Универсальный метод паттернирования белки и клетки

Резюме

This report describes a simple, easy to perform technique, using low pressure vacuum, to fill microfluidic channels with cells and substrates for biological research.

Аннотация

Substrate and cell patterning techniques are widely used in cell biology to study cell-to-cell and cell-to-substrate interactions. Conventional patterning techniques work well only with simple shapes, small areas and selected bio-materials. This article describes a method to distribute cell suspensions as well as substrate solutions into complex, long, closed (dead-end) polydimethylsiloxane (PDMS) microchannels using negative pressure. This method enables researchers to pattern multiple substrates including fibronectin, collagen, antibodies (Sal-1), poly-D-lysine (PDL), and laminin. Patterning of substrates allows one to indirectly pattern a variety of cells. We have tested C2C12 myoblasts, the PC12 neuronal cell line, embryonic rat cortical neurons, and amphibian retinal neurons. In addition, we demonstrate that this technique can directly pattern fibroblasts in microfluidic channels via brief application of a low vacuum on cell suspensions. The low vacuum does not significantly decrease cell viability as shown by cell viability assays. Modifications are discussed for application of the method to different cell and substrate types. This technique allows researchers to pattern cells and proteins in specific patterns without the need for exotic materials or equipment and can be done in any laboratory with a vacuum.

Введение

В тканевой инженерии и биодатчиков, способность контролировать пространственную организацию белков и клеток по шкале мкм, приобретает все большее значение в течение последних четырех десятилетий ^{1, 2, 3.} Точная пространственная организация белков и клеток позволило исследователям изучить взаимодействие между клетками и субстратов , содержащих аналогичные или различные типы клеток, чтобы направлять рост клеток, а также для иммобилизации биомолекул для изготовления биосенсоров ^{4, 5, 6, 7, 8, 9.}

Современные методы формирования паттерна белков включают photopatterning и микроконтактной печати. Photopatterning использует светочувствительный материал, который сшивается при воздействии Ultrфиолетовый (УФ) излучения. УФ - свет направлен на фотошаблон (состоящей из прозрачных областей с темными областями для предотвращения передачи УФ - света) вызывает сшиванием в определенных областях , которые затем могут быть использованы для последующего прикрепления биоматериалов или клеток ^{10, 11.} В то время как эта схема является очень точным и позволяет точно контролировать топографии поверхности культуры, она ограничена УФ-чувствительных биомолекул , которые могут быть составлены по образцу с помощью УФ - излучения ^12. Микроконтактной печати является еще одним популярным методом структурирование специфических белков ^{13, 14.} В этом способе, поли-диметил силоксан (PDMS) марка обрабатывают различными модификации поверхности реагентов до того, замачивают в растворе выбранного биомолекул субстрата. Затем аккуратно прижимают покровным стеклом или другой поверхности, таким образом, "штампования" биомолекулу на поверхность культуры. эйВеверу, штамповку ограничивается типом материала , который может быть передан, а также смачиваемость биомолекул на поверхности ПДМС штамп ^15.

Прямое структурирование клеток может быть более сложным и опирается на сложные методы , такие как переключаемые подложек, трафаретов на основе методов или кучность с определенными молекулами клеточной адгезии , ^{16, 17.} Эти методы ограничены в их способности шаблон клеток из-за отсутствия совместимых субстратов клеточной адгезии, Несовместимость процессе работы с чувствительными биологическими клетками и ограничениями, несогласованности в воспроизведении формирования рисунка и сложности процедуры. Например, с переключаемыми субстраты, изготовленные на заказ субстраты , должны быть разработаны для каждого типа клеток, чтобы переключить их присоединение к конкретным типам клеток без деградации под воздействием УФ - света и тепла , используемых в процессе ¹⁷ < вир класс = "Xref"> ^{18, 19, 20.} Методы, основанные паттерна Трафарет являются универсальными в их способности к модели клеток; Тем не менее, трудно изготовить PDMS трафареты при соответствующих толщинах для использования ^{16, 21.} Прямая инъекция клеток в PDMS микроканалов имеют ряд преимуществ, таких как: 1) легкость в изготовлении микроканалов и 2) пригодность для многих различных клеток и субстратов. Тем не менее, распространенной проблемой захвата пузырьков воздуха в процессе инъекции из - за гидрофобности PDMS без использования плазменной очистки, или другие методы , чтобы уменьшить пузырьков воздуха, затрудняет последовательно создавать узорчатые клетки на стеклянных или пластмассовых поверхностей ^21.

Эта работа расширяет капиллярного micromolding ^{22, 23,}деваха = "Xref"> ^{24, 25, 26} и передает метод впрыснуть белка и клеточные суспензии в микроканалов. Метод, используемый здесь, демонстрирует кучность субстратов и как прямую, так и косвенную структурирование специфических типов клеток. Этот метод позволяет преодолеть высокую гидрофобность PDMS и исключает наличие пузырьков во время инъекции либо субстраты или клетки, воспользовавшись газопроницаемости ПДМС ^27. В этом документе показано использование метода с несколькими различными субстратами и типов клеток. В статье также подчеркивается , изготовление пресс - форм для мягкой литографии с использованием обычного фотолитографии, а также простой и клейкую недорогой метод ленты полезный в условиях ограниченных ресурсов ^{28, 29.}

протокол

Примечание: Пожалуйста, обратитесь все соответствующие паспорта безопасности материала (MSDS) перед использованием. Некоторые из химических веществ, используемых в данном протоколе являются токсичными и канцерогенными свойствами. Пожалуйста, используйте все надлежащие практики в области безопасности (вытяжной шкаф, перчаточный ящик) и средства индивидуальной защиты (защитные очки, перчатки, лабораторный халат, полные штаны длина, закрытые носок обуви) при использовании токсичных или кислоты / базовых материалов.

1. Изготовление пресс-форм для Master Soft Литография с использованием фотолитографии

1. Нарисуйте расположение микроканала с помощью системы автоматизированного проектирования (САПР) инструмент для рисования.
2. Печать макета на пустой маски пластины с использованием лазерной маски писателя.
3. Полоскание 4 дюйма кремниевой пластины с ацетоном с последующим изопропанола и сушат с воздушным пистолетом азота, чтобы гарантировать, что растворитель не остается на пластине.
4. Обезвоживают вафлю обжигом его на горячей плите при 200 ° С в течение 5 мин.
5. Выберите негативного фоторезиста, предназначенный для желаемой высоты микроканалов. Fили пример, использование негативного фоторезиста SU-8, чтобы получить 50 микроканалов высотой 50 мкм.
6. Дайте вафля остыть до комнатной температуры, а затем выровнять пластину на патроне спина для нанесения покрытий.
7. Разлить по 4 мл (1 мл / дюйм диаметра пластины) от негативного фоторезиста на центр пластины.
8. Спин пальто пластины с отжимом двухступенчатой ​​использованием вертушку. Во-первых, применить спред цикл 500 оборотов в минуту с ускорением 100 оборотов в минуту / с в течение 10 с. Затем применить цикл отжима в 2000 оборотов в минуту с ускорением 300 оборотов в минуту / с ² в течение 30 с , чтобы получить 50 мкм покрытие из фоторезиста с на пластине.
9. Мягкая выпекать пластина в два этапа на горячей плите в соответствии с инструкциями изготовителя. Для получения 50 мкм покрытия фоторезиста в, сначала предварительно испечь пластины при 65 ° С в течение 6 мин, а затем сразу же сползать температуры горячей пластины пост-испечь пластины при 95 ° С в течение 20 мин.
10. Дайте вафля остыть до комнатной температуры, а затем загрузитьполупроводниковой пластине на сцену литографии.
11. Совместите маску на пластине с помощью маски Aligner и разоблачить пластины УФ - излучения (в соответствии с инструкциями изготовителя) при интенсивности 1,5 мВт / см ² для 146 с , чтобы применить общую УФ дозу 220 мДж / см ² требуется для 50 мкм слой фоторезиста.
12. Применить пост выпекать экспозиции пластины в два этапа на горячей плите. Для 50-мкм покрытия фоторезиста в первую предварительно выпекать пластины при температуре 65 ° С в течение 1 мин и сразу же наращиваем температуры горячей пластины пост-выпекать при температуре 95 ° С в течение 5 мин.
13. Разработка пластины в окунанием пластины в СУ-8 разработчик и осторожно встряхивая до тех пор, пока функции станет ясно на пластине. Разработка пластины для ~ 6 мин для толстой фоторезиста 50 мкм.
14. Смойте излишки проявителя с изопропанола и этанола, а затем высушить пластины с воздуха азотом пушки.
15. Жесткий выпекать кремниевой пластины на горячей плите при 150 ° С в течение 15 мин.
16. Поместитевафельные в эксикаторе с 25 мкл silanizing агента tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl-1-трихлорсилана.
    Примечание: silanizing агент является едким веществом, таким образом, должен быть использован в кислотной / щелочной вытяжкой, с соответствующими средствами индивидуальной защиты (защитные очки, перчатки, лабораторный халат, полные штаны длины, закрытые носок обуви).
17. Применение вакуума в течение 5 мин и подвергать облатку к парам силана в течение 30 мин, не отпуская вакуума.
18. Перенос пластины в подходящего размера чашки Петри.

2. Изготовление пресс-форм для Master Soft Литография с помощью клейкой ленты

1. Нарисуйте расположение микроканала, используя инструмент для рисования САПР и напечатать рисунок на белой бумаге.
2. Очистите стеклянный слайд, достаточно большой, чтобы приспособить конструкцию с изопропилового спирта, а затем высушить слайд с воздушным пистолетом.
3. Прикрепите клейкую ленту на очищенную стекло. Будьте осторожны, чтобы не поймать пузырьки воздуха.
4. Заклеивайте стороны GLAсс скользят на бумагу с дизайном, с лентой стороной вверх.
5. Используйте скальпель, чтобы разрезать ленту на предметном стекле с использованием дизайнерской бумаги в качестве эталона, а затем отделите ленту от нежелательных областей стекло.
6. Промыть стекло с изопропанолом и затем сушат с воздушным пистолетом. Выпекать предметное стекло в печи при температуре 65 ° С в течение 30 мин.
7. Аккуратно пролонгировать ленту с помощью резинового валика для удаления пузырьков воздуха и позволить ползун, чтобы охладить до комнатной температуры.

3. Мягкая литография Изготовление из PDMS устройств

1. Смешайте PDMS эластомер и его отвердитель в соотношении 10: 1 (вес: вес), и смесь перемешивали энергично, и затем дегазировать смесь, поместив ее в вакуумную камеру, пока пузырьки воздуха не появляются в смеси.
2. Смесь вылить в силанизированного формы кремния или клейкой ленты формы в чашке Петри, чтобы получить ~ 2 мм толщиной слоя PDMS и Дега, пока все пузырьки воздуха исчезают.
3. Вылечить PDMS в печипри 65 ° С в течение 2 ч.
4. Используйте скальпель, чтобы разрезать слой PDMS по меньшей мере, 5 мм от особенностей, а затем очистить отвержденных PDMS прочь пресс-формы, используя пинцет.
5. Удар одно входное отверстие с биопсией 1 мм удар в любом месте на микроканалов, предпочтительно в конце сети микроканалов , как показано на рисунке 2а и 4b.
6. Очистить PDMS литье с помощью клейкой ленты, чтобы удалить частицы пыли, адсорбированные на устройство. Стерилизация Микроканал устройство PDMS (PDMS CAST) путем промывки раствором 70% -ного этанола с последующей стерильной деионизированной (ДИ) воды и подвергать воздействию УФ в течение 30 мин.
7. Хранить стерильную PDMS устройство в стерильную чашку Петри до использования.

4. Подложка Образцу

1. Поместите стерильные PDMS отлитые с помощью пинцета на стерильную стеклянную покровного или чашку Петри и применить мягкое давление, используя кончик пинцетом.
   ПРИМЕЧАНИЕ: PDMS литая делает конформное но обратимое уплотнение с ГЛпопка покровное или чашку Петри формирования микроканалов без использования какого-либо клея.
2. Поместите капельку (20 - 40 мкл) раствора субстрата на входе полностью закрывающей входное отверстие. Шаблон поли-D-лизином (PDL), путем размещения 20 мкл капельку PDL а в буфере тетраборат натрия на входе в микроканалов.
3. Поместите чашку Петри в вакууме ~ 254 mmHgA (эквивалент для размещения вакуума в биологических лабораториях) в течение 10 мин, и наблюдать воздух, поступающий из канала в виде пузырьков.
4. Отпустите вакуума и наблюдать раствор субстрата, протекающей в микроканале.
5. Выдержите блюдо в соответствующих условиях для присоединения субстрата. Приведены в таблицах 1 и 2 для условий инкубации (они варьируются в зависимости от подложки). Для PDL кучность, инкубировать в течение 1 ч при 37 ° С.
6. Аккуратно снимите штамп PDMS с помощью стерильных пинцетов и промойте рисунок на стекло покровное трижды дистиллированной водой.
7. Добавить раствор 1% бычьего сывороточного альбумина (БСА) в чашке Петри, чтобы покрыть блюдо или покровного стекла и инкубировать в течение ночи при 37 ° С.
   Примечание: Это приведет к снижению неспецифической соблюдения в непокрытых регионах.
8. Аспирируйте от 1% раствора БСА и узорной субстрат теперь готов к использованию.

5. Косвенное структурирование клеток

1. Приготовьте суспензию клеток в культуральной среде, не содержащей сыворотки. Типа клеток и плотность клеток приведены в таблице 1.
2. Добавить клеточной суспензии в узорной Петри и полностью погрузить в воду узорчатую область в клеточной суспензии.
3. Инкубируйте чашки Петри при температуре 37 ° С в термостате в течение 15 мин, чтобы позволить клеткам прикрепляться к узорной подложки.
4. Аспирируйте избыток суспензии клеток от чашки Петри и мыть узорчатых клеткам трижды фосфатно-солевым буфером (PBS) при осторожном встряхивании в течение 10 с для удаления неприкрепленные клетки.
5. Добавьте Appropriate культуральная среда для узорчатых культур клеток и инкубировать узорчатую клеток при 37 ° С в СО ₂ инкубаторе.

6. Прямой структурирование клеток

Примечание: Этот метод является альтернативой косвенном кучность клеток, описанной в пункте 5. Однако, в отличие на этапе 5, в этой технике клетки узорной на поверхности для культивирования тканей с или без покрытия подложки.

1. Стерилизация микрожидкостных устройств путем промывки раствором 70% этанола с последующим ДИ воды.
2. Замачивание устройство в течение ночи в растворе 1% бычьего сывороточного альбумина, чтобы предотвратить адгезию клеток к PDMS.
3. Высушить устройство при комнатной температуре и прикрепить ее к нижней части культуры ткани, обработанной чашке Петри.
4. Приготовьте суспензию клеток в бессывороточной культуральной среде. Типа клеток и плотность клеток приведены в таблице 2.
5. Поместите капельку (4 - 8 мкл) клеточной суспензии, достаточно, чтобы заполнитьмикроканалов, на входе полностью закрывающей входное отверстие.
6. Поместите чашку Петри в вакууме в течение 10 мин и наблюдать воздух, поступающий из канала в виде пузырьков. Отпустите вакуума и наблюдать клеточную суспензию, протекающей в микроканале.
7. Выдержите чашку Петри в инкубаторе , чтобы способствовать адгезии клеток на условиях инкубации ( в зависимости от типа клетки узорной) , указанным в таблице 2. Добавить PBS в чашке Петри погружая устройство PDMS.
8. Пил PDMS тщательно от чашки Петри с помощью пинцета и мыть шаблон с PBS. Добавить среды для культивирования клеток на чашку Петри и помещают культуры клеток в инкубаторе.

Результаты

Этот метод позволяет кучность белков и непрямого паттернировании клеток с использованием тупиковых микроканалов с размерами размером до 10 мкм и оборудованием практически во всех биологических лабораториях после того, как мастер-форма изготовлена. Этот метод может ?...

Обсуждение

В то время как обычные фотолитографии является хорошо отработанной технологией для создания пресс-форм для мягкой литографии, оборудования, материалов и навыков, необходимых для использования обычного фотолитографии не легко доступны для большинства лабораторий. Для лабораторий, не...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
CorelDRAW X4 CAD Drawing Tools	Corel Corporation, Canada	X4 Version 14.0.0.701	CAD tool used to draw the layout of the microfluidic device
Laser Printer HP	Hewlett Packard, CA	1739629	Used to print the layout of microfluidic device for adhesive tape technique
Bel-Art Dessicator	Fisher Scientific, MA	08-594-16B	Used to degass the PDMS mixture
Adhesive Scotch Tape	3M Product, MN	Tape 600	Used to fabricate adhesive tape Master
PDMS Sylgard 184	Dow Corning, MI	1064291	Casting polymer
Petri Dish	Fisher Scientific, MA	08-772-23	Used to keep the mold to cast with PDMS
Stainless steel Scalpel (#3) with blade (# 11)	Feather Safety Razor Co. Ltd. Japan	2976#11	Used to cut the PDMS
Tweezers	Ted Pella, CA	5627-07	Used to handle the PDMS cast during peeling
Glass slides	Fisher Scientific, MA	12-546-2	Used as surface to pattern the Substrate
Glass slides	Fisher Scientific, MA	12-544-4	Used as surface to pattern the Substrate
Rubber Roller	Dick Blick Art Materials, IL	40104-1004	Used to attach adhesive tape on glass without trapping air bubbles
Laser Mask Writer	Heidelberg Instruments, Germany	DWL66fs	Used to fabricate quartz mask used in photolithography fabrication process
EVG Mask Aligner (Photolithography UV exposure tool)	EV Group, Germany	EVG 620T(B)	Used to expose the photoresist to UV light
Spin Coater Headway	Headway Research Inc, TX	PWM32-PS-CB15PL	Used to spin coat the photoresist on silicon wafer
Photoresists SU-8 50	MicroChem, MA	Y131269	Negative photoresist used for mold fabrication
SU-8 Devloper	MicroChem, MA	Y020100	Photoresist developer
Tridecafluoro-1,1,2,2-Tetrahydrooctyl-1-Trichlorosilane	UCT Specialties, PA	T2492-KG	Coat mold to avoid PDMS adhesion
Isopropanol	Sigma-Aldrich, MO	190764	Cleaning Solvent
Ethanol	Sigma-Aldrich, MO	24102	Sterilization Solvent
Poly-D-Lysine hydrobromide (PDL)	Sigma-Aldrich, MO	P0899-10MG	PDL solution is made at 0.1 mg/mL in Sodium Tetraborate Buffer
Laminin	Sigma-Aldrich, MO	L2020	Laminin aliquoted into 10 µL aliquots and diluted to 20 µg/µL in PBS prior to use
BSA	Fisher Scientific, MA	BP1605100	Cell culture
C2C12 Myoblast cell lline	ATCC, VA	CRL-1722	Used to demonstrate C2C12 patterning
PC12 Cell Line	ATCC, VA	CRL-1721	Used to demonstrate PC12 patterning
Collagen type 1, rat tail	BD Biosciences	40236	Cell culture
DMEM	GIBCO, MA	11965-084	Cell culture
Horse Serum, heat inactivated	Fisher Scientific, MA	26050-070	Cell culture
Phalloidin-tetramethylrhodamine B isothiocyanate (TRITC)	Sigma-Aldrich, MO	P1951	To label cells
Calcein-AM live dead cell Assay kit	Invitrogen, MA	L-3224	Cell viability Assay
Biopsy Hole Punch	Ted Pella, CA	15110-10	Punched hole in PDMS