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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

In questo lavoro, segnaliamo un nuovo metodo per studiare le interazioni proteina-proteina usando un biosensore conduttimetriche basato sulla tecnologia ibrida β-lattamasi. Questo metodo si basa sul rilascio di protoni all'idrolisi di β-lattami.

Abstract

Biosensori stanno diventando sempre più importante e implementata in vari campi quali rilevamento del patogeno, diagnosi molecolare, monitoraggio ambientale e controllo della sicurezza alimentare. In questo contesto, abbiamo usato il β-lattamasi come enzimi reporter efficiente in diversi studi di interazione proteina-proteina. Loro capacità di accettare gli inserimenti di peptidi o proteine/domini strutturati fortemente incoraggia inoltre l'uso di questi enzimi per generare proteine chimeriche. In uno studio recente, abbiamo inserito un frammento di anticorpo di singolo dominio il Bacillus licheniformis BlaP β-lactamase. Questi piccoli domini, chiamati anche nanobodies, sono definiti come i domini di antigene-leganti degli anticorpi di singola catena da camelidi. Come comune doppia catena anticorpi, essi mostrano elevata affinità e specificità per i loro obiettivi. La proteina chimerica risultante ha esibito un'alta affinità contro il bersaglio mantenendo l'attività β-lattamasi. Ciò suggerisce che le moiety nanobody e β-lactamase rimangono funzionali. Nel lavoro attuale, segnaliamo un protocollo dettagliato che combina il nostro sistema di β-lactamase ibrido per la tecnologia dei biosensori. Il grippaggio specifico di nanobody al suo target può essere rilevato grazie a una misurazione conduttimetriche dei protoni rilasciato dall'attività catalitica dell'enzima.

Introduzione

Biosensori sono dispositivi analitici che combinano un'interazione bio-molecolari con dispositivi di segnalazione fisiche o chimiche denominate trasduttori1. Segnali registrati possono quindi essere interpretati e convertiti per monitorare le interazioni tra i partner immobilizzati e gratuiti. La maggior parte dei biosensori implicano l'uso di un anticorpo per rilevare analiti come ormoni o agente patogeno differente marcatori2. Formati di sensore diverso possono essere utilizzati e includono biosensori basati su massa, magnetici, ottici o elettrochimici. Quest'ultimo è tra i più comuni sensori utilizzati e funzione di conversione di un evento di associazione in un segnale elettrico. Le prestazioni e la sensibilità di tutti i biosensori basati su anticorpi sono fortemente dipendenti essenzialmente due parametri: i) la qualità dell'anticorpo e ii) le proprietà del sistema utilizzato per generare il segnale2.

Gli anticorpi sono proteine dimeriche massa molecolarità (150 – 160 kDa) che sono composte da due catene pesanti e due catene leggere. L'interazione tra le catene leggere e pesanti per la maggior parte è stabilizzata da interazioni idrofobiche, come pure un legame disolfuro conservato. Ogni catena include un dominio variabile che interagisce con l'antigene essenzialmente tramite tre regioni ipervariabili denominato complementari determinare regioni (CDR1-2-3). Nonostante i numerosi progressi nel settore, l'espressione su larga scala di anticorpi full-length con sistemi di espressione di basso costo (ad es., Escherichia coli) spesso porta alla produzione di proteine instabili e aggregate. Ecco perché vari frammenti di anticorpo sono stati progettati come catena singola variabile frammenti3 (ScFvs ≈ 25 kDa). Sono costituiti da domini variabili di rispettivamente uno pesante e uno catene leggere che sono legati covalentemente da una sequenza di amminoacido sintetico. Tuttavia, questi frammenti spesso visualizzare una scarsa stabilità e hanno la tendenza ad aggregare, poiché espongono una grande parte delle loro regioni idrofobiche a solvente4. In questo contesto, frammenti di anticorpo camelide singola catena, indicati come nanobodies o VOX, sembrano essere ottime alternative a ScFvs. Questi domini corrispondono ai domini variabili degli anticorpi di camelide catena singola. In contrasto con gli anticorpi convenzionali, camelide anticorpi sono privi di catene chiare e contengono solo due catene pesanti5. Pertanto, nanobodies sono i frammenti di anticorpo monomerico più piccoli (12 kDa) in grado di legarsi a un antigene con un'affinità simile a quella di anticorpi convenzionali6. Inoltre, presentano una maggiore stabilità e solubilità rispetto ad altri anticorpi Full-Length o frammenti di anticorpo. Infine, le piccole dimensioni e loro estesi cicli CDR3 permettono loro di riconoscono epitopi criptici e si legano a siti attivi dell'enzima7,8. Al giorno d'oggi, questi domini stanno ricevendo una notevole attenzione e sono stati combinati per la tecnologia dei biosensori. Ad esempio, Huang et al. hanno sviluppato un biosensore basato su nanobody per la rilevazione e la quantificazione di umano antigene prostatico specifico (PSA)9.

Come sopra accennato, un parametro importante nelle analisi di biosensore è l'efficienza del sistema utilizzato per generare il segnale elettrico. Per questo motivo, biosensori elettrochimici basati su enzima hanno attirato l'attenzione crescente e sono stati ampiamente utilizzati per varie applicazioni quali sanità, sicurezza alimentare e monitoraggio ambientale. Questi biosensori affidano l'idrolisi catalitica di un substrato di un enzima per generare il segnale elettrico. In questo contesto, β-lattamasi sono stati indicati per essere più specifici, più sensibile e più facile da implementare sperimentalmente rispetto a molti altri enzimi come la fosfatasi alcalina o perossidasi di rafano10. Β-lattamasi sono enzimi che sono responsabili della resistenza batterica agli antibiotici β-lattamici idrolizzando li. Sono monomerici, molto stabile, efficiente e di piccole dimensioni. Inoltre, gli inserimenti di dominio/peptide in β-lattamasi generano proteine chimeriche bi-funzionali che sono state indicate per essere strumenti efficaci per studiare le interazioni proteina-ligando. Infatti, recenti studi hanno dimostrato che inserimento di variabile frammenti anticorpali nei risultati del β-lactamase TEM1 in una proteina chimerica che rimane in grado di legarsi con alta affinità per l'antigene bersaglio. È interessante notare che, l'associazione dell'antigene è stato indicato per indurre la regolazione allosterica di TEM1 attività catalitica11,12. Inoltre, abbiamo dimostrato in diversi studi che l'inserzione di dominio della proteina in un ciclo permissivo del Bacillus licheniformis BlaP β-lactamase genera proteine chimeriche funzionali che ben si adattano per monitorare le interazioni proteina-ligando13 ,14. Recentemente abbiamo inserito un nanobody, denominato cAb-Lys3, in questo sito di inserimento permissiva di BlaP15. Questo nanobody è stato indicato da associare alla gallina albume lisozima (HEWL) e di inibire la sua attività enzimatica16. Abbiamo mostrato che la proteina ibrida generato, denominata BlaP-cabina-Lys3, mantenuto un'alta specificità / affinità contro HEWL mentre l'attività β-lactamase è rimasto invariato. Poi con successo abbiamo combinato la tecnologia di β-lactamase ibrida di un biosensore elettrochimico e ha mostrato che la quantità di segnale elettrico generato era dipendente dell'interazione tra BlaP-cabina-Lys3 e HEWL immobilizzati su un elettrodo. Infatti, l'idrolisi degli antibiotici β-lattamici BlaP induce un rilascio di protoni che può essere convertito in un segnale elettrico quantitativo. Questa combinazione della tecnologia ibrida β-lactamase con un biosensore elettrochimico è veloce, sensibile e quantitativa e permette di misurare in tempo reale il segnale generato. Questa metodologia è descritto qui.

Protocollo

1. preparazione del campione proteina

  1. Produrre e purificare la proteina ibrida BlaP-cabina-Lys3 come riportato nel nostro precedente studio15. Memorizzare la proteina in 50 mM tampone fosfato pH 7.4 con la seguente composizione: 8 g di NaCl, 0,2 g di KCl, 1,44 g di Na2HPO4 e 0,24 g di KH2PO4 disciolto in 800 mL di acqua distillata difficoltà il pH della soluzione a 7.4 prima regolazione del volume finale della soluzione a 1 L. filtro sterilizzare la soluzione della proteina.
  2. Preparare una soluzione stock di gallina albume lisozima (HEWL). Sciogliere 100 mg (40.000 unità/mg) di HEWL acquistato in commercio in 10 mL di soluzione fisiologica di tampone fosfato (PBS Vedi punto 2.1.1). Sterilizzare la soluzione della proteina di filtrazione con filtri con un cutoff di 0.22 μm.

2. biosensore saggi

  1. Preparazione soluzione e buffer
    1. Preparare 50 mM PBS sciogliendo 8 g di NaCl, 0,2 g di KCl, 1,44 g di Na2HPO4e 0,24 g di KH2PO4 in 800 mL di acqua distillata. Regolare il pH 7.4 con 1 N HCl o NaOH N 1 prima di regolare il volume della soluzione a 1 L. filtro sterilizzare e conservare a 4 ° C.
    2. Preparare una soluzione di saturazione/blocco da sciogliere 3 g di idrolizzato di caseina in 100 mL di PBS preparato come descritto in precedenza (Vedi punto 2.1.1). Filtro sterilizzare e conservare a 4 ° C.
    3. Preparare una soluzione di associazione sciogliendo 1 g di idrolizzato di caseina in 100 mL di PBS preparato come descritto in precedenza (Vedi punto 2.1.1). Filtro sterilizzare e conservare a 4 ° C.
    4. Preparare una soluzione di lavaggio (0.1% Tween - PBS) aggiungendo 100 μL di Tween 20 (100%) in 100 mL di PBS preparato come descritto in precedenza (Vedi punto 2.1.1). Conservare a 4 ° C.
    5. Preparare una soluzione di preparazione dell'elettrodo (1% Triton X-100-PBS) aggiungendo 1 mL di Triton X-100 (100%) in 100 mL di PBS preparato come descritto in precedenza (Vedi punto 2.1.1). Conservare a 4 ° C.
    6. Preparare una soluzione di rigenerazione di elettrodo (3.5 M KCl) sciogliendo 26 g di KCl in acqua distillata fino ad un volume finale 100 mL. Filtro sterilizzato e conservare a 4 ° C.
    7. Preparare una 5 mM NaCl soluzione sciogliendo 0,29 g di NaCl in acqua distillata ad un volume finale di 1 L. filtro sterilizzare e conservare a 4 ° C. Quindi, preparare una soluzione di rilevamento (4 mM benzilpenicillina) sciogliendo 26,7 mg di benzilpenicillina in 20 mL di soluzione NaCl di 5 mM. Filtro sterilizzare e conservare a-20 ° C.
  2. Rigenerazione e preparazione del sensore
    Nota: Il polyaniline rivestito sensore chip sono stati sviluppati e gentilmente fornito da Dr. P. Bogaerts, Dr. S. Yunus e Prof. ssa Y. Glupczynski (cattolico Università di Louvain-la-Neuve - CHU Mont-Godinne). La descrizione del sensore, nonché i protocolli di electro-polimerizzazione polyaniline utilizzati per sintetizzare questi sensori sono dettagliati nel loro precedente lavoro17. Brevemente, questo sistema utilizza sensori riutilizzabili di otto chip individuali che sono state prodotte da tecniche di classico circuito stampato (PWB). Singolo chip sono composti da tre elettrodi macchie tonde. Quella in alto è l'elettrodo di lavoro il quale polyaniline era electro-sintetizzato. Quella centrale è l'elettrodo di riferimento e l'elettrodo inferiore costituisce il controelettrodo. Il riferimento sia gli elettrodi contatore sono funzionalizzati con amalgama di Ag/AgCl solido sopra lo strato di carbonio.
    1. Effettuare 3 lavaggi degli elettrodi immergendo le punte nei pozzetti di una piastra a 96 pozzetti contenenti 300 µ l/pozzetto di soluzione di preparazione di elettrodi (Vedi Triton X-100-PBS, 1% passo 2.1.5.). Eseguire ogni lavaggio per 2 min con miscelazione delicata a temperatura ambiente.
    2. Sciacquare gli elettrodi immergendo le punte nei pozzetti di una piastra a 96 pozzetti contenenti 300 µ l/pozzetto di acqua distillata per 2 min con miscelazione delicata a temperatura ambiente.
    3. Rigenerare gli elettrodi immergendo le punte nei pozzetti di una piastra a 96 pozzetti contenenti 300 µ l/pozzetto di soluzione di rigenerazione (3.5 M KCl, vedi punto 2.1.6) overnight a 4 ° C o 1 h a temperatura ambiente.
    4. Effettuare 3 lavaggi degli elettrodi immergendo le punte nei pozzetti di una piastra a 96 pozzetti contenenti 300 µ l/pozzetto di soluzione salina tampone fosfato (v. punto 2.1.1). Eseguire ogni lavaggio per 2 minuti con miscelazione delicata a temperatura ambiente.
  3. Analisi di associazione eseguita sul sensore
    1. Cappotto HEWL sulla superficie dell'elettrodo PANI (polianilina) depositando una goccia di 15 µ l di 40 µ g/mL HEWL preparato in PBS sulla superficie dell'elettrodo. Incubare per una notte a 4 ° C o 1 ora a temperatura ambiente.
    2. Eseguire tre lavaggi degli elettrodi con soluzione salina tampone fosfato (Vedi punto 2.1.1) immergendo le parti elettrodo dei chip sensore nei pozzetti di una piastra a 96 pozzetti contenenti 300 µ l/pozzetto di soluzione salina tampone fosfato. Eseguire ogni lavaggio per 2 min con miscelazione delicata a temperatura ambiente.
    3. Saturare gli elettrodi con l'aggiunta di una goccia di 50 µ l di soluzione bloccante (Vedi punto 2.1.2) sulla superficie dell'elettrodo. Incubare per 1 h a temperatura ambiente. Quindi lavare tre volte come descritto nel precedente passo (vedere il punto 2.3.2).
    4. Diluire la soluzione di BlaP-cabina-Lys3 a 20 µ g/mL in soluzione di associazione (Vedi punto 2.1.3) e applicare una goccia di 15 µ l di questa soluzione diluita sugli elettrodi. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. Dopo la reazione antigene-nanobody, lavare tre volte come descritto nel passaggio precedente utilizzando la soluzione di lavaggio (Vedi punto 2.1.4). Quindi sciacquare l'elettrodo una volta con PBS (Vedi punto 2.1.1).
    5. Per il rilevamento, collegare il chip sensore tramite la parte di circuiti di rame di un multimetro digitale. Quindi, avviare la risposta del sensore applicando una goccia di 50 µ l di soluzione di rilevamento (Vedi punto 2.1.7) sugli elettrodi positivi e applicando una goccia di 50 µ l di soluzione di NaCl 5 mM sugli elettrodi negativi (Vedi punto 2.1.7). Incubare per 30 min a temperatura ambiente. Monitorare la conduttanza con un multimetro digitale.
      Nota: Il multimetro è stato fornito da Dr. P. Bogaerts, Dr. S. Yunus e Prof. ssa Y. Glupczynski (cattolico Università di Louvain-la-Neuve - CHU Mont-Godinne. Questo potenziostato è controllato dal computer tramite una porta USB e analizza le otto diversi chip del sensore simultaneamente. Il software creato da Yunus e colleghi17 crea un plot in tempo reale che rappresenta le misure della differenza conduttanza tra gli elettrodi di riferimento e campione contro il tempo.

Risultati

Design e ingegneria della proteina chimerica BlaP-cabina-Lys3

Figura 1 rappresenta l'inserimento di cabina-Lys3 in un ciclo permissivo della BalP classe A β-lactamase da Bacillus licheniformis. L'inserimento è stato effettuato fra i residui Asp198 e Lys199. Un sito di clivaggio della trombina è stata introdotta su ciascun lato della cabina-Lys3. Cellule trasformate con un plasmide di espressione costitutiva che codifica...

Discussione

In questo lavoro presentiamo un metodo per funzionalizzare un nanobody utilizzando il β-lactamase BlaP come una proteina carrier e mostriamo che possiamo implementare con successo la proteina ibrida risultante in un'analisi di sensore potenziometrico. L'aspetto di innovazione principale del nostro lavoro rispetto ad altri dosaggi di biosensore è l'accoppiamento covalente della parte dell'anticorpo per l'attività enzimatica che genera il segnale elettrico. Questa tecnologia di inserimento della cosiddetta proteina pres...

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Riconoscimenti

Gli autori riconoscono la regione vallona del Belgio, nel quadro dei progetti di ricerca SENSOTEM e NANOTIC nonché la nazionale fondi per la ricerca scientifica (f.r.s.-F.N.R.S) per il loro sostegno finanziario.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Reagents
KH2PO4Sigma-AldrichtV000225 
K2HPO4Sigma-Aldricht1551128
NaClSigma-AldrichtS7653
Tris–HClRoche10812846001
EDTA Sigma-AldrichtE9884
KClSigma-AldrichtP9541
Na2HPO4 Sigma-AldrichtNIST2186II
2-mercaptoethanolSigma-AldrichtM6250
alanineSigma-AldrichtA7627
HClO4Fluka342881M HClO4 solution, distributor : Sigma-Aldricht
casein hydrolysateSigma-Aldricht22090
benzylpenicillin sodiumSigma-AldrichtB0900000
hen egg white lysozymeRoche10837059001
heptaneSigma-Aldricht246654
methanolSigma-Aldricht322415
ammonium hydroxide solutionSigma-Aldricht38053928% NH3 in H2O, purified by double-distillation (concentrated?)
Laboratory consumables
6-well plate Greiner Bio-One657165CELLSTAR 6-Well Plate
Equipment
pH meterWTW1AA110Lab pH meter inoLab pH 7110
vacuum and filtration systemNalgeneNALG300-4100Filter holders with receiver, distributor : VWR
potentiometric sensor chipsmanufactured by Yunus and colleagues (ref 16)
PGSTAT30 AutolabMetrohm Autolabdiscontinued, succesor Autolab PGSTAT302N
digital multimeter, METRAHit 22MGossen Metrawattdiscontinued, successor Metrahit Base

Riferimenti

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