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  • Reimpressões e Permissões

Resumo

Neste trabalho, relatamos um novo método para estudar as interações da proteína-proteína usando um biossensor titulometria, baseado na tecnologia de β-lactamases de híbrido. Este método baseia-se na liberação de prótons após hidrólise da β-lactamas.

Resumo

Biosensores estão se tornando cada vez mais importante e implementadas em várias áreas tais como detecção de agentes patogénicos, diagnóstico molecular, monitoramento ambiental e controle de segurança de alimentos. Neste contexto, usamos β-lactamases como enzimas repórter eficiente em vários estudos de interação da proteína-proteína. Além disso, sua capacidade de aceitar inserções de peptídeos ou proteínas/domínios estruturados fortemente incentiva o uso destas enzimas para gerar proteínas quiméricas. Em um estudo recente, inserimos um fragmento de anticorpo de domínio único para o β-lactamases de Bacillus licheniformis BlaP. Estes domínios pequenos, também chamados de nanobodies, são definidos como domínios de ligação de antígeno de anticorpos de cadeia única de camelídeos. Como comum anticorpos de cadeia dupla, eles mostram afinidades altas e especificidades para seus alvos. Proteínas quiméricas resultantes exibiram uma afinidade elevada contra seu destino mantendo a atividade de β-lactamase. Isto sugere que as partes nanobody e β-lactamases permanecem funcionais. No presente trabalho, relatamos um protocolo detalhado que combina o nosso sistema de β-lactamases de híbrido para a tecnologia biosensor. A vinculação específica da nanobody ao seu alvo pode ser detectada graças a uma medição titulometria dos prótons liberados pela atividade catalítica da enzima.

Introdução

Biosensores são dispositivos analíticos que combinam uma interação bio-molecular com dispositivos de sinalização físicos ou químicos conhecido como transdutores1. Os sinais gravados podem ser interpretados e convertidos para monitorar as interações entre os parceiros de imobilizado e livre. A maioria dos biosensores envolve o uso de um anticorpo para detectar analitos tais como hormonas ou patógeno diferentes marcadores2. Sensor de diferentes formatos podem ser usados e incluem biosensores baseados em massa, magnéticos, ópticos ou eletroquímicos. O último está entre os mais comumente usados sensores e função, convertendo um evento de vinculação em um sinal elétrico. As performances e sensibilidades de todos os biossensores baseados em anticorpos são fortemente dependentes essencialmente de dois parâmetros: i) a qualidade do anticorpo e ii) e as propriedades do sistema usado para gerar o sinal2.

Os anticorpos são proteínas massa dimérica high-molecular (150 – 160 kDa) são compostos de duas cadeias pesadas e duas cadeias leves. A interação entre as cadeias leves e pesadas é estabilizada principalmente por interações hidrofóbicas, bem como uma ligação dissulfureto conservada. Cada cadeia inclui um domínio variável que interage com o antígeno essencialmente através de três regiões hipervariáveis chamado complementar determinando regiões (CDR1-2-3). Apesar dos inúmeros avanços no campo, a expressão em grande escala de anticorpos completos com sistemas de expressão de baixo custo (por exemplo, Escherichia coli), muitas vezes leva à produção de proteínas instáveis e agregadas. É por isso que vários fragmentos de anticorpos têm sido projetados tais como variável de cadeia única de fragmentos3 (ScFvs ≈ 25 kDa). Eles consistem os domínios variáveis de respectivamente um pesado e um cadeias leves que são covalentemente ligados por uma sequência de aminoácidos sintéticos. No entanto, esses fragmentos frequentemente exibir uma pobre estabilidade e têm a tendência de agregar, uma vez que expõem uma grande parcela de suas regiões hidrofóbicas para o solvente4. Neste contexto, fragmentos de anticorpos camelid única cadeia, conhecidos como nanobodies ou VHHs, parecem ser excelentes alternativas para ScFvs. Estes domínios correspondem os domínios variáveis de anticorpos de cadeia única camelid. Em contraste com anticorpos convencionais, camelid anticorpos são desprovidas de cadeias leves e contenham apenas duas correntes pesadas5. Portanto, nanobodies são os menor monomérico fragmentos de anticorpos (12 kDa) podem ligar a um antígeno com afinidade semelhante de anticorpos convencional6. Além disso, eles apresentam melhor estabilidade e solubilidade em comparação com outros anticorpos completos ou fragmentos de anticorpos. Finalmente, suas dimensões reduzidas e sua prolongada CDR3 loops que lhes permitam reconhecem epitopos crípticos e vincular a enzima sites ativos7,8. Hoje em dia, estes domínios estão recebendo atenção considerável e foram combinados com a tecnologia biosensor. Por exemplo, Huang et al. desenvolveram um biossensor baseado em nanobody para a detecção e quantificação de humano antígeno prostático específico (PSA)9.

Como mencionado acima, um parâmetro importante em ensaios de biosensor é a eficiência do sistema usado para gerar o sinal elétrico. Por esta razão, biosensores eletroquímicos enzimáticos têm atraído cada vez mais atenção e tem sido usados amplamente para várias aplicações tais como cuidados de saúde, segurança alimentar e monitoramento ambiental. Estes biosensores dependem a hidrólise catalítica de um substrato por uma enzima para gerar o sinal elétrico. Neste contexto, β-lactamases foram mostrados para ser mais específico, mais sensível e mais fácil de implementar do que muitas outras enzimas como a fosfatase alcalina ou peroxidase de rábano10experimentalmente. Β-lactamases são enzimas que são responsáveis pela resistência bacteriana aos antibióticos β-lactâmicos por hidrólise de-los. Eles são monoméricos, muito estável, eficiente e de tamanho pequeno. Além disso, inserções de domínio/peptídeo em β-lactamases geram proteínas quiméricas bi-funcionais que foram mostradas para ser instrumentos eficazes para estudar as interações proteína-ligante. De fato, estudos recentes têm mostrado essa inserção da variável fragmentos de anticorpos para os resultados de β-lactamase TEM1 em uma proteína quimérico que continua a ser capaz de ligar-se com alta afinidade ao seu antígeno alvo. Curiosamente, a ligação do antígeno foi mostrada para induzir alostérica de TEM1 atividade catalítica11,12. Além disso, mostramos em vários estudos que a inserção de domínio de proteína em um loop de permissiva do Bacillus licheniformis BlaP β-lactamases gera proteínas quiméricas funcionais que são adequadas para monitorar as interações proteína-ligante13 ,14. Recentemente, nós inserimos um nanobody, denominado cAb-Lys3, para este site de inserção permissiva do BlaP15. Este nanobody foi mostrado para vincular a galinha-de-ovo lisozima (HEWL) e para inibir a atividade enzimática de16. Nós mostramos que a proteína gerada híbrido, chamada BlaP-táxi-Lys3, manteve uma alta especificidade / afinidade contra HEWL enquanto a atividade de β-lactamase permaneceu inalterada. Então nós com sucesso combinado com a tecnologia de β-lactamases de híbrido de um biosensor eletroquímico e mostrou que a quantidade de sinal elétrico gerado era dependente da interação entre BlaP-táxi-Lys3 e HEWL imobilizada em um eletrodo. Com efeito, hidrólise da β-lactâmicos por BlaP induz uma liberação de prótons que pode ser convertida em um sinal elétrico quantitativo. Esta combinação da tecnologia híbrida de β-lactamase com um biosensor eletroquímico é rápido, quantitativo e permite a medição em tempo real do sinal gerado. Esta metodologia é descrita neste documento.

Protocolo

1. proteína preparação da amostra

  1. Produzir e purificar a proteína híbrida BlaP-táxi-Lys3 como relatado no nosso anterior estudo15. Armazenar a proteína em 50mm tampão fosfato pH 7,4 com a seguinte composição: 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na2HPO4 e 0,24 g de KH2PO4 dissolvida em 800 mL de água destilada corrigir o pH da solução a 7,4 antes ajustando o volume final da solução a 1 L. Filter esterilizar a solução de proteína.
  2. Prepare uma solução stock de galinha ovo lisozima (HEWL). Dissolva 100 mg (40.000 unidades/mg) de HEWL adquirido comercialmente em 10 mL de solução salina de tampão fosfato (PBS ver passo 2.1.1). Esterilize a solução de proteína por filtração utilizando filtros com um corte de 0,22 μm.

2. biosensor ensaios

  1. Preparação de solução e buffer
    1. Prepare 50 milímetros PBS dissolvendo-se 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na2HPO4e 0,24 g de KH2PO4 em 800 mL de água destilada. Ajustar o pH 7,4 com 1 N HCl ou NaOH de N 1 antes de ajustar o volume da solução de 1 L. filtro esterilizar e armazenar a 4 ° C.
    2. Preparar uma solução de saturação/bloqueio pela dissolução de 3 g de hidrolisado de caseína em 100 mL de PBS preparado como descrito acima (consulte a etapa 2.1.1). Filtro de esterilizar e armazenar a 4 ° C.
    3. Preparar uma solução de ligação pela dissolução de 1 g de hidrolisado de caseína em 100 mL de PBS preparado como descrito acima (consulte a etapa 2.1.1). Filtro de esterilizar e armazenar a 4 ° C.
    4. Preparar uma solução de lavagem (0.1% Tween - PBS) adicionando-se 100 μL de Tween 20 (100%) em 100 mL de PBS preparado como descrito acima (consulte a etapa 2.1.1). Loja a 4 ° C.
    5. Preparar uma solução de preparação do eléctrodo (1% Triton X-100-PBS), adicionando 1 mL de Triton X-100 (100%) em 100 mL de PBS preparado como descrito acima (consulte a etapa 2.1.1). Loja a 4 ° C.
    6. Preparar uma solução de regeneração do eletrodo (3,5 M KCl) dissolvendo-se 26 g de KCl em água destilada até um volume final 100 mL. Filtro esterilizado e em 4 ° C.
    7. Preparar uma solução de NaCl de 5 mM, dissolvendo 0,29 g de NaCl em água destilada até um volume final de 1 L. filtro esterilizar e armazenar a 4 ° C. Em seguida, prepare uma solução de deteção (4mm benzilpenicilina) dissolvendo 26,7 mg de benzilpenicilina em 20 mL de solução de NaCl de 5 mM. Filtro de esterilizar e armazenar a-20 ° C.
  2. Regeneração e preparação de sensor
    Nota: A polianilina revestido sensor fichas foram desenvolvidas e gentilmente cedidas pelo Dr. P. Bogaerts, Dr. S. Yunus e Prof Y. Glupczynski (Católica Universidade de Louvain-la-Neuve - CHU Mont-Godinne). A descrição do sensor, bem como os protocolos de electro-polimerização de polianilina usados para sintetizar estes sensores estão detalhadas no seu anterior trabalho17. Brevemente, este sistema utiliza sensores reutilizáveis de oito fichas individuais que foram produzidos por técnicas de clássica de circuito impresso (PWB). Fichas individuais são compostas de três Eletrodo Redondo manchas. A de cima é o eletrodo de trabalho na qual polianilina foi electro-sintetizados. O meio é o eletrodo de referência e o eletrodo de fundo constitui o eletrodo contador. Tanto, a referência e os eletrodos de contador são acrescidos usando amálgama de Ag/AgCl sólida no topo da camada de carbono.
    1. Executar 3 lavagens dos eletrodos, mergulhando as pontas poços de uma placa de 96 poços contendo 300 µ l/poço de solução de preparação do eléctrodo (veja de 1% Triton X-100-PBS, passo 2.1.5.). Realize cada lavagem por 2 min com suave mistura à temperatura ambiente.
    2. Lave os eletrodos por mergulhar as pontas nos poços de uma placa de 96 poços contendo 300 µ l/poço de água destilada por 2 min com suave mistura à temperatura ambiente.
    3. Regenerar os eléctrodos por mergulhar as pontas nos poços de uma placa de 96 poços contendo 300 µ l/poço de solução de regeneração (3.5 M de KCl, consulte a etapa 2.1.6) durante a noite em 4 ° C ou 1 h à temperatura ambiente.
    4. Executar 3 lavagens dos eletrodos, mergulhando as pontas poços de uma placa de 96 poços contendo 300 µ l/poço de solução salina tampão de fosfato (consulte a etapa 2.1.1.). Realize cada lavagem por 2 minutos com suave mistura à temperatura ambiente.
  3. Ligação do ensaio realizado no sensor
    1. Casaco HEWL na superfície do eléctrodo PANI (polianilina) depositando uma gota de 15 µ l de 40 µ g/mL HEWL preparado em PBS sobre a superfície do eletrodo. Incube durante a noite a 4 ° C ou 1 hora em temperatura ambiente.
    2. Realizar três lavagens dos eléctrodos com solução salina tampão de fosfato (ver passo 2.1.1) por mergulhando as peças eletrodo dos chips sensor poços de uma placa de 96 poços contendo 300 µ l/poço de solução salina tampão de fosfato. Realize cada lavagem por 2 min com suave mistura à temperatura ambiente.
    3. Saturar os eléctrodos, adicionando uma gota de 50 µ l da solução de bloqueio (ver passo 2.1.2) sobre a superfície do eletrodo. Encube por 1h à temperatura ambiente. Em seguida, lave três vezes, conforme descrito em anterior passo (veja etapa 2.3.2).
    4. Diluir a solução BlaP-táxi-Lys3 de 20 µ g/mL em solução de ligação (consulte a etapa 2.1.3) e aplicar uma gota de 15 µ l desta solução diluída para os eletrodos. Incube durante 10 minutos à temperatura ambiente. Depois da reação antígeno-nanobody, lave três vezes como descrito na etapa anterior, usando a solução de lavagem (ver passo 2.1.4). Em seguida enxaguar o eletrodo uma vez com PBS (consulte a etapa 2.1.1).
    5. Para a deteção, conecte o sensor chip através da parte de circuitos de cobre a um multímetro digital. Em seguida, iniciar a resposta do sensor aplicando uma gota de 50 µ l de solução de deteção (consulte a etapa 2.1.7) para os eletrodos positivos e aplicar uma gota de 50 µ l de solução de 5 mM de NaCl sobre os eletrodos negativos (consulte a etapa 2.1.7). Incube durante 30 min à temperatura ambiente. Monitore a condutância com um multímetro digital.
      Nota: O multímetro foi fornecido pelo Dr. P. Bogaerts, Dr. S. Yunus e Prof Y. Glupczynski (Católica Universidade de Louvain-la-Neuve - CHU Mont-Godinne. Este potentiostat é controlado por computador através de uma porta USB e analisa os oito chips diferentes do sensor simultaneamente. O software criado por Yunus e colegas17 cria uma trama em tempo real que representa as medições da diferença condutância entre os eletrodos de referência e da amostra contra o tempo.

Resultados

Design e engenharia das proteínas quiméricas BlaP-táxi-Lys3

A Figura 1 representa a inserção de táxi-Lys3 em um loop permissiva da BalP classe A β-lactamases de Bacillus licheniformis. A inserção foi realizada entre resíduos Asp198 e Lys199. Um local de clivagem de trombina foi introduzido em cada lado do táxi-Lys3. As células transformadas com um plasmídeo de expressão constitutiva codificação da proteína...

Discussão

Neste trabalho apresentamos um método para funcionalizar um nanobody usando o BlaP β-lactamase como uma proteína transportadora e mostramos que podemos implementar com êxito a proteína híbrida resultante em um ensaio de sensor potenciométrico. O aspecto principal inovação do nosso trabalho em comparação com outros ensaios biosensor é o acoplamento covalente da parte de anticorpo para a atividade enzimática que gera o sinal elétrico. Esta tecnologia de inserção de proteína chamada apresenta vantagens e li...

Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Os autores reconhecem o Valão região da Bélgica, no âmbito dos projectos de investigação SENSOTEM e NANOTIC, bem como o nacional fundos para a investigação científica (F.R.S-F.N.R.S) pelo apoio financeiro.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Reagents
KH2PO4Sigma-AldrichtV000225 
K2HPO4Sigma-Aldricht1551128
NaClSigma-AldrichtS7653
Tris–HClRoche10812846001
EDTA Sigma-AldrichtE9884
KClSigma-AldrichtP9541
Na2HPO4 Sigma-AldrichtNIST2186II
2-mercaptoethanolSigma-AldrichtM6250
alanineSigma-AldrichtA7627
HClO4Fluka342881M HClO4 solution, distributor : Sigma-Aldricht
casein hydrolysateSigma-Aldricht22090
benzylpenicillin sodiumSigma-AldrichtB0900000
hen egg white lysozymeRoche10837059001
heptaneSigma-Aldricht246654
methanolSigma-Aldricht322415
ammonium hydroxide solutionSigma-Aldricht38053928% NH3 in H2O, purified by double-distillation (concentrated?)
Laboratory consumables
6-well plate Greiner Bio-One657165CELLSTAR 6-Well Plate
Equipment
pH meterWTW1AA110Lab pH meter inoLab pH 7110
vacuum and filtration systemNalgeneNALG300-4100Filter holders with receiver, distributor : VWR
potentiometric sensor chipsmanufactured by Yunus and colleagues (ref 16)
PGSTAT30 AutolabMetrohm Autolabdiscontinued, succesor Autolab PGSTAT302N
digital multimeter, METRAHit 22MGossen Metrawattdiscontinued, successor Metrahit Base

Referências

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