منهج تنوعا من الزخرفة البروتينات والخلايا

Summary

This report describes a simple, easy to perform technique, using low pressure vacuum, to fill microfluidic channels with cells and substrates for biological research.

Abstract

Substrate and cell patterning techniques are widely used in cell biology to study cell-to-cell and cell-to-substrate interactions. Conventional patterning techniques work well only with simple shapes, small areas and selected bio-materials. This article describes a method to distribute cell suspensions as well as substrate solutions into complex, long, closed (dead-end) polydimethylsiloxane (PDMS) microchannels using negative pressure. This method enables researchers to pattern multiple substrates including fibronectin, collagen, antibodies (Sal-1), poly-D-lysine (PDL), and laminin. Patterning of substrates allows one to indirectly pattern a variety of cells. We have tested C2C12 myoblasts, the PC12 neuronal cell line, embryonic rat cortical neurons, and amphibian retinal neurons. In addition, we demonstrate that this technique can directly pattern fibroblasts in microfluidic channels via brief application of a low vacuum on cell suspensions. The low vacuum does not significantly decrease cell viability as shown by cell viability assays. Modifications are discussed for application of the method to different cell and substrate types. This technique allows researchers to pattern cells and proteins in specific patterns without the need for exotic materials or equipment and can be done in any laboratory with a vacuum.

Introduction

في هندسة الأنسجة وbiosensing، والقدرة على التحكم في التنظيم المكاني للبروتينات وخلايا على نطاق ميكرون، أصبحت ذات أهمية متزايدة على مدى العقود الأربعة الماضية ^{1، 2، 3.} وقد سمح التنظيم المكاني دقيقة من البروتينات والخلايا الباحثين لدراسة التفاعل بين الخلايا وركائز التي تحتوي على أنواع مماثلة أو مختلفة من الخلايا، لتوجيه نمو الخلايا، ولشل حركة الجزيئات الحيوية لتصنيع أجهزة الاستشعار ^{4، 5، 6، 7، 8، 9.}

وتشمل الأساليب الحالية للبروتينات الزخرفة photopatterning وmicrocontact الطباعة. Photopatterning تستخدم المواد الحساسة للضوء التي crosslinked عند التعرض لغلاهالأشعة فوق البنفسجية (UV) الضوء. ضوء الأشعة فوق البنفسجية التي تستهدف الضوئية الرئيسية (التي تتكون من مناطق شفافة مع المناطق الداكنة لمنع الأشعة فوق البنفسجية نقل الضوء) يسبب يشابك في مناطق محددة والتي يمكن استخدامها بعد ذلك لمرفق لاحق من المواد الحيوية أو خلايا ^{10 و 11.} في حين أن هذا المخطط هو دقيق جدا ويسمح لمراقبة دقيقة من تضاريس سطح الثقافة، فإنه يقتصر على الجزيئات الحيوية حساسة للأشعة فوق البنفسجية التي يمكن نمط من الأشعة فوق البنفسجية ^(12). microcontact الطباعة هي طريقة شعبية أخرى من الزخرفة بروتينات معينة ^{13 و 14.} في هذه الطريقة، يتم التعامل على siloxane (PDMS) ختم بولي ميثيل مع مجموعة متنوعة من الكواشف تعديل السطح قبل نقعه في حل الركيزة الجزيئية البيولوجية الذي تم اختياره. ثم يتم الضغط برفق على ساترة الزجاج أو أي سطح آخر وهكذا "ختم" جزيء حيوي على سطح الثقافة. هوويفر، يقتصر ختم لنوع من المواد التي يمكن نقلها وكذلك بلل من الجزيئات الحيوية لسطح PDMS ختم ^15.

الزخرفة مباشرة من الخلايا يمكن أن يكون أكثر صعوبة وتعتمد على أساليب معقدة مثل ركائز للتحويل، وأساليب الاستنسل مقرها، أو الزخرفة مع خلية التصاق جزيئات محددة ^{16 و 17.} تقتصر هذه الأساليب في قدرتها على خلايا نمط نظرا لعدم وجود متوافقة ركائز التصاق الخلية، عدم توافق عملية للعمل مع الخلايا الحساسة البيولوجية والقيود، عدم الاتساق في استنساخ الزخرفة، وتعقيد الإجراءات. على سبيل المثال، مع ركائز للتحويل، تحتاج ركائز مخصصة لتكون مصممة لكل نوع من الخلايا، لتبديل تمسكهم أنواع معينة من الخلايا دون تدهور عند التعرض لضوء الأشعة فوق البنفسجية والحرارة المستخدمة في عملية ¹⁷ < الطبقة سوب = "XREF"> ^{18، 19، 20.} أساليب الزخرفة على أساس الاستنسل وتنوعا في قدرتها على خلايا النمط. ومع ذلك، فإنه من الصعب لتصنيع الإستنسل PDMS في سمك مناسبة للاستخدام ^{16، 21.} الحقن المباشر للخلايا في القنوات ميكروفلويديك PDMS لها بعض المزايا مثل: 1) سهولة في تلفيق من القنوات ميكروفلويديك و2) ملاءمة لكثير من الخلايا وركائز مختلفة. ومع ذلك، فإن القضية السائدة من القبض على فقاعة الهواء أثناء عملية الحقن بسبب للا مائية من PDMS دون استخدام تنظيف البلازما، أو وسائل أخرى لتقليل فقاعات الهواء، ويجعل من الصعب خلق باستمرار خلايا نقوش على الزجاج أو البلاستيك السطوح ^21.

توسع هذا العمل على شعري micromolding ^{22، 23،}معشوقة = "XREF"> 24 ^{و 25 و 26} و تقارير طريقة لحقن البروتين والخلايا تعليق في microchannels. الطريقة المستخدمة هنا يدل على الزخرفة من ركائز وكلا الزخرفة المباشرة وغير المباشرة لأنواع معينة من الخلايا. هذه التقنية يتغلب للا مائية عالية من PDMS ويلغي وجود فقاعات أثناء الحقن إما ركائز أو الخلايا عن طريق الاستفادة من نفاذية الغاز من PDMS ^27. توضح هذه الورقة استخدام هذه التقنية مع العديد من ركائز مختلفة وأنواع الخلايا. كما يسلط الضوء على المادة في تصنيع قوالب الطباعة الحجرية الناعمة باستخدام ضوئيه التقليدية فضلا عن بسيطة ولاصقة منخفضة التكلفة طريقة الشريط المفيد في الموارد إعدادات محدودة ^{28، 29.}

Protocol

ملاحظة: يرجى الرجوع إلى جميع بيانات سلامة المواد ذات الصلة (MSDS) قبل الاستخدام. بعض المواد الكيميائية المستخدمة في هذا البروتوكول سامة ومسرطنة. الرجاء استخدام جميع ممارسات السلامة المناسبة (غطاء الدخان، صندوق قفازات) ومعدات الوقاية الشخصية (النظارات الواقية والقفازات ومعطف المختبر، كامل طول السراويل والأحذية المغلقة اصبع القدم) عند استخدام المواد السامة أو حمض / قاعدة.

1. تصنيع ماستر لقوالب لينة الطباعة الحجرية باستخدام الطباعة التصويرية

1. رسم تخطيط متناهية باستخدام أداة رسم التصميم بمساعدة الكمبيوتر (CAD).
2. طباعة تخطيط على طبق من ذهب قناع فارغة باستخدام الكاتب قناع الليزر.
3. شطف رقاقة السيليكون 4 بوصة مع الأسيتون تليها الأيزوبروبانول والجافة مع بندقية الهواء النيتروجين لضمان عدم ترك أي مذيب على الرقاقة.
4. يذوى رقاقة عن طريق الخبز على طبق ساخن على حرارة 200 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
5. اختر مقاومة للضوء سلبي مصممة للارتفاع المطلوب من و microchannels. Fأو سبيل المثال، استخدم مقاومة للضوء سلبي SU-8 50 للحصول على microchannels مع ارتفاع 50 ميكرون.
6. تسمح الرقاقة ليبرد إلى درجة حرارة الغرفة، ثم محاذاة رقاقة على ظرف من المغطي تدور.
7. الاستغناء عن 4 مل (1 مل / بوصة قطر الرقاقة) من مقاومة للضوء سلبي على مركز الرقاقة.
8. تدور معطف الرقاقة مع دورة تدور على مرحلتين باستخدام الدوار. أولا، وتطبيق دورة انتشار 500 دورة في الدقيقة مع تسارع من 100 دورة في الدقيقة / ثانية لمدة 10 ثانية. ثم تطبيق دورة دوران 2000 دورة في الدقيقة مع تسارع من 300 دورة في الدقيقة / ق ² لمدة 30 ثانية للحصول على طلاء 50 ميكرون من مقاوم الضوء على رقاقة.
9. خبز لينة الرقاقة في خطوتين على طبق ساخن وفقا لإرشادات الشركة المصنعة. لطلاء 50 ميكرون من مقاومة للضوء، لأول مرة قبل خبز الرقاقة عند 65 درجة مئوية لمدة 6 دقائق ثم المنحدر فورا درجة الحرارة صفيحة ساخنة لمرحلة ما بعد خبز الرقاقة عند 95 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
10. تسمح الرقاقة ليبرد إلى درجة حرارة الغرفة ثم تحميلرقاقة على خشبة المسرح الطباعة الحجرية.
11. محاذاة قناع على الرقاقة باستخدام قناع اليجنر وفضح الرقاقة للأشعة فوق البنفسجية (وفقا لتعليمات الشركة المصنعة) في كثافة من 1.5 ميغاواط / سم ² ل 146 ق لتطبيق الجرعة الكلية للأشعة فوق البنفسجية من 220 ميغا جول / سم ² المطلوبة ل 50 ميكرون طبقة سميكة من مقاومة للضوء.
12. تطبيق بعد التعرض خبز إلى رقاقة في خطوتين على طبق ساخن. لطلاء 50 ميكرون من مقاومة للضوء، لأول مرة قبل خبز الرقاقة عند 65 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة وعلى الفور تكثيف درجة الحرارة صفيحة ساخنة لمرحلة ما بعد خبز أنه في 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
13. تطوير رقاقة في قبل غمر الرقاقة في SU-8 المطور ويهز بلطف حتى تصبح ملامح واضحة على الرقاقة. تطوير رقاقة ل~ 6 دقائق للمقاومة للضوء سميكة 50 ميكرون.
14. شطف المطور الزائد مع الأيزوبروبانول والإيثانول، ثم تجفيف رقاقة مع بندقية الهواء النيتروجين.
15. من الصعب خبز رقاقة السيليكون على طبق ساخن على 150 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
16. ضع الرقاقة في مجفف مع 25 ميكرولتر من وكيل silanizing tridecafluoro-1،1،2،2-tetrahydrooctyl-1-trichlorosilane.
    ملاحظة: عامل silanizing غير قابلة للتآكل، وبالتالي ينبغي أن تستخدم في غطاء الدخان حمض / قاعدة، مع معدات الحماية الشخصية المناسبة (نظارات السلامة، والقفازات، معطف المختبر، كامل طول السراويل مغلقة اصبع القدم أحذية).
17. تطبيق فراغ لمدة 5 دقائق وفضح الرقاقة لأبخرة من سيلاني لمدة 30 دقيقة دون الإفراج عن فراغ.
18. نقل رقاقة في طبق بيتري الحجم بشكل مناسب.

2. تصنيع ماستر لقوالب لينة الطباعة الحجرية باستخدام شريط لاصق

1. رسم تخطيط متناهية باستخدام أداة رسم CAD وطباعة الرسم على ورقة بيضاء.
2. تنظيف شريحة زجاجية كبيرة بما يكفي لاستيعاب تصميم مع الأيزوبروبانول ثم تجف الشريحة مع بندقية الهواء.
3. إرفاق شريط لاصق على الشريحة الزجاجية تنظيفها. يجب الحرص على عدم اعتراض أي فقاعات الهواء.
4. الشريط جانبي GLASS تنزلق على ورقة مع تصميم ومع الشريط لأعلى.
5. استخدام مشرط لقطع الشريط على شريحة زجاجية باستخدام تصميم ورقة كمرجع ثم تقشر الشريط من المناطق غير المرغوب فيها من شريحة زجاجية.
6. شطف الشريحة الزجاجية مع الأيزوبروبانول وجاف ثم مع بندقية الهواء. خبز الشريحة الزجاجية في فرن عند 65 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
7. لفة بلطف على الشريط مع بكرة مطاطية لإزالة فقاعات الهواء والسماح الشريحة ليبرد إلى درجة حرارة الغرفة.

3. لينة الطباعة الحجرية تصنيع الأجهزة PDMS

1. مزيج PDMS المطاط الصناعي وكيل علاج في نسبة 10: 1 (ث: ث)، وتحريك الخليط بقوة، ثم ديغا الخليط عن طريق وضعها في غرفة فراغ حتى لا تظهر فقاعات الهواء في الخليط.
2. يصب الخليط على قالب السيليكون silanized أو العفن شريط لاصق في طبق بتري للحصول على طبقة سميكة من PDMS وديغا و~ 2 مم حتى عن الهواء تختفي فقاعات.
3. علاج PDMS في فرنعند 65 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
4. استخدام مشرط لقطع طبقة PDMS 5 مم على الأقل بعيدا عن الميزات وثم قشر PDMS شفي من العفن باستخدام الملقط.
5. لكمة ثقب مدخل واحد مع خزعة 1 مم لكمة في أي مكان على متناهية، ويفضل أن يكون في نهاية شبكة من microchannels كما رأينا في الشكل 2A و 4B.
6. تنظيف PDMS يلقي بشريط لاصق لإزالة جزيئات الغبار كثف على الجهاز. تعقيم الجهاز متناهية PDMS (PDMS الزهر) قبل الشطف بمحلول مكون من 70٪ من الإيثانول تليها منزوع الأيونات معقمة الماء (DI)، وفضح للأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة.
7. الحفاظ على جهاز PDMS العقيمة في طبق بتري معقمة حتى الاستخدام.

4. الركيزة الزخرفة

1. وضع PDMS العقيمة يلقي باستخدام الملقط على ساترة زجاجية معقمة أو طبق بتري وتطبيق ضغط لطيف باستخدام غيض من ملاقط.
   ملاحظة: يلقي PDMS يجعل امتثالي لكن ختم عكسها مع GLساترة الحمار أو طبق بتري تشكيل microchannels دون استخدام أية مواد لاصقة.
2. وضع قطرة (20 - 40 ميكرولتر) من الحل الركيزة على مدخل تغطي تماما ثقب مدخل. نمط بولي-D-ليسين (PDL) عن طريق وضع قطرات 20 ميكرولتر من PDL في المخزن بورات ثنائي الصوديوم على مدخل و microchannels.
3. وضع طبق بتري في فراغ من ~ 254 mmHgA (أي ما يعادل لإيواء فراغ في المختبرات البيولوجية) لمدة 10 دقيقة، ومراقبة الهواء يخرج من القناة على شكل فقاعات.
4. الافراج عن فراغ ومراقبة الحل الركيزة التي تصب في متناهية.
5. احتضان طبق في الظروف الملائمة لالتزام الركيزة. انظر الجدولين 1 و 2 للشروط الحضانة (وهذه تختلف تبعا الركيزة). لPDL الزخرفة، واحتضان لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية.
6. تقشر بعناية الطابع PDMS باستخدام الملقط معقمة وغسل نمط على ساترة الزجاج ثلاث مرات بالماء DI.
7. إضافة محلول 1٪ زلال المصل البقري (BSA) إلى طبق بتري لتغطية صحن أو الزجاج ساترة واحتضان ليلا 37 درجة مئوية.
   ملاحظة: هذا سوف يقلل التزام غير محددة في مناطق غير المصقول.
8. نضح قبالة حل جيش صرب البوسنة 1٪، والركيزة نمط هو الآن جاهزة للاستخدام.

5. الزخرفة غير المباشرة من الخلايا

1. إعداد تعليق خلية في مستنبت المصل خالية. يتم سرد نوع من الخلايا وكثافة الخلايا في الجدول 1.
2. إضافة تعليق الخلية إلى طبق بيتري منقوشة تماما وغمر المنطقة نقوش في تعليق خلية.
3. احتضان طبق بتري عند 37 درجة مئوية في حاضنة لمدة 15 دقيقة للسماح للخلايا لنعلق على الركيزة المزخرفة.
4. نضح تعليق الخلية الزائدة من طبق بيتري وغسل الخلايا نمط ثلاث مرات مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)، في حين تهز برفق لمدة 10 ثانية لإزالة الخلايا غير مرتبط.
5. إضافة لمستنبت ppropriate على ثقافات خلية نمط واحتضان خلايا نمط عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO _2.

6. الزخرفة المباشرة للخلايا

ملاحظة: هذه التقنية كبديل لتنميط الخلية غير المباشرة هو موضح في الخطوة 5. ومع ذلك، خلافا لما حدث في الخطوة 5، في هذه التقنية على نمط الخلايا على الأسطح زراعة الأنسجة مع أو بدون طلاء الركيزة.

1. تعقيم الجهاز ميكروفلويديك قبل الشطف بمحلول مكون من 70٪ من الإيثانول تليها مياه DI.
2. نقع الجهاز بين عشية وضحاها في حل من 1٪ BSA لمنع التصاق الخلية إلى PDMS.
3. تجفيف الجهاز في درجة حرارة الغرفة وضمها الى الجزء السفلي من طبق بتري تعامل ثقافة الأنسجة.
4. إعداد تعليق خلية في وسائل الإعلام ثقافة خالية من المصل. يتم سرد نوع من الخلايا وكثافة الخلايا في الجدول 2.
5. وضع قطرة (4-8 ميكرولتر) لتعليق الخلية، وهو ما يكفي لملءmicrochannels، على مدخل تغطي تماما ثقب مدخل.
6. وضع طبق بتري في فراغ لمدة 10 دقيقة ومراقبة الهواء يخرج من القناة على شكل فقاعات. الافراج عن فراغ ومراقبة تعليق الخلية التي تصب في متناهية.
7. احتضان طبق بتري في حاضنة لتعزيز التصاق الخلايا وفقا للشروط الحضانة (تعتمد على نوع من الخلايا نمط) المذكورة في الجدول 2. إضافة برنامج تلفزيوني على طبق بتري غمر الجهاز PDMS.
8. قشر PDMS بعناية قبالة طبق بتري مع ملاقط وغسل النمط مع برنامج تلفزيوني. إضافة وسائط الثقافة الخلية إلى طبق بتري ومكان زراعة الخلايا في الحاضنة.

النتائج

وتسمح هذه الطريقة في الزخرفة من البروتينات والزخرفة غير المباشرة من الخلايا باستخدام مسدود قنوات ميكروفلويديك مع أبعاد صغيرة مثل 10 ميكرون والتجهيزات المتوفرة في معظم المختبرات البيولوجية بمجرد اعتماد القالب الرئيسي. ويمكن استخدام هذه التقنية مع ...

Discussion

في حين ضوئيه التقليدية هي تقنية راسخة لإنشاء قوالب للالطباعة الحجرية الناعمة والمعدات والمواد والمهارات اللازمة لاستخدام ضوئيه التقليدية ليست متاحة بسهولة في معظم المختبرات. للمختبرات دون الوصول إلى هذه الموارد، قدمنا ​​لاصقة تلفيق الشريط كوسيلة لخلق قوالب مع م?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CorelDRAW X4 CAD Drawing Tools	Corel Corporation, Canada	X4 Version 14.0.0.701	CAD tool used to draw the layout of the microfluidic device
Laser Printer HP	Hewlett Packard, CA	1739629	Used to print the layout of microfluidic device for adhesive tape technique
Bel-Art Dessicator	Fisher Scientific, MA	08-594-16B	Used to degass the PDMS mixture
Adhesive Scotch Tape	3M Product, MN	Tape 600	Used to fabricate adhesive tape Master
PDMS Sylgard 184	Dow Corning, MI	1064291	Casting polymer
Petri Dish	Fisher Scientific, MA	08-772-23	Used to keep the mold to cast with PDMS
Stainless steel Scalpel (#3) with blade (# 11)	Feather Safety Razor Co. Ltd. Japan	2976#11	Used to cut the PDMS
Tweezers	Ted Pella, CA	5627-07	Used to handle the PDMS cast during peeling
Glass slides	Fisher Scientific, MA	12-546-2	Used as surface to pattern the Substrate
Glass slides	Fisher Scientific, MA	12-544-4	Used as surface to pattern the Substrate
Rubber Roller	Dick Blick Art Materials, IL	40104-1004	Used to attach adhesive tape on glass without trapping air bubbles
Laser Mask Writer	Heidelberg Instruments, Germany	DWL66fs	Used to fabricate quartz mask used in photolithography fabrication process
EVG Mask Aligner (Photolithography UV exposure tool)	EV Group, Germany	EVG 620T(B)	Used to expose the photoresist to UV light
Spin Coater Headway	Headway Research Inc, TX	PWM32-PS-CB15PL	Used to spin coat the photoresist on silicon wafer
Photoresists SU-8 50	MicroChem, MA	Y131269	Negative photoresist used for mold fabrication
SU-8 Devloper	MicroChem, MA	Y020100	Photoresist developer
Tridecafluoro-1,1,2,2-Tetrahydrooctyl-1-Trichlorosilane	UCT Specialties, PA	T2492-KG	Coat mold to avoid PDMS adhesion
Isopropanol	Sigma-Aldrich, MO	190764	Cleaning Solvent
Ethanol	Sigma-Aldrich, MO	24102	Sterilization Solvent
Poly-D-Lysine hydrobromide (PDL)	Sigma-Aldrich, MO	P0899-10MG	PDL solution is made at 0.1 mg/mL in Sodium Tetraborate Buffer
Laminin	Sigma-Aldrich, MO	L2020	Laminin aliquoted into 10 µL aliquots and diluted to 20 µg/µL in PBS prior to use
BSA	Fisher Scientific, MA	BP1605100	Cell culture
C2C12 Myoblast cell lline	ATCC, VA	CRL-1722	Used to demonstrate C2C12 patterning
PC12 Cell Line	ATCC, VA	CRL-1721	Used to demonstrate PC12 patterning
Collagen type 1, rat tail	BD Biosciences	40236	Cell culture
DMEM	GIBCO, MA	11965-084	Cell culture
Horse Serum, heat inactivated	Fisher Scientific, MA	26050-070	Cell culture
Phalloidin-tetramethylrhodamine B isothiocyanate (TRITC)	Sigma-Aldrich, MO	P1951	To label cells
Calcein-AM live dead cell Assay kit	Invitrogen, MA	L-3224	Cell viability Assay
Biopsy Hole Punch	Ted Pella, CA	15110-10	Punched hole in PDMS