	Lab pH meter inoLab pH 7110
vacuum and filtration system	Nalgene	NALG300-4100	Filter holders with receiver, distributor : VWR
potentiometric sensor chips			manufactured by Yunus and colleagues (ref 16)
PGSTAT30 Autolab	Metrohm Autolab		discontinued, succesor Autolab PGSTAT302N
digital multimeter, METRAHit 22M	Gossen Metrawatt		discontinued, successor Metrahit Base