Die Verwendung eines β-Lactamase-basierte Conductimetric Biosensor-Assays, biomolekulare Wechselwirkungen zu erkennen

Zusammenfassung

Dabei berichten wir über eine neue Methode, um Protein-Protein-Interaktionen mit Hilfe eines conductimetric Biosensors basierend auf die β-Lactamase-Hybridtechnologie zu studieren. Diese Methode beruht auf der Freisetzung von Protonen bei der Hydrolyse des β--Lactame.

Zusammenfassung

Biosensoren werden immer wichtiger und implementierte in verschiedenen Bereichen wie Erregernachweis, molekulare Diagnostik, Umweltüberwachung und Kontrolle der Lebensmittelsicherheit. In diesem Zusammenhang wird β-Lactamases als effiziente Reporter Enzyme in mehreren Studien der Protein-Protein-Interaktion verwendet. Darüber hinaus fördert ihre Fähigkeit, Einfügungen von Peptiden oder strukturierte Proteine/Domains stark anzunehmen die Nutzung dieser Enzyme um Chimären Proteinen zu erzeugen. In einer aktuellen Studie einer einzelnen Domäne Antikörper-Fragment in der Bacillus Licheniformis BlaP β-Lactamase eingelegt werden. Diese kleinen Domänen, auch genannt Nanobodies, gelten als Antigen-bindenden Domänen einzelne Kette Antikörper von Camelids. Wie üblich Doppelkette Antikörper zeigen sie hohen Affinitäten und Besonderheiten für ihre Ziele. Das daraus resultierende Chimäre Protein ausgestellt eine hohe Affinität gegen sein Ziel unter Beibehaltung der β-Lactamase-Aktivität. Dies deutet darauf hin, dass die gemeinnützige und β-Lactamase Moieties funktionsfähig bleibt. In der vorliegenden Arbeit berichten wir ein detailliertes Protokoll, das unsere Hybrid-β-Lactamase-System der Biosensor-Technologie kombiniert. Die spezifische Bindung der gemeinnützige Ziel kann dank einer conductimetric Messung der Protonen durch die katalytische Aktivität des Enzyms freigegeben erkannt werden.

Einleitung

Biosensoren sind analytische Geräte, die eine Bio-molekulare Interaktion mit physikalischen oder chemischen Signalgeber als Wandler¹kombinieren. Die aufgezeichneten Signale können dann interpretiert und umgewandelt, um die Wechselwirkungen zwischen den freien und immobilisierten Partnern zu überwachen. Die meisten der Biosensoren beinhalten die Verwendung eines Antikörpers Analyten wie Hormone oder andere Erreger Marker²zu erkennen. Anderen Sensor-Formate können verwendet werden und sind Masse-basierte, magnetische, optische oder elektrochemische Biosensoren. Letztere gehören zu den am häufigsten verwendeten Sensoren und Funktion durch eine verbindliche Veranstaltung in ein elektrisches Signal umwandeln. Die Aufführungen und Empfindlichkeiten aller Antikörper-basierten Biosensoren sind stark abhängig von im Wesentlichen zwei Parameter: (i) die Qualität des Antikörpers und (Ii) die Eigenschaften des Systems verwendet, um das Signal²zu generieren.

Antikörper sind hochmolekulare Masse dimeres Proteine (150 – 160 kDa), die aus zwei schweren Ketten und zwei leichten Ketten bestehen. Die Interaktion zwischen den leichten und schweren Ketten wird meist durch hydrophobe Wechselwirkungen sowie eine konservierte Disulfid Bindung stabilisiert. Jede Kette enthält eine Variable Domäne, die mit dem Antigen im Wesentlichen über drei hypervariablen Regionen benannt ergänzende Bestimmung Regionen (CDR1-2-3) interagiert. Trotz der zahlreichen Fortschritte auf dem Gebiet der großen Ausdruck in voller Länge Antikörper mit kostengünstigen Expressionssysteme (z. B. E. Coli) führt oft zu der Produktion von instabilen und aggregierte Proteine. Deshalb verschiedene Antikörperfragmente entwickelt haben, wie z. B. Single-Chain Variable³ (ScFvs ≈ 25 kDa) Fragmente. Sie bestehen aus den Variablen Domänen von bzw. einem schweren und einem leichten Ketten, die durch eine synthetische Aminosäure-Sequenz kovalent verknüpft sind. Aber diese Fragmente häufig zeigen eine schlechte Stabilität und haben die Tendenz zu aggregieren, da sie einen Großteil ihrer hydrophoben Region zu Lösungsmittel⁴aussetzen. In diesem Zusammenhang scheinen einzelne Kette Kameliden Antikörperfragmente, genannt Nanobodies oder FHKW, hervorragende Alternativen zu ScFvs. Diese Domains entsprechen den Variablen Domänen der Kameliden Single-Kette Antikörper. Im Gegensatz zu herkömmlichen Antikörper Kameliden Antikörper sind frei von Lichterketten und enthalten nur zwei schwere Ketten⁵. Nanobodies sind daher die kleinste Monomeren Antikörperfragmente (12 kDa) Antigen ähnlich dem des herkömmlichen Antikörper⁶Affinität binden. Darüber hinaus präsentieren sie verbesserte Stabilität und Löslichkeit im Vergleich zu anderen Full-length Antikörper oder Antikörperfragmente. Zu guter Letzt lassen ihre kleine Größe und erweiterte CDR3 Schlaufen kryptische Epitope erkennen und binden Sie an Enzym aktiven Zentren^7,8. Heute, diese Domains erhalten große Aufmerksamkeit und wurden auf die Biosensor-Technologie kombiniert. Z. B. Huang Et Al. entwickelten eine gemeinnützige-basierten Biosensor für die Erkennung und Quantifizierung von menschlichen Prostata-spezifischen Antigens (PSA)⁹.

Wie bereits erwähnt-oben ist ein wichtiger Parameter in Biosensor-Assays die Effizienz des Systems verwendet, um das elektrische Signal zu erzeugen. Aus diesem Grunde Enzymbasis elektrochemische Biosensoren immer größer werdende Aufmerksamkeit erregt haben und für verschiedene Anwendungen wie Gesundheit, Lebensmittelsicherheit und Umweltüberwachung verbreitet. Diese Biosensoren verlassen sich auf die katalytische Hydrolyse eines Substrats durch ein Enzym, das elektrische Signal zu generieren. In diesem Zusammenhang β-Lactamases erwiesen sich bestimmten, sensiblen und einfacher umzusetzen experimentell als viele andere Enzyme z. B. alkalische Phosphatase oder Meerrettich Peroxidase¹⁰. Β-Lactamases sind Enzyme, die für bakterielle Resistenz gegen β-Lactam-Antibiotika sind durch sie hydrolysieren. Sie sind Monomere, sehr stabil, effizient, und klein. Darüber hinaus generieren Domäne/Peptid Einfügungen in β-Lactamases bifunktionale Chimäre Proteinen, die gezeigt wurden, und effiziente Werkzeuge, um Protein-Ligand-Interaktionen zu untersuchen. In der Tat, haben jüngste Studien gezeigt, dass Einfügen von Variablen Antikörperfragmente in TEM1 β-Lactamase Ergebnisse in ein chimäres Protein, die in der Lage, mit hoher Affinität zu ihren Ziel-Antigen gebunden bleibt. Interessanterweise zeigte die Antigen-Bindung allosterische Verordnung TEM1 katalytische Aktivität^11,12zu induzieren. Darüber hinaus zeigten wir in mehreren Studien, dass Protein Domäne einführen in eine permissive Schleife des Bacillus Licheniformis BlaP β-Lactamase Funktionsproteine Chimären erzeugt, die gut geeignet zur Überwachung von Protein-Ligand-Interaktionen^{13 ,14}. Wir eingefügt vor kurzem eine gemeinnützige, Fahrerhaus-Lys3, in diesem freizügigen Insertionsstelle BlaP¹⁵benannt. Diese gemeinnützige zeigte an Henne-Ei-weiß Lysozym (HEWL) binden und seine enzymatische Aktivität¹⁶zu hemmen. Wir haben gezeigt, dass das erzeugte Hybrid-Protein, benannt BlaP-Fahrerhaus-Lys3, eine hohe Spezifität erhalten / Affinität gegen HEWL, während die β-Lactamase-Aktivität blieb unverändert. Dann haben wir erfolgreich kombiniert die β-Lactamase-Hybridtechnologie, eine elektrochemische Biosensor und zeigte, dass die Höhe der erzeugte elektrische Signal abhängig von der Interaktion zwischen BlaP-Fahrerhaus-Lys3 und HEWL auf einer Elektrode immobilisiert. Hydrolyse von β-Lactam-Antibiotika durch BlaP induziert in der Tat eine Proton-Release, die in einem quantitativen elektrisches Signal umgewandelt werden kann. Diese Kombination von β-Lactamase Hybridtechnik mit eine elektrochemische Biosensor ist schnell, empfindlich, quantitative und ermöglicht Echtzeit-Messung von das erzeugte Signal. Diese Methode wird hier beschrieben.

Protokoll

(1) Protein Probenvorbereitung

1. Produzieren Sie und reinigen Sie das Hybrid-Protein BlaP-Fahrerhaus-Lys3 wie in unserer vorherigen Studie¹⁵berichtet. Speichern Sie das Protein in 50 mM Phosphat-Puffer pH 7.4 mit folgender Zusammensetzung: 0,24 g KH₂PO₄ in 800 mL destilliertem Wasser aufgelöst, 1,44 g Na₂HPO₄ , 8 g NaCl und 0,2 g KCl beheben den pH-Wert der Lösung auf 7,4 vor Anpassung der letzte Band der Lösung 1 sterilisieren L. Filter die Proteinlösung.
2. Bereiten Sie eine Henne Eiweiß Lysozym (HEWL) Stammlösung. Lösen Sie 100 mg (40.000 Einheiten/mg) im Handel erworbenen HEWL in 10 mL von Phosphat Puffer Kochsalzlösung (PBS siehe Schritt 2.1.1 auf). Sterilisieren Sie die Proteinlösung durch Filtration, die Verwendung von Filtern mit einem Cutoff von 0,22 μm.

2. Biosensor-Assays

1. Lösung und Puffer Vorbereitung
   1. Bereiten Sie 50 mM PBS durch 8 g NaCl, 0,2 g KCl und 1,44 g Na₂HPO₄0,24 g KH₂PO₄ in 800 mL destilliertem Wasser auflösen. Passen Sie auf pH 7.4 mit 1 N HCl oder 1 N NaOH vor dem Einstellen der Lautstärke der Lösung 1 L. Filter sterilisieren und bei 4 ° c lagern
   2. Bereiten Sie eine Sättigung/blockieren Lösung durch Auflösen von 3 g Casein Hydrolysat in 100 mL PBS zubereitet wie oben beschrieben (siehe Schritt 2.1.1). Filter zu sterilisieren und Lagerung bei 4 ° C.
   3. Bereiten Sie eine verbindliche Lösung durch Auflösen von 1 g Casein Hydrolysat in 100 mL PBS zubereitet wie oben beschrieben (siehe Schritt 2.1.1). Filter zu sterilisieren und Lagerung bei 4 ° C.
   4. Vorbereiten eine Waschlösung (0,1 % Tween - PBS) durch Zugabe von 100 μl der Tween 20 (100 %) in 100 mL PBS zubereitet wie oben beschrieben (siehe Schritt 2.1.1). Shop bei 4 ° C.
   5. Bereiten Sie eine Elektrode Vorbereitung Lösung (1 % Triton x-100-PBS) durch Zugabe von 1 mL der Triton x-100 (100 %) in 100 mL PBS zubereitet wie oben beschrieben (siehe Schritt 2.1.1). Shop bei 4 ° C.
   6. Bereiten Sie eine Elektrode Regenerationslösung (3,5 M KCl) durch Auflösen von 26 g KCl in destilliertem Wasser zu einem Endvolumen 100 mL. Filtern Sie sterilisiert und Lagerung bei 4 ° C.
   7. Bereiten Sie eine 5 mM NaCl-Lösung durch Auflösen von 0,29 g NaCl in destilliertem Wasser zu einem Endvolumen von 1 L. Filter sterilisieren und Lagerung bei 4 ° C. Dann bereiten Sie eine Erkennung-Lösung (4 mM Penicillium) durch Auflösen von 26,7 mg Penicillium in 20 mL 5 mM NaCl-Lösung. Filter zu sterilisieren und Lagerung bei-20 ° C.
2. Sensor-Vorbereitung und regeneration
   Hinweis: Die Polyaniline beschichtete Sensor-Chips wurden entwickelt und freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Dr. P. Bogaerts, Dr. S. Yunus und Prof. Y. Glupczynski (Katholische Universität von Louvain-la-Neuve - CHU Mont-Godinne). Die Beschreibung des Sensors sowie die Polyaniline Elektro-Polymerisation-Protokolle verwendet, um diese Sensoren zu synthetisieren sind detailliert in ihrer vorherigen Arbeit¹⁷. Kurz, nutzt dieses System wiederverwendbare Sensoren von acht einzelnen Chips, die von klassischen Printed Circuit Board (PCB) Techniken hergestellt wurden. Einzelnen Chips bestehen aus drei Elektrode runden Flecken. Die oberste ist die Arbeitselektrode auf welche Polyaniline Electro synthetisiert wurde. Die Mitte ist die Bezugselektrode und die unteren Elektrode bildet die Gegenelektrode. Sowohl die Referenz und die Zähler-Elektroden sind funktionalisiert mit soliden Ag/AgCl Amalgam auf die CO2-Schicht.
   1. Führen Sie 3 Wäschen der Elektroden durch Eintauchen der Tipps in Vertiefungen einer 96-Well-Platte mit 300 µL/Well Elektrode Vorbereitung Lösung (1 % Triton x-100-PBS, siehe Schritt 2.1.5.). Führen Sie jedem Waschgang für 2 min bei Raumtemperatur schonendes Mischen.
   2. Spülen Sie die Elektroden durch Eintauchen der Tipps in Vertiefungen einer 96-Well-Platte mit 300 µL/Well von destilliertem Wasser für 2 min bei Raumtemperatur schonendes Mischen.
   3. Regenerieren Sie die Elektroden durch Eintauchen der Tipps in Vertiefungen einer 96-Well-Platte mit 300 µL/Well der Regenerationslösung (3,5 M KCl, siehe Schritt 2.1.6) über Nacht bei 4 ° C oder 1 h bei Raumtemperatur.
   4. 3 Wäschen der Elektroden durch Eintauchen der Tipps in Vertiefungen einer 96-Well-Platte mit 300 µL/Well des Phosphat-Puffer Kochsalzlösung durchzuführen (siehe Schritt 2.1.1.). Durchführen Sie jedem Waschgang für 2 Minuten mit schonendes Mischen bei Raumtemperatur.
3. Verbindliche Assay durchgeführt auf dem sensor
   1. HEWL Mantel auf die PANI (Polyaniline) Oberfläche der Elektrode durch die Hinterlegung einer 15 µL Drop von 40 µg/mL HEWL mit PBS-Puffer auf der Elektrodenoberfläche vorbereitet. Über Nacht bei 4 ° C oder 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubieren.
   2. Führen Sie drei wäscht von Elektroden mit Phosphat Puffer Kochsalzlösung (siehe Schritt 2.1.1) durch die Elektrode Teile des Sensor-Chips in Vertiefungen einer 96-Well-Platte mit 300 µL/Well des Phosphat-Puffer Kochsalzlösung eintauchen. Führen Sie jedem Waschgang für 2 min bei Raumtemperatur schonendes Mischen.
   3. Die Elektroden durch Zugabe von 50 µL Tropfen die blockierende Lösung zu sättigen (siehe Punkt 2.1.2) auf der Elektrodenoberfläche. 1 h bei Raumtemperatur inkubieren. Dann waschen dreimal wie beschrieben in der vorherigen Schritt (siehe Punkt 2.3.2).
   4. Die BlaP-Kabine-Lys3-Lösung für 20 µg/mL in verbindlichen Lösung verdünnen (siehe Punkt 2.1.3) und einen 15 µL Tropfen verdünnte Lösung auf die Elektroden. 10 min bei Raumtemperatur inkubieren. Nach Antigen-gemeinnützige Reaktion zu waschen dreimal wie beschrieben im vorherigen Schritt die Waschlösung verwenden (siehe Schritt 2.1.4). Spülen Sie die Elektrode einmal mit PBS (siehe Schritt 2.1.1).
   5. Schließen Sie für die Erkennung den Sensor-Chip über den Kupfer-Schaltung Teil, ein digital-Multimeter. Dann, die Sensor-Antwort durch die Anwendung eines Tropfen 50 µL Erkennung Lösung zu initiieren (siehe Schritt 2.1.7) auf den positiven Elektroden und Anwendung einen Tropfen 50 µL NaCl 5 mM Lösung auf den negativen Elektroden (siehe Schritt 2.1.7). 30 min bei Raumtemperatur inkubieren. Überwachen Sie den Leitwert mit einem digitalen Multimeter.
      Hinweis: Das Multimeter wurde durch Dr. P. Bogaerts, Dr. S. Yunus und Prof. Y. Glupczynski (Katholische Universität von Louvain-la-Neuve - CHU Mont-Godinne. bereitgestellt. Diese Potentiostaten ist computergesteuert über einen USB-Port und die acht verschiedenen Chips des Sensors gleichzeitig analysiert. Die Software erstellt von Yunus und Kollegen¹⁷ erzeugt einen Echtzeit-Plot, der die Messungen der Leitfähigkeit unterscheiden sich die Referenz und Sample Elektroden gegen die Zeit darstellt.

Ergebnisse

Design und Engineering von Chimären Protein BlaP-Fahrerhaus-Lys3

Abbildung 1 stellt das Einfügen der Fahrerhaus-Lys3 in eine permissive BalP Klasse A β-Lactamase-Schleife aus Bacillus Licheniformis. Die Aufnahme wurde zwischen Rückstände Asp198 und Lys199 durchgeführt. Ein Thrombin-Spaltstelle wurde auf jeder Seite der Kabine-Lys3 eingeführt. Zellen mit einer konstitutiven Expressionsplasmid Codierung der BlaP-Fahre...

Diskussion

In dieser Arbeit präsentieren wir eine Methode, um eine gemeinnützige Verwendung der BlaP β-Lactamase als ein Trägerprotein funktionalisieren und wir zeigen, dass wir die daraus resultierende Hybrid-Protein in eine potentiometrische Sensor-Assay erfolgreich umsetzen können. Die wichtigste Neuerung Aspekt unserer Arbeit im Vergleich zu anderen Biosensor-Assays ist die kovalente Kupplung Teil der Antikörper, die enzymatische Aktivität, die das elektrische Signal generiert. Dieses so genannte Proteintechnologie Einf?...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
KH2PO4	Sigma-Aldricht	V000225
K2HPO4	Sigma-Aldricht	1551128
NaCl	Sigma-Aldricht	S7653
Tris–HCl	Roche	10812846001
EDTA	Sigma-Aldricht	E9884
KCl	Sigma-Aldricht	P9541
Na2HPO4	Sigma-Aldricht	NIST2186II
2-mercaptoethanol	Sigma-Aldricht	M6250
alanine	Sigma-Aldricht	A7627
HClO4	Fluka	34288	1M HClO4 solution, distributor : Sigma-Aldricht
casein hydrolysate	Sigma-Aldricht	22090
benzylpenicillin sodium	Sigma-Aldricht	B0900000
hen egg white lysozyme	Roche	10837059001
heptane	Sigma-Aldricht	246654
methanol	Sigma-Aldricht	322415
ammonium hydroxide solution	Sigma-Aldricht	380539	28% NH3 in H2O, purified by double-distillation (concentrated?)
Laboratory consumables
6-well plate	Greiner Bio-One	657165	CELLSTAR 6-Well Plate
Equipment
pH meter	WTW	1AA110	Lab pH meter inoLab pH 7110
vacuum and filtration system	Nalgene	NALG300-4100	Filter holders with receiver, distributor : VWR
potentiometric sensor chips			manufactured by Yunus and colleagues (ref 16)
PGSTAT30 Autolab	Metrohm Autolab		discontinued, succesor Autolab PGSTAT302N
digital multimeter, METRAHit 22M	Gossen Metrawatt		discontinued, successor Metrahit Base