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  • Résumé
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  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Dans ce travail, nous présentons une nouvelle méthode pour étudier les interactions de protéine-protéine à l’aide d’un biocapteur conductimétrique basé sur la technologie de β-lactamase hybride. Cette méthode repose sur la libération de protons par hydrolyse des β-lactames.

Résumé

Biocapteurs deviennent de plus en plus important et mis en œuvre dans différents domaines tels que la détection des pathogènes, diagnostic moléculaire, la surveillance environnementale et contrôle de sécurité des aliments. Dans ce contexte, nous avons utilisé des β-lactamases comme enzymes journaliste efficace dans plusieurs études sur les interactions protéine-protéine. En outre, leur capacité à accepter des insertions de peptides ou de protéines/domaines structurés fortement encourage l’utilisation de ces enzymes pour produire des protéines chimériques. Dans une étude récente, nous avons inséré un fragment d’anticorps à domaine unique dans la β-lactamase de Bacillus licheniformis BlaP. Ces petits domaines, également appelés nanocorps, sont définis comme le domaine de liaison antigène anticorps seule chaîne camélidés. Comme les anticorps double chaîne commune, ils montrent des affinités élevées et les spécificités de leurs cibles. La protéine chimérique qui en résulte ont montré une grande affinité contre sa cible tout en conservant l’activité β-lactamase. Ceci suggère que les fractions nanobody et β-lactamases restent fonctionnelles. Dans le présent travail, nous présentons un protocole détaillé qui combine notre système de β-lactamase hybride à la technologie des biocapteurs. La fixation spécifique de la nanobody vers sa cible peut être détectée grâce à une mesure conductimétrique des protons libérés par l’activité catalytique de l’enzyme.

Introduction

Biocapteurs sont des dispositifs analytiques qui combinent une interaction biomoléculaire avec les dispositifs de signalisation physiques ou chimiques appelés transducteurs1. Les signaux enregistrés soient interprétés et convertis pour surveiller les interactions entre les partenaires immobilisées et libres. La plupart des biocapteurs impliquent l’utilisation d’un anticorps pour détecter les analytes tels que les hormones ou autre agent pathogène marqueurs2. Formats de capteur différent peuvent être utilisés et comprennent des biocapteurs basée sur la masse, magnétiques, optiques ou électrochimiques. Ces derniers sont parmi les plus couramment utilisé des détecteurs et fonctionnent en convertissant un événement de liaison en un signal électrique. Les interprétations et exécutions et les sensibilités de tous les dérivés des anticorps biocapteurs dépendent essentiellement de deux paramètres : i) la qualité de l’anticorps et ii) les propriétés du système utilisé pour générer le signal2.

Les anticorps sont des protéines dimères masse moléculaire élevé (150 – 160 kDa) qui sont composées de deux chaînes lourdes et deux chaînes légères. L’interaction entre les chaînes légères et lourdes est surtout stabilisée par des interactions hydrophobes, mais aussi une liaison disulfure conservée. Chaque chaîne comporte un domaine variable qui interagit avec l’antigène essentiellement par l’intermédiaire de trois régions hypervariables nommé complémentaires détermination de régions (CDR1-2-3). Malgré les nombreuses avancées dans le domaine, l’expression à grande échelle des anticorps pleine longueur avec des systèmes d’expression peu coûteux (p. ex., e. coli) mène souvent à la production de protéines instables et agrégées. C’est pourquoi divers fragments d’anticorps ont été conçus comme des fragments de chaîne unique variable3 (ScFvs ≈ 25 kDa). Ils sont constitués des domaines variables des lourds respectivement un et un seul chaînes légères qui sont liées de façon covalente par une séquence d’acides aminés synthétiques. Toutefois, ces fragments souvent affichent une faible stabilité et ont tendance à regrouper, car ils exposent une grande partie de leurs régions hydrophobes au solvant4. Dans ce contexte, camélidés fragments d’anticorps, appelés nanocorps ou HHV, semblent être d’excellentes alternatives à ScFvs. Ces domaines correspondent à des domaines variables des anticorps de chaîne unique de camélidés. Contrairement aux anticorps traditionnels, les anticorps de camélidés sont dépourvues de chaînes légères et ne contiennent que deux chaînes lourdes5. Par conséquent, les nanocorps sont les fragments anticorps monomère plus petits (12 kDa) capables de se lier à un antigène avec une affinité semblable à celle des anticorps traditionnels6. En outre, ils présentent une stabilité et une solubilité par rapport à d’autres anticorps pleine longueur ou des fragments d’anticorps. Enfin, leurs petites tailles et leurs longues boucles CDR3 laissez-les reconnaissent des épitopes cryptiques et lier à l’enzyme sites actifs7,8. De nos jours, ces domaines suscitent un intérêt considérable et ont été combinés à la technologie des biocapteurs. Par exemple, Huang et al. ont mis au point un biocapteur axée sur les nanobody pour la détection et la quantification de l’antigène prostatique spécifique (PSA) humaine9.

Comme mentionné ci-dessus, un paramètre important dans les essais de biocapteur est l’efficacité du système utilisé pour générer le signal électrique. Pour cette raison, les biocapteurs électrochimiques à base d’enzymes ont attiré une attention croissante et ont été largement utilisés pour diverses applications telles que les soins de santé, la sécurité alimentaire et surveillance de l’environnement. Ces biocapteurs s’appuient sur l’hydrolyse catalytique d’un substrat par une enzyme pour générer le signal électrique. Dans ce contexte, β-lactamases se sont révélés être plus précis, plus sensible et plus facile à mettre en œuvre expérimentalement que beaucoup d’autres enzymes comme la phosphatase alcaline ou la peroxydase de raifort10. Β-lactamases sont des enzymes qui sont responsables de la résistance bactérienne aux antibiotiques β-lactamines par hydrolyse d’eux. Ils sont des monomères, très stable, efficace et de petite taille. En outre, insertions de domaine/peptide dans les β-lactamases génèrent bifonctionnel protéines chimériques qui se sont avérés être des outils efficaces pour étudier les interactions de protéine-ligand. En effet, les études récentes ont montré qu’insertion de fragments d’anticorps variable dans les résultats de β-lactamase TEM1 dans une protéine chimérique qui reste capable de se lier avec une haute affinité pour l’antigène cible. Fait intéressant, la liaison de l’antigène a été montrée pour induire la régulation allostérique de TEM1 activité catalytique11,12. En outre, nous avons montré dans plusieurs études que l’insertion de domaine protéine dans une boucle permissive de la β-lactamase de BlaP Bacillus licheniformis génère fonctionnelles protéines chimériques qui conviennent bien à surveiller les interactions protéine-ligand13 ,,14. Nous avons récemment inséré un nanobody, nommé cAb-Lys3, dans ce site d’insertion permissive de BlaP15. Cette nanobody a été montré pour lier au lysozyme de blanc d’oeuf-poule (lysozyme) et d’inhiber son activité enzymatique16. Nous avons montré que la protéine hybride généré, nommée BlaP-cAb-Lys3, conservé une grande spécificité / affinité contre lysozyme tandis que l’activité de la β-lactamase est restée inchangée. Ensuite, nous avons réussi combinée à la technologie hybride de β-lactamase à un Biocapteur électrochimique et a montré que la quantité de signal électrique généré dépendait de l’interaction entre BlaP-cAb-Lys3 et lysozyme immobilisée sur une électrode. En effet, l’hydrolyse des β-lactamines par BlaP induit une libération de protons qui peut être convertie en un signal électrique quantitatif. Cette combinaison de la technologie hybride de β-lactamase avec un Biocapteur électrochimique est quantitative, sensible et rapide et permet de mesurer en temps réel du signal généré. Cette méthode est décrite dans les présentes.

Protocole

1. protein préparation des échantillons

  1. Produire et purifier la protéine hybride BlaP-cAb-Lys3 comme indiqué dans notre précédente étude15. Stocker la protéine en 50 mM tampon phosphate pH 7.4 composée comme suit : 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na2HPO4 et 0,24 g de KH2PO4 dissous dans 800 mL d’eau distillée Difficulté le pH de la solution à 7,4 avant réglage du volume final de la solution à 1 L. filtre stériliser la solution protéique.
  2. Préparer une solution-mère poule blanc d’oeuf lysozyme (lysozyme). Dissoudre 100 mg (40 000 unités/mg) de lysozyme acheté dans le commerce dans 10 mL de solution saline le tampon au phosphate (PBS voir étape 2.1.1). Stériliser la solution protéique en filtrant à l’aide de filtres avec un seuil de 0,22 μm.

2. tests de biocapteur

  1. Préparation de solution et tampon
    1. Préparer 50 mM PBS en dissolvant les 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na2HPO4et 0,24 g de KH2PO4 dans 800 mL d’eau distillée. Ajuster le pH 7,4 avec 1 N HCl ou NaOH N 1 avant d’ajuster le volume de la solution à 1 L. filtre stériliser et stocker à 4 ° C.
    2. Préparer une solution de saturation/blocage en dissoudre 3 g d’hydrolysat de caséine dans 100 mL de PBS préparé comme indiqué ci-dessus (voir étape 2.1.1). Filtre à stériliser et stocker à 4 ° C.
    3. Préparer une solution de liaison en dissolvant 1 g d’hydrolysat de caséine dans 100 mL de PBS préparé comme indiqué ci-dessus (voir étape 2.1.1). Filtre à stériliser et stocker à 4 ° C.
    4. Préparer une solution de lavage (0,1 % Tween - PBS) en ajoutant 100 μL de Tween 20 (100 %) dans 100 mL de PBS préparé comme indiqué ci-dessus (voir étape 2.1.1). Conserver à 4 ° C.
    5. Préparer une solution de préparation des électrodes (1 % Triton X-100-PBS) en ajoutant 1 mL de Triton X-100 (100 %) dans 100 mL de PBS préparé comme indiqué ci-dessus (voir étape 2.1.1). Conserver à 4 ° C.
    6. Préparer une solution de régénération de l’électrode (KCl 3,5 M) en 26 g de KCl dans l’eau distillée pour un volume final de dissolvant 100 mL. Filtre stérilisé et conserver à 4 ° C.
    7. Préparer une solution de NaCl de 5 mM en dissolvant 0,29 g de NaCl dans l’eau distillée pour un volume final de 1 L. filtre stériliser et stocker à 4 ° C. Ensuite, préparer une solution de détection (4 mM benzylpénicilline) en dissolvant 26,7 mg de benzylpénicilline dans 20 mL de 5 mM NaCl solution. Filtre à stériliser et conserver à-20 ° C.
  2. Régénération et préparation de capteur
    Remarque : La polyaniline enduit capteur puces ont été élaborées et aimablement fournis par le Dr P. Bogaerts, Dr S. Yunus et Prof. Y. Glupczynski (catholique Université de Louvain-la-Neuve - CHU Mont-Godinne). La description de la sonde ainsi que les protocoles d’electro-polymérisation de polyaniline utilisés pour synthétiser ces capteurs sont détaillées dans leurs précédents travaux17. En bref, ce système utilise des capteurs réutilisables de huit jetons individuels qui ont été fabriqués par des techniques classiques de circuits imprimés Conseil (PCB). Puces individuelles sont composées de trois électrodes ronds points. Celui du haut est l’électrode de travail sur lequel polyaniline a été synthétisé electro. Celle du milieu est l’électrode de référence et l’électrode inférieure constitue la contre-électrode. La référence et les électrodes de compteur sont fonctionnalisés en utilisant des amalgames Ag/AgCl solide sur le dessus de la couche de carbone.
    1. Effectuer 3 lavages des électrodes en plongeant les pointes dans des puits d’une plaque à 96 puits contenant 300 µL/puits d’une solution de préparation des électrodes (voir Triton X-100-PBS, 1 % étape 2.1.5.). Effectuer chaque lavage pendant 2 min avec un mélange doux à température ambiante.
    2. Rincer les électrodes en plongeant les pointes dans des puits d’une plaque à 96 puits contenant 300 µL/puits d’eau distillée pendant 2 min avec un mélange doux à température ambiante.
    3. Régénérer les électrodes en plongeant les pointes dans des puits d’une plaque à 96 puits contenant 300 µL/puits de la solution de régénération (3,5 M KCl, reportez-vous à l’étape 2.1.6) durant la nuit à 4 ° C ou 1 h à température ambiante.
    4. Effectuer 3 lavages des électrodes en plongeant les pointes dans des puits d’une plaque à 96 puits contenant 300 µL/puits d’une solution saline de tampon phosphate (voir étape 2.1.1.). Effectuer chaque lavage pendant 2 minutes avec un mélange doux à température ambiante.
  3. Liaison test effectué sur le capteur
    1. Couche lysozyme sur PANI (polyaniline) la surface de l’électrode en déposant une goutte de 15 µL de 40 µg/mL lysozyme préparé dans du PBS sur la surface de l’électrode. Incuber une nuit à 4 ° C ou 1 heure à température ambiante.
    2. Effectuer trois lavages des électrodes avec une solution saline de tampon phosphate (voir étape 2.1.1) en plongeant les pièces de l’électrode des puces capteur dans puits d’une plaque de 96 puits contenant 300 µL/puits d’une solution saline de tampon phosphate. Effectuer chaque lavage pendant 2 min avec un mélange doux à température ambiante.
    3. Saturer les électrodes en ajoutant une goutte de 50 µL de la solution de saturation (voir étape 2.1.2) sur la surface de l’électrode. Incuber pendant 1 heure à température ambiante. Puis laver trois fois comme décrit dans la précédente étape (voir étape 2.3.2).
    4. Diluer la solution BlaP-cAb-Lys3 à 20 µg/mL en solution de liaison (voir étape 2.1.3) et appliquez une goutte de 15 µL de cette solution diluée sur les électrodes. Incuber pendant 10 min à température ambiante. Après la réaction antigène-nanobody, se laver trois fois comme décrit à l’étape précédente à l’aide de la solution de lavage (voir étape 2.1.4). Ensuite, rincez l’électrode une fois avec du PBS (voir étape 2.1.1).
    5. Pour la détection, branchez la puce du capteur via la partie cuivre-circuits à un multimètre numérique. Puis, lancer la réponse du capteur en appliquant une goutte de 50 µL de solution de détection (voir étape 2.1.7) sur les électrodes positives et en appliquant une goutte de 50 µL de solution de NaCl 5 mM sur les électrodes négatives (voir étape 2.1.7). Incuber 30 min à température ambiante. Surveiller la conductance avec un multimètre numérique.
      Remarque : Le multimètre a été fourni par le Dr P. Bogaerts, Dr S. Yunus et Prof. Y. Glupczynski (catholique Université de Louvain-la-Neuve - CHU Mont-Godinne. Cette potentiostat est contrôlé par l’ordinateur via un port USB et analyse les huit différentes puces du capteur en même temps. Le logiciel créé par Yunus et collègues17 crée un tracé en temps réel qui représente la mesure de la différence de conductivité entre les électrodes de référence et l’échantillon contre la montre.

Résultats

Conception et l’ingénierie des protéines chimériques BlaP-cAb-Lys3

La figure 1 représente l’insertion du cAb-Lys3 dans une boucle permissive de la β-lactamases de classe A BalP Bacilluslicheniformis. L’insertion a été effectuée entre les résidus Asp198 et Lys199. Un site de clivage de la thrombine a été introduit sur chaque côté du cAb-Lys3. Cellules transformés avec un expression constitutive de plasmi...

Discussion

Dans ce travail, nous présentons une méthode pour fonctionnaliser un nanobody à l’aide de la β-lactamase BlaP comme protéine porteuse et nous montrons que nous pouvons implémenter avec succès la protéine hybride résultant dans un essai de capteur potentiométrique. La principale innovation de notre travail par rapport aux autres tests biocapteur est le couplage covalent de la partie de l’anticorps à l’activité enzymatique qui génère le signal électrique. Cette technologie d’insertion dite protéine ...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Les auteurs reconnaissent la région wallonne dans le cadre des projets de recherche SENSOTEM et NANOTIC, ainsi que le National fonds pour la recherche scientifique (F.R.S-F.N.R.S) pour leur soutien financier.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Reagents
KH2PO4Sigma-AldrichtV000225 
K2HPO4Sigma-Aldricht1551128
NaClSigma-AldrichtS7653
Tris–HClRoche10812846001
EDTA Sigma-AldrichtE9884
KClSigma-AldrichtP9541
Na2HPO4 Sigma-AldrichtNIST2186II
2-mercaptoethanolSigma-AldrichtM6250
alanineSigma-AldrichtA7627
HClO4Fluka342881M HClO4 solution, distributor : Sigma-Aldricht
casein hydrolysateSigma-Aldricht22090
benzylpenicillin sodiumSigma-AldrichtB0900000
hen egg white lysozymeRoche10837059001
heptaneSigma-Aldricht246654
methanolSigma-Aldricht322415
ammonium hydroxide solutionSigma-Aldricht38053928% NH3 in H2O, purified by double-distillation (concentrated?)
Laboratory consumables
6-well plate Greiner Bio-One657165CELLSTAR 6-Well Plate
Equipment
pH meterWTW1AA110Lab pH meter inoLab pH 7110
vacuum and filtration systemNalgeneNALG300-4100Filter holders with receiver, distributor : VWR
potentiometric sensor chipsmanufactured by Yunus and colleagues (ref 16)
PGSTAT30 AutolabMetrohm Autolabdiscontinued, succesor Autolab PGSTAT302N
digital multimeter, METRAHit 22MGossen Metrawattdiscontinued, successor Metrahit Base

Références

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