바이오 상호 작용을 검출 하는 β-lactamase 기반 Conductimetric 바이오 센서 분석 결과의 사용

요약

이 작품에서는, 우리는 하이브리드 β-lactamase 기술에 따라 conductimetric 바이오 센서를 사용 하 여 단백질 단백질 상호 작용을 공부 하는 새로운 방법을 보고 합니다. 이 메서드는 β-lactams의 가수분해 시 양성자의 출시에 의존합니다.

초록

바이오 센서 병원 체 검출, 분자 진단, 환경 모니터링, 식품 안전 관리 등 다양 한 분야에서 점점 더 중요 하 고 구현 되 고 있다. 이러한 맥락에서 우리는 효율적인 기자 효소가 여러 단백질 단백질 상호 작용 연구로 β-lactamases를 사용. 또한, 강하게 펩 티 드 또는 구조적된 단백질/도메인의 삽입을 허용 하도록 그들의 능력 공상 단백질을 생성 하는이 효소의 사용을 권장 합니다. 최근 연구에서 우리 균 licheniformis BlaP β-lactamase에 단일 도메인 항 체 단편을 삽입. Nanobodies, 라고도 하는 이러한 작은 도메인 camelids에서 단일 체인 항 체의 항 원 묶는 도메인으로 정의 됩니다. 일반 이중 체인 항 체 처럼 그들은 높은 화력과 특이성 그들의 목표에 대 한 표시. 결과 공상 단백질 β-lactamase 활동을 유지 하면서 대상에 대 한 높은 선호도 전시. 이 nanobody 및 β-lactamase moieties 유지 기능 제안 합니다. 현재 작업에서 우리는 우리의 하이브리드 β-lactamase 시스템 바이오 센서 기술에 결합 하 여 상세한 프로토콜을 보고 합니다. 특정 바인딩 대상에 nanobody의 효소의 촉매 활동 발표 양성자의 conductimetric 측정 덕분에 검색할 수 있습니다.

서문

바이오 센서는 바이오 분자 상호 변환기¹이라고 하는 물리적 또는 화학적 신호 장치를 결합 하는 분석 장치. 기록 된 신호 다음 해석 하 고 고정 및 무료 파트너 간의 상호 작용을 모니터링 변환할 수 있습니다. 바이오 센서의 대부분은 호르몬 등 다른 병원 체 마커²analytes를 검출 하는 항 체의 사용을 포함. 다른 센서 형식을 사용할 수 있습니다 하 고 질량, 자석, 광학 또는 전기 화학 바이오 센서를 포함 합니다. 후자는 가장 일반적으로 사용 되는 센서, 그리고 바인딩 이벤트를 전기 신호로 변환 하 여 작동. 공연 및 모든 항 체 기반 바이오 센서의 감도 기본적으로 두 개의 매개 변수에 강하게 의존: i)는 항 체와 ii)²신호 생성 하는 데 사용 하는 시스템의 속성의 품질.

항 체는 2 개의 무거운 사슬과 2 개의 가벼운 사슬 구성 높은 분자 질량 dimeric 단백질 (150-160 kDa). 빛과 무거운 사슬 사이 상호 작용은 주로 소수 성 상호 작용 보존된 이황화 결합에 의해 안정 된다. 각 체인에는 본질적으로 보완 결정 영역 (CDR1-2-3) 라는 3 하이퍼 영역을 통해 항 원와 상호 작용 하는 변수 도메인 포함 되어 있습니다. 필드, 낮은-비용 식 시스템 (예를 들면, 대장균) 전체 길이 항 체의 대규모 식에서에서 수많은 진보에도 불구 하 고 종종 불안정 하 고 집계 된 단백질의 생산에 지도 한다. 이 때문에 단일 체인 변수 조각³ (ScFvs ≈ 25 kDa)와 같은 다양 한 항 체 파편을 설계 되었습니다 있다. 그들은 각각 한 중 고 covalently는 합성 아미노산 서 열에 의해 연결 된 1 개의 경 쇄의 가변 도메인 구성 됩니다. 그러나,이 파편은 종종 가난한 안정성 표시 하 고 집계, 때문에 그들은 그들의 소수 성 영역 용⁴의 큰 부분을 노출 하는 경향이 있다. 이러한 맥락에서 단일 체인 camelid 항 체 단편, nanobodies 또는 VHHs, ScFvs에 대 한 우수한 대안을 것 같다. 이러한 도메인 camelid 단일 체인 항 체의 가변 도메인에 해당합니다. 기존의 항 체, 달리 camelid 항 체 경 쇄가 없는 고 두 무거운 체인⁵포함. 따라서, nanobodies는 가장 작은 단위체 항 체 파편 (12 kDa) 기존의 항 체⁶의 선호도와 항 원에 바인딩할 수 있습니다. 또한, 그들은 향상 된 안정성과 가용성 다른 전장 항 체 또는 항 체 파편에 비해 제시. 마지막으로, 그들의 작은 크기와 그들의 확장된 CDR3 루프 그들이 이상한 epitopes를 인식 하 고 효소 활성 사이트^7,8바인딩할 수 있습니다. 요즘, 이러한 도메인 상당한 관심을 받고 있다 고 바이오 센서 기술에 결합 되었습니다. 예를 들어 황은 외. 탐지 및 정량화 인간 전립선 특정 항 원 (PSA)⁹의 nanobody 기반 바이오 센서를 개발 했습니다.

언급-위, 바이오 센서 분석에 중요 한 매개 변수는 전기 신호를 생성 하는 데 사용 하는 시스템의 효율성. 이러한 이유로, 효소 기반 전기 화학 바이오 센서 증가 관심을 받고 있다 고 건강 관리, 식품 안전, 환경 모니터링 등 다양 한 응용 프로그램에 대 한 널리 사용 되었습니다. 이 바이오 센서는 전기 신호를 생성 하는 효소에 의해 기판의 촉매 가수분해에 의존 합니다. 이러한 맥락에서 β-lactamases 더 구체적인, 더 과민 하 고 알칼리 성 인산 가수분해 효소 또는 양 고추냉이 과산화 효소¹⁰같은 많은 다른 효소 보다 실험적으로 구현 하기 더 쉬운 것 표시 했다. Β-lactamases 효소 그들을 hydrolyzing 하 여 β-락탐 항생제를 세균성 저항에 대 한 책임은 있습니다. 그들은 작은 크기의 단위체, 매우 안정, 효율적인, 그리고입니다. 또한, β-lactamases에 도메인/펩 티 드 삽입 생성 bi 기능 공상 단백질 단백질-리간드 상호작용을 연구 하는 효율적인 도구 표시 했다. 실제로, 최근 연구의 대상 항 원에 높은 선호도와 바인딩할 수 남아 공상 단백질에서 TEM1 β-lactamase 결과 항 체 변수 조각의 그 삽입을 나타났습니다. 흥미롭게도, 항 원 바인딩 TEM1 촉매 활동^11,12의 allosteric 규칙 유도 표시 했다. 또한, 우리는 단백질 도메인 삽입 허용 루프에 균 licheniformis BlaP β-lactamase 단백질-리간드 상호작용^{13 모니터링 하는 기능 공상 단백질 생성 여러 연구에서 보였다 ,14}. 우리는 최근 택시-Lys3, BlaP¹⁵이 허용 삽입 사이트에 명명 하는 nanobody를 삽입. 이 nanobody 암 탉 달걀 흰 lysozyme (HEWL)에 바인딩할 및¹⁶의 효소 활동 억제 하기 위해 표시 했다. 우리는 생성 된 하이브리드 단백질, BlaP-택시-Lys3, 라는 높은 특이성을 유지 / HEWL β-lactamase 활동 동안에 대 한 선호도 그대로 보였다. 그럼 우리가 성공적으로 β-lactamase 기술 하이브리드는 전기 화학 바이오 센서를 결합 하 여 생성 된 전기 신호 양을 했다 BlaP-택시-Lys3와 HEWL는 전극에 움직일 수 간의 상호 작용에 따라 다릅니다. 실제로, BlaP에 의해 β 락탐 항생제의 가수분해 양성자 방출 양적 전기 신호로 변환할 수 있는 유도 합니다. 이 조합은 전기 화학 바이오 센서와 하이브리드 β-lactamase 기술의 빠른, 민감한, 양적, 이며 생성 된 신호의 실시간 측정을 수 있습니다. 이 방법론은 여기 설명 되어 있습니다.

프로토콜

1. 단백질 샘플 준비

1. 고 정화 하이브리드 단백질 BlaP-택시-Lys3로 우리의 이전 연구¹⁵에 보고 합니다. 50 m m 인산 버퍼 pH 7.4 다음 구성에서에서 단백질을 저장: 8 g의 NaCl, KCl의 0.2 g, 나₂HPO₄ 의 1.44 g, KH₂포₄ 증류수 800 mL에 용 해의 0.24 g 수정 전에 7.4 해결책의 pH 1 솔루션의 최종 볼륨을 조정 L. 필터 단백질 해결책 소독.
2. 암 탉 달걀 흰 lysozyme (HEWL) 재고 솔루션을 준비 합니다. 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS 단계 2.1.1 참조) 10 mL에 상업적으로 구입한 HEWL의 100 밀리 그램 (40000 단위/mg)을 분해. 0.22 μ m 휴즈와 필터를 사용 하 여 여과 하 여 단백질 해결책 소독.

2. 바이오 센서 분석 실험

1. 솔루션 및 버퍼 준비
   1. 8 g의 NaCl, KCl의 0.2 g, 나₂HPO₄, 1.44 g 및 KH₂포₄ 증류수 800 ml에서의 0.24 g을 용 해 하 여 50 mM PBS를 준비 합니다. 1 나 필터를 소독 및 4 ° c.에 저장 솔루션의 볼륨을 조정 하기 전에 pH 7.4 1에 N HCl 또는 1 N NaOH 조정
   2. 카 제인의 위에서 설명한 대로 준비 하는 PBS의 100 ml에서의 3 g을 용 해 하 여 채도/차단 솔루션을 준비 (2.1.1 단계 참조). 필터를 소독 및 4 ° c.에 저장
   3. 카 제인의 위에서 설명한 대로 준비 하는 PBS의 100 ml에서의 1 g을 용 해 하 여 바인딩 솔루션 준비 (2.1.1 단계 참조). 필터를 소독 및 4 ° c.에 저장
   4. 세척 솔루션 준비 (0.1% 트윈-PBS) 위에서 설명한 대로 준비 하는 PBS의 100 mL에 트윈 20 (100%)의 100 μ를 추가 하 여 (2.1.1 단계 참조). 4 ° c.에 게
   5. 전극 준비 솔루션 준비 (1% 트라이 톤 X-100-PBS) 100 ml PBS 준비 위에서 설명한 대로의 트라이 톤 X-100 (100%)의 1 mL을 추가 하 여 (2.1.1 단계 참조). 4 ° c.에 게
   6. 최종 볼륨을 증류수에 KCl의 26 g을 용 해 하 여 전극 재생 솔루션 (3.5 M KCl) 준비 100 mL. 살 균 필터와 4 ° c.에 게
   7. 1 나 필터를 소독 및 4 ° c.에 저장의 최종 볼륨을 증류수에 NaCl의 0.29 g를 용 해 하 여 5 mM NaCl 솔루션을 준비 그런 다음, 5 mM NaCl 솔루션의 20 mL에 benzylpenicillin의 26.7 mg를 용 해 하 여 탐지 솔루션 (4 m m benzylpenicillin)를 준비 합니다. 필터를 소독 하 고-20 ° c.에 저장
2. 센서 준비 및 재생
   참고:는 폴리아닐린 코팅 센서 칩 개발 하 고 친절 하 게 박사 P. Bogaerts, 닥터 미 유 누스 교수부터 Y. Glupczynski의 (가톨릭 대학교의 루 베인 라-브-추 몽-Godinne)에 의해 제공 되었다. 폴리아닐린 전기 합 프로토콜 이러한 센서를 합성 하는 데 사용 되는 센서의 설명 그들의 이전 일¹⁷에 자세히 나와 있습니다. 간단히,이 시스템은 고전 인쇄 회로 기판 (PCB) 기술에 의해 제조 된 8 개의 개별 칩의 재사용 가능한 센서를 사용 합니다. 개별 칩 3 개의 전극으로 구성 된 라운드 명소. 상위 1은 작업 전극은 폴리아닐린에 전기 합성 했다. 중간에 한 참조 전극 이며 하단 전극 구성 카운터 전극. 둘 다, 참조 및 카운터 전극은 기능성 탄소 레이어 위에 단단한 Ag/AgCl 혼합을 사용 하 여.
   1. 3 세척 전극의 전극 준비 솔루션의 300 µ L/잘을 포함 하는 96 잘 접시의 우물에는 팁을 찍기 여 수행 (1% 트라이 톤 X-100-PBS, 참조 단계 2.1.5.). 실 온에서 부드러운 혼합으로 2 분 동안 각 세척을 수행 합니다.
   2. 실 온에서 부드러운 혼합으로 2 분 증류수의 300 µ L/잘을 포함 하는 96 잘 접시의 우물에는 팁을 찍기 하 여 전극 린스.
   3. 포함 하는 재생 솔루션의 300 µ L/잘 96 잘 접시의 우물으로 팁을 찍기 여 전극을 다시 생성 (3.5 M KCl, 단계 2.1.6 참조) 4 ° C 또는 실 온에서 1 h에서 하룻밤.
   4. 인산 염 버퍼 염 분의 300 µ L/잘을 포함 하는 96 잘 접시의 우물에는 팁을 찍기 하 여 전극의 3 세척을 수행 (2.1.1 단계를 참조 하십시오.). 실 온에서 부드러운 혼합으로 2 분 동안 각 세척을 수행 합니다.
3. 센서에 수행 분석 결과 바인딩
   1. 40 µ g/mL PBS에서 준비 하는 전극 표면에 HEWL의 15 µ L 드롭 입금 하 여 전극의 PANI (폴리아닐린) 표면 코트 HEWL. 4 ° C 또는 실 온에서 1 시간에서 밤새 품 어.
   2. 인산 염 버퍼 식 염 수와 전극의 3 개의 세척을 수행 (2.1.1 단계 참조) 포함 하는 인산 염 버퍼 염 분의 300 µ L/잘 96 잘 접시의 우물으로 센서 칩의 전극 부분을 찍기로. 실 온에서 부드러운 혼합으로 2 분 동안 각 세척을 수행 합니다.
   3. 50 µ L 방울 차단 솔루션을 추가 하 여 전극 포화 (단계 2.1.2 참조) 전극 표면에. 실 온에서 1 h에 품 어. 다음 단계 (단계 2.3.2 참조)는 이전에 설명 된 대로 세 번 세척.
   4. BlaP-택시-Lys3 솔루션 바인딩 솔루션에서 20 µ g/mL를 희석 (단계 2.1.3 참조) 15 µ L 방울 전극에 희석된이 솔루션을 적용. 실 온에서 10 분 동안 품 어. 항 원-nanobody 반응 후 세척 솔루션을 사용 하 여 이전 단계에서 세척을 3 번으로 설명 (2.1.4 단계 참조). 다음 한 번 PBS와 전극 린스 (2.1.1 단계 참조).
   5. 검색, 디지털 멀티 미터에 구리 회로 부분을 통해 센서 칩을 연결 합니다. 그런 다음 50 µ L 방울 탐지 솔루션을 적용 하 여 센서 응답 시작 (단계 2.1.7 참조) 긍정적인 전극에 적용 (단계 2.1.7 참조) 부정적인 전극에 NaCl 5mm 솔루션의 50 µ L 드롭. 실 온에서 30 분 동안 품 어. 디지털 멀티 미터와는 전도성을 모니터링 합니다.
      참고:는 멀티 미터 박사 P. Bogaerts, 닥터 미 유 누스 교수부터 Y. Glupczynski의 (가톨릭 대학교의 루 베인 라-브-추 몽-Godinne에 의해 제공 된. 이 potentiostat 컴퓨터 USB 포트를 통해 제어 하 고 동시에 센서의 8 개의 서로 다른 칩을 분석 합니다. 유 누스와 동료¹⁷ 에 의해 만들어진 소프트웨어는 실시간 플롯 시간에 대 한 참조 및 샘플 전극의 전도도 차이의 측정을 나타내는 만듭니다.

결과

설계 및 엔지니어링의 공상 단백질 BlaP-택시-Lys3

그림 1 균 licheniformis에서 BalP 클래스 A β-lactamase의 관대 한 루프에 택시 Lys3의 삽입을 나타냅니다. 삽입은 잔류물 Asp198와 Lys199 사이 수행 되었다. 트 롬 빈 분열 사이트 택시-Lys3의 각 측면에 도입 되었다. BlaP-택시-Lys3 공상 단백질 인코딩 구성 식 플라스 미드와 변형 세포 암 ?...

토론

이 작품에서는 캐리어 단백질으로 BlaP β-lactamase를 사용 하 여 nanobody를 functionalize 하는 방법을 소개 하 고 우리는 우리가 성공적으로 구현할 수 결과 하이브리드 단백질 potentiometric 센서 분석 결과 보여. 다른 바이오 센서 분석 실험에 비해 우리의 작업의 주요 혁신 측면은 전기 신호를 생성 하는 효소 활동을 항 체 부분의 공유 결합. 이 소위 단백질 삽입 기술 선물 장점과 한계가이 섹션의 주요 초?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
KH2PO4	Sigma-Aldricht	V000225
K2HPO4	Sigma-Aldricht	1551128
NaCl	Sigma-Aldricht	S7653
Tris–HCl	Roche	10812846001
EDTA	Sigma-Aldricht	E9884
KCl	Sigma-Aldricht	P9541
Na2HPO4	Sigma-Aldricht	NIST2186II
2-mercaptoethanol	Sigma-Aldricht	M6250
alanine	Sigma-Aldricht	A7627
HClO4	Fluka	34288	1M HClO4 solution, distributor : Sigma-Aldricht
casein hydrolysate	Sigma-Aldricht	22090
benzylpenicillin sodium	Sigma-Aldricht	B0900000
hen egg white lysozyme	Roche	10837059001
heptane	Sigma-Aldricht	246654
methanol	Sigma-Aldricht	322415
ammonium hydroxide solution	Sigma-Aldricht	380539	28% NH3 in H2O, purified by double-distillation (concentrated?)
Laboratory consumables
6-well plate	Greiner Bio-One	657165	CELLSTAR 6-Well Plate
Equipment
pH meter	WTW	1AA110	Lab pH meter inoLab pH 7110
vacuum and filtration system	Nalgene	NALG300-4100	Filter holders with receiver, distributor : VWR
potentiometric sensor chips			manufactured by Yunus and colleagues (ref 16)
PGSTAT30 Autolab	Metrohm Autolab		discontinued, succesor Autolab PGSTAT302N
digital multimeter, METRAHit 22M	Gossen Metrawatt		discontinued, successor Metrahit Base